全 文 ：收稿日期: 20040428
作者简介: 贾秀贞( 1956 ) ,女,内蒙古包头人,实验师。
* 通讯作者.
林业科学研究 2004, 17( 5) : 630~ 635
Forest Research
文章编号: 10011498( 2004) 05063006
三种草坪草功能性细菌培养条件
及其生理学特性
贾秀贞, 丁明明, 王 媛, 梁 军*
(中国林业科学研究院森林生态与环境保护研究所,北京 100091)
摘要: 在实验室条件下分离筛选出了 3 种对草坪草抗逆及抗病性有积极作用的功能性细菌, 针对其培
养条件及生理学特性进行了研究。结果显示, 3 菌株利用最好的 N源是蛋白胨,牛肉浸膏次之; 利用
最好的 C 源是蔗糖, 其次为葡萄糖; 3 菌株在 pH 值为 6~ 10 的范围内均能生长, 其中菌株 E、F 在初始
pH 值为 74时生长最佳, 菌株H 在初始 pH 值为 76 时生长最佳; 最适合 3菌株生长的温度范围是 30
~ 35 ; 3菌株在不同摇床转速和装液量下有不同的生长反应,菌体干质量差异显著。
关键词: 草坪草;功能性细菌 ;培养条件; 生理学特性
中图分类号: S71883 文献标识码: A
草坪因其可以净化空气, 吸滞尘土,减缓太阳辐射,防止噪音,保持水土,调节环境小气候,
杀菌防病, 并有很强的观赏性和娱乐性而备受青睐。在城市建植草坪能减少尘埃 2/ 3, 草坪上
空的飘尘浓度约为无草裸地的 1/ 5[ 1, 2] ; 草坪通过光合作用保持空气中 CO2和 O2 的平衡, 据测
定25 m2的草坪便能把一个人呼出的 CO2全部还原为 O2[ 1] ;草地每天产生 O2 600 kg!hm- 2,吸
收CO2 900 kg!hm- 2[ 3] ;草坪能将大气中的NH3、H2S、SO2、Pb、Al等有害物质吸收截留, 起到净
化空气,减少污染的作用[ 4, 5] ;草坪还具有杀菌功能[ 6] ;草坪具有减少噪音的功能,有学者测定
草坪与石板路面相比,可减少噪声 10分贝[ 2] ;同时草坪绿地还可缓热降温,对周围环境有良好
的调节温度效应[ 7]。草坪在城市化建设中发挥着越来越重要的作用。
我国草坪业的发展在∀九五#期间也取得了长足的进步,据不完全统计, 到 1995年底全国
500个城市中共有草坪面积 6 000多万 hm2。北京市现有草坪约 5 000 多hm2[ 3] ,而且目前每年
以150多 hm2的速度扩展。然而草坪在发展过程中也面临很多问题,如有些品种抗逆性较差,
草坪病害发生逐渐严重, 使用化学肥料导致环境污染, 诸如此类都制约着草坪业的发展。草坪
微生物肥料则可以提高草坪草的抗逆性和抗病性[ 8, 9] , 避免土壤板结, 土质退化以及环境污染
等弊端,从而提高草坪质量,因此草坪专用微生物肥料有着广阔的市场应用前景。本项研究在
实验室条件下分离筛选出 3种对草坪草抗逆及抗病性有显著影响的功能性细菌[ 8, 9] , 并对其
进行了培养条件及生理学特性研究,为研制适用于草坪植物生长的微生物肥料及其推广应用
奠定基础。
1 材料与方法
11 菌株来源
供试菌株 E、F、H,由中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所病理研究室分离筛
选。
12 菌株培养性状
细胞形态特征观察:将供试菌株E、F、H 在营养琼脂培养基上30 培养 20 h,进行革兰氏
染色和芽孢染色,显微镜(OLYMPUS, BH2型)下观察细菌个体形状、染色反应,测量菌体大小。
斜面培养性状观察: 用接种环沾少量菌液,在营养琼脂斜面上自下而上拉一直线, 30 培
养3 d,观察生长型、光泽、颜色等斜面培养性状。
平板培养性状观察: 将菌液稀释后滴在平板上,然后用刮刀涂抹均匀, 30 培养 5 d, 观察
分布疏密的单菌落形态。
13 菌株培养条件的优化筛选
131 N源对供试菌株生长的影响 基础培养基(KH2PO4 136 g, CaCl201 g,Na2HPO4 213 g,
蔗糖 10 g,MgSO4!7H2O 02 g, FeSO4!7H2O 0028 g,H2O 1 000 mL)。供试N 源为( NH4) 2HPO4、
NH4Cl、(NH4) 2SO4、NH4NO3、KNO3、蛋白胨、牛肉浸膏、酵母膏。
称取 8种N源各 01 g 分别溶于 100 mL基础培养基中, 即N 源浓度为 01 % ,分装试管,
