全 文 ：林业科学研究　2007, 20 (2) : 230～234
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2007) 0220230205
EST2CAPS标记在尾叶桉和细叶桉
遗传图谱构建中的应用 3
张照远 1, 2 , 甘四明 13 3 , 李发根 1 , 李　梅 1 , 翁启杰 1 , 胡哲森 2
(1. 中国林业科学研究院热带林业研究所 ,广东 广州　510520; 2. 福建农林大学林学院 ,福建 福州　350002)
摘要 :以已构建的尾叶桉和细叶桉 RAPD连锁图谱为基础 ,利用 CAPS技术对 54个细叶桉 EST序列在尾叶桉和细
叶桉遗传图谱上的定位研究表明 : 7个 EST序列在作图群体中呈等位片段多态性 ,包括母本尾叶桉特有的 3个 (其
中 1个偏分离 )、父本细叶桉特有的 2个和父母本共有的 2个 ;共有 4个 EST2CAPS标记整合到尾叶桉 RAPD连锁图
谱 ,分散于不同的连锁群 ,各连锁群大小均有小幅增加 ;细叶桉 RAPD连锁图谱上也整合了 4个 EST2CAPS标记 ,分
散于不同的连锁群 ,各连锁群大小均有不同程度的增加 ;另外 ,尾叶桉上的 1个偏分离标记未整合到任何连锁群。
EST2CAPS可以有效用于桉属树种遗传图谱构建。
关键词 : EST2CAPS;尾叶桉 ;细叶桉 ;遗传图谱
中图分类号 : S792. 39 文献标识码 : A
收稿日期 : 2005211207
基金项目 : 国家自然科学基金 (30371173)、863计划项目 (2006AA100109)和教育部“留学回国人员科研启动基金”
作者简介 : 张照远 (1980—) ,男 ,河南信阳人 ,硕士研究生 ,研究方向为森林培育学.3 中国林业科学研究院热带林业研究所吴坤明和吴菊英副研究员对杂交和育苗、杨华博士对 DNA提取以及广东省新会市大泽镇林业
站对实验材料保存提供了大力协助 ,谨致谢忱 !3 3 通讯作者 ,博士 ,副研究员 ,主要从事林木育种与分子遗传研究 ; Email: smggan@pub. guangzhou. gd. cn
Applica tion of EST2CAPS M arkers to Genetic M app ing in
Euca lyptus u rophylla and Euca lyptus te re ticorn is
ZHANG Zhao2yuan1, 2 , GAN S i2m ing1 , L I Fa2gen1 , L I M ei1 , W ENG Q i2jie1 , HU Zhe2sen2
(1. Research Institute of Trop ical Forestry, CAF, Guangzhou　510520, Guangdong, China;
2. Forestry Faculty, Fujian University of Agriculture and Forestry, Fuzhou　350002, Fujian, China)
Abstract: Seven EST2CAPS markers were identified from 54 candidate ESTs for genetic mapp ing with an F1 popula2
tion of Euca lyptus urophylla ×E. tereticorn is, including three specific in female parent (one being aberrant from nor2
mal segregation among the sibs) , two specific in male parent, and two shared by both parents. Four EST2CAPS
markers were integrated to independent linkage group s on the RAPD linkage map of E. urophylla constructed p revi2
ously, which contributed to some degrees to the extension of linkage group length. A lso, four EST2CAPSs were
mapped to different linkage group s on the RAPD linkage map of E. tereticorn is, which gave rise to the increase of
linkage group length. In addition, the aberrantmarker was found to be unlinked to any linkage group in E. urophyl2
la. This study demonstrated the usefulness of EST2CAPS markers in genetic mapp ing in Euca lyptus.
Key words: EST2CAPS; Euca lyptus urophylla; Euca lyptus tereticorn is; genetic map
桃金娘科 (Myrtaceae ) 桉树属 ( Euca lyptus L ’
Hérit. )树种具有轮伐期短、速生和丰产等优点 ,是优
良的纸浆和纤维板工业原料 ,在全球热带和亚热带
地区是重要的工业原料林树种 [ 1 ]。尾叶桉 ( E. u ro2
第 2期 张照远等 : EST2CAPS标记在尾叶桉和细叶桉遗传图谱构建中的应用
phy lla S. T. B lake)和细叶桉 ( E. tereticorn is Sm ith)
是较为重要的 2个桉属树种 ,种间杂交的杂种优势
显著 [ 2 ] ,并且尾叶桉及其杂种的世代周期较短 ,一般
2年生时即可开花 ,因此 ,两树种是林木遗传和育种
研究的优良材料 [ 3～5 ]。
近年来 ,遗传图谱构建是林木分子生物学研究
的热点。桉属中 ,已进行遗传图谱构建的树种包括
巨桉 ( E. grand is W. H ill ex Maid. ) [ 6～8 ]、亮果桉 ( E.
n itens (Deane &Maid. ) Maid. ) [ 9 ]、蓝桉 ( E. g lobu lus
Labill. ) [ 10～12 ]、尾叶桉 [ 6～8, 13 ]、细叶桉 [ 10, 13 ] 和赤桉
( E. cam aldu lensis Dehnh. ) [ 14 ]。虽然 ,桉树遗传图
谱构建已取得较大的进展 ,但仍存在标记类型偏少、
共显性标记不多、图谱密度不高等问题 ,因此 ,如何
开发更多、更有效的标记是桉树遗传图谱构建中急
需解决的问题。
切割扩增多态性序列 ( cleaved amp lified poly2
morphic sequences, CAPS)也称 PCR2RFLP,其利用基
因组片段在酶切位点上的碱基变异 ,对该片段的
PCR产物进行限制性内切酶酶切从而产生等位片段
(或等位基因 )的多态性 ,具有简便、可靠、共显性的
特点 [ 15, 16 ]。基于表达序列标签 ( Exp ressed sequence
tags, EST)的 EST2CAPS可对具有基因功能的 EST
片段进行分析 ,已在日本柳杉 (C ryptom eria japon ica
(L. f. ) D. Don. ) [ 17, 18 ]、火 炬 松 ( P inus taeda
L. ) [ 19 ]、云杉 ( P icea abies (L. ) Karst. ) [ 20 ]等树种的
遗传图谱中广泛应用 ;但是 ,目前国内还没有利用
EST2CAPS标记进行林木遗传图谱构建 ,国外也没有
用于桉树遗传图谱构建的报道。本研究以前期构建
的尾叶桉和细叶桉 RAPD标记连锁图谱 [ 13 ]为基础 ,
增加 EST2CAPS标记 ,探讨 EST2CAPS标记在桉属遗
传图谱构建中的应用潜力。
1　材料和方法
1. 1　材料
作图群体包括尾叶桉 (母本 , 0030 )和细叶桉
(父本 , 4305)及其杂交产生的 54个 F1子代。该作
图群体原为 82个子代 [ 13 ] ,由于材料保存过程中部
分个体死亡 ,仅保留 54个子代。
备选细叶桉 54 个 EST序列下载自 Genebank
( http: / /www. ncbi. nlm. nih. gov /dbEST/ index. ht2
m l)。引物合成由上海生工公司完成。备选 30种限
制性内切酶购自上海生工 ( 16种 )和北京鼎国公司
(14种 )。
1. 2　D NA提取、PCR扩增和 CAPS反应
DNA 提取采用 CTAB 法 [ 21 ] , 同时参照 Gan
等 [ 13 ]适当改良。
PCR采用 10μL的反应体系 ,包括 : 10 ×B uff2
er 1. 0 μL ( 100 mmol ·L - 1 Tris2HC l ( pH 值
9. 0 ) ; 100 mmol·L - 1 KC l; 0. 5 % N P - 40; 80
mmol·L - 1 ( NH4 ) 2 SO4 ; 25 mmol·L - 1 M gSO4 ) ,
0. 2 mmol·L - 1 dN TPs, 前、后 向 引 物 各 0. 05
μmol·L - 1 , DNA模板 2 ng, Taq DNA聚合酶 1 U ,
双蒸水补充至 10μL。 PCR反应程序 : 94 ℃预变
性 4 m in; 94 ℃变性 30 s, 56 ℃或 60 ℃退火 30 s,
72 ℃延伸 1 m in,进行 35个循环 ;最后 72 ℃延伸
10 m in。 PCR 扩 增 仪 为 GeneAmp PCR System
2700 (App lied B iosystem s Co. ) 。
CAPS酶切反应体系为 10μL,包括 :相应限制性内
切酶的 10 ×Buffer 1. 0μL,酶 5 U, PCR产物 5. 0μL。
37 ℃恒温 4 h。酶切产物在含有溴化乙锭 (0. 5μg·
mL - 1 )的 2. 5%琼脂糖凝胶上电泳分离 ,电泳缓冲液为
0. 5 ×TBE。电泳结果利用 Photoprint 215SD成象系统
(法国 Vilber Lourmat Co. )存盘并打印记录。
1. 3　位点统计
酶切谱带用“1”表示存在 ,“0”表示不存在 ,对
两亲本和子代进行 CAPS位点统计。标记名称按
“EST2‘EST名称 ’”记录。统计数据与 Gan等 [ 13 ]作
图的相应亲本的 RAPD标记的谱带数据进行整合 ,
缺失个体数据用“2”表示。
1. 4　连锁分析
连锁分析利用软件 Mapmaker/EXP 3. 0[ 22 ] 进
行。首先 ,用“Group”命令进行分群 ,参数设置参考
文献 [ 13 ];再利用“Try”命令确定各连锁群内 EST2
CAPS标记的图谱位置 ,或者利用“Compare”命令对
新的连锁群进行标记排序。图谱绘制利用 Mapchart
2. 1[ 23 ]完成。
2　结果与分析
2. 1　PCR扩增和 CAPS酶切
备选 54对 EST引物中 ,有 35对 (64. 8% )能在
1个或 2个亲本中扩增出一条清晰的谱带 ,谱带大
小均不同程度地大于原 EST序列中引物包含的序列
长度 (详细结果未列出 )。通过引物 2酶筛选 , 30种
限制性内切酶中 ,有 7种能分别对 7个 EST的 PCR
产物进行酶切并在亲本和子代中产生等位片段的多
态性 (表 1) ,即产生 7个多态性位点 ,其中 ,母本尾
132
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 20卷
叶桉特有 3个 (其中 EST2CD668433偏分离 ) ,父本 细叶桉 2个 ,父母本共有位点 2个。
表 1　引物和限制性内切酶组合
标记名称 前向引物 (5’—3’) 后向引物 (5’—3’) 退火温度 /℃ 限制性内切酶
EST2CD669233 CAACAGGAATAACCAGAAGC TGGGTGTTACTTGATCGGCA 56 AhaIII
EST2CD668837 ATGATGCACAAGCGTATGGT CTCACAGATCCGCTTAATG 56 B suR I
EST2CD668835 GAAACCGCTGTCATGGAAGT TTCCCCGTTTTCATCAGG 56 M sp I
EST2CD668823 AGATTGGATTGCTGCTTGCT GGAAGAGCTGACCTAATAG 56 Eco72 I
EST2CD668634 TCAGAGAGTCAGACAAGGAAAC ACCATCCTCACCTCCACTTG 60 Pvu II
EST2CD668626 CTCAACCCAAACAAGCAG GACCCCAACGCTCTTCATGA 56 Mva I
EST2CD668433 GCGTTGAAGGGCAAGAGTG AGCCCCCCTCACAAGTTCT 60 EcoR130 I
2. 2　EST2CAPS标记的图谱定位
母本尾叶桉的 5个 EST2CAPS标记中 ,有 3个分
别整合到 Gan等 [ 13 ]构建的尾叶桉 RAPD遗传图谱
的连锁群 1、11和 15中 (图 1) ,均为正态分离标记 ;
有 1个 ( EST2CD668626)与 3个偏分离的 RAPD标
记连锁 ,虽然 Gan等 [ 13 ]未把偏分离的标记用于框架
图构建 ,但考虑到此标记为父母本共有 ,在此仍列出
作为一个新的连锁群 ,即连锁群 24 (图 1) ,连锁群
长度为 19. 1 cM;另外 1个 ( EST2CD668433,偏分离 )
未定位到图谱上。EST2CAPS标记整合后的新图谱
中 ,各连锁群长度均有小幅增加 ,如第 1、11、15连锁
群分别从 151. 3、62. 7、42. 1 cM增长到 166. 4、63. 5、
47. 8 cM ,标记间的平均间距也由原来的 15. 1、10. 5、
8. 4 cM分别改变成 15. 1、9. 1、8. 0 cM。
图 1　整合 EST2CAPS标记的尾叶桉连锁群
　　父本细叶桉的 4个 EST2CAPS标记均整合到
Gan等 [ 13 ]构建的细叶桉 RAPD遗传图谱中 ,分别位
于连锁群 6、7、8、10上 (图 2)。整合后的图谱连锁
群数量不变 ,仍为 23个。EST2CAPS标记整合后的
新图谱中 ,各连锁群长度均有不同程度的增加 ,第
6、7、8、10连锁群分别从 71. 9、43. 8、36. 7、30. 4 cM
增长到 94. 4、85. 8、39. 9、50. 5 cM ,标记间平均图距
也由 10. 3、21. 9、9. 2、10. 1 cM 分别改变为 11. 8、
28. 6、8. 0、12. 6 cM。值得注意的是 , 标记 EST2 CD668837和标记 EST2CD668823分别整合到第 7和第 10连锁群末端 ,连锁群长度分别增加了 42. 0 cM和 20. 1 cM ,这对提高遗传图谱对基因组的覆盖率具有显著意义。7个 EST2CAPS标记中 , EST2CD668837和 EST2CD668626为尾叶桉 (母本 )和细叶桉 (父本 )共有 ,比例较高 (28. 5% ) ,且都定位到两树种的遗传图谱上 ,表明 EST2CAPS在一定亲缘关系的树种间的比较基因组作图中具有较好的应用潜力。
232
第 2期 张照远等 : EST2CAPS标记在尾叶桉和细叶桉遗传图谱构建中的应用
图 2　整合 EST2CAPS标记的细叶桉连锁群
3　结论与讨论
(1) EST2CAPS标记可以有效用于桉属树种的
遗传图谱构建。作为一种共显性的分子标记技术 ,
CAPS具有操作简单、DNA模板需要量少、特异性扩
增基因编码区等优点 [ 15～17 ]。目前 ,桉属树种中已经
积累了丰富的 EST 数据 , EST 序列超过 20 万
条 [ 24, 25 ] , GeneBank中已有 6 000余条可以免费下载
( http: / /www. ncbi. nlm. nih. gov /dbEST/ index. ht2
m l) ,这为桉属树种 EST作图提供了丰富的资源。
因此 , EST2CAPS是桉属树种遗传图谱构建的有效
工具。
(2) EST2CAPS技术中引物 2酶的筛选工作量较
大 (尤其是 EST序列和备用酶的数量较多时 ) ,这主
要与 EST2CAPS的多态性较低有关。本研究中 , 54
对备选引物中只有 35对 (64. 8% )能在 1个或 2个
亲本中进行有效 PCR 扩增 ,其比例与火炬松类似
(14 /21, 66. 7% ) [ 26 ]。 PCR成功的 35对引物中 ,只
有 7对产生了 EST2CAPS多态性 ( 20% ) ,其比例与
日本柳杉天然群体类似 (20 /80, 25% ) [ 27 ] ,多态性较
低。EST2CAPS位点多态性较低 ,主要原因是 EST
序列在不同个体间和同一个体内不同等位基因间的
碱基变异不能产生限制性酶酶切位点 ;或者即使存
在酶切位点 ,也因为未使用适当的限制性内切酶而
漏检。因此 , EST作图中 , CAPS技术最好能与 SSCP
和 DGGE技术相结合 [ 19, 28 ] ,并且 ,当 EST来自基因
家系时 ,其 PCR产物酶切后很可能产生无法解释的
谱带类型 [ 19 ] ,这些都是 EST2CAPS标记实验中需要
注意的问题。
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