每管 8 mL,高压蒸汽灭菌 30 min,将斜面培养 20 h的幼龄菌种溶于无菌水,配成菌悬液(浓度
为20 ∃ 104个!mL- 1,下同) , 每试管接种菌悬液 01 mL, 30 培养 2 d,于 752型紫外光栅分光
光度计 650 nm 处(下同)测定各处理透光度(透光度与菌株生长量近似成反比) [ 11] , 每种 N源
均设未接种对照调零,重复 3次。
132 C源对供试菌株生长的影响 基础培养基( MgSO4!7H2O 02 g, ( NH4) 2SO4 2 g, NaH2PO4
!H2O 0565 g, CaCl2!2H2O 01 g,K2HPO4!3H2O 0569 g,H2O 1 000 mL)。供试 C源为葡萄糖、麦
芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉、肌醇、山梨醇、甘露醇。
称取 8种 C源各1 g 溶于100 mL 基础培养基,即C源浓度为1 %, 分装试管,每管 8mL,灭
菌30 min,将培养 20 h的幼龄菌种溶于无菌水,配成菌悬液, 每试管接种菌悬液 01 mL, 30
培养 2 d, 650 nm 处测各处理透光度, 每种 C源均设未接种对照调 0,重复 3次。
133 pH 值对供试菌株生长的影响 供试培养基为蔗糖蛋白胨液体培养基(蔗糖 20 g, 蛋白
胨5 g,K2HPO4!3H2O 0654 g,MgSO4!7H2O 025 g,蒸馏水 1 000 mL)。
将蔗糖蛋白胨培养基用 1 mol!L- 1 HCL 或 1 mol!L- 1 NaOH 配成 12个 pH 值梯度, 分别为
30、40、60、65、70、72、74、76、78、80、90和 100,分装试管, 每管 8 mL,每个梯度 5支
试管,其中2支作为灭菌后 pH 值检测。培养基经高压蒸汽灭菌30 min后,每管接种01 mL菌
悬液; 30 培养 48 h后, 测定 650 nm处透光度,每个梯度均设未接种的培养液为对照。
134 温度对供试菌株生长的影响 供试培养基为蔗糖蛋白胨液体培养基,分装试管, 每管 8
mL, 接种 01 mL 菌悬液于15、20、25、30、35、40、45 不同温度下培养 48 h,培养液于 650 nm处
测定透光度,每处理重复 3次。
135 摇床转速和摇瓶装液量对菌株生长的影响 供试培养基为蔗糖蛋白胨培养液。
摇床转速设置 50、100、150 r!min- 1 3种。
631第 5 期 贾秀贞等: 三种草坪草功能性细菌培养条件及其生理学特性
摇瓶装液量设 60、100、120、150、200 mL5种(摇瓶容量 500 mL)。
采用不同摇床转速和摇瓶装液量, 将3菌株在蔗糖蛋白胨培养液中 30 培养 48 h, 每处
理3次重复。然后将菌液在 4 000 r!min- 1下离心 10 min,去上清,将沉淀烘干( 60 )至恒重,
称菌体干质量。
所有试验结果均用 SPSS 100软件[ 10]进行统计分析,并用 Duncan法作多重比较。
2 结果与分析
21 菌株培养性状
细菌的培养性状、染色反应观察结果比较见表 1。
表 1 3 菌株培养性状的比较
特征 菌株 E 菌株 F 菌株H
形状 短杆形 杆形 杆形
大小/m 065∃ 262 092∃ 652 098∃ 654
芽孢 无 有 有
革兰氏反应 G- G+ G+
斜面培养性状 线形,颜色略黄,有光泽 念珠状,无光泽,乳白色 线形有小凸起,乳白色
平板培养性状 菌落圆形,有光泽,淡黄色 菌落圆形,乳白色,无光泽 菌落圆形,乳白色,无光泽
22 菌株培养条件的优化筛选
221 不同N源对菌株生长的影响 N源是菌体合成蛋白质和核酸的重要营养来源。如表 2
所示, 3菌株对 8种 N源利用效果差异显著( P< 005)。3菌株均以蛋白胨为最佳 N源, 透光
度分别为 3230%、1730%、1876% ,牛肉浸膏效果次之。可以看出菌株F、H 对有机N利用率
较高, 对无机N源利用效果较差, 菌株 E对有机 N源和无机 N源均能利用, 但仍以蛋白胨最
优。
222 不同 C源对菌株生长的影响 结果如表 3、表 4所示, 3菌株对 8种 C源利用效果差异
显著 ( P < 005)。菌株 E、F、H 对蔗糖利用效果最佳, 透光度分别为 4303%、5197%、
5470%,菌株F、H 对肌醇、山梨醇、甘露醇利用较差,透光度都在 95%以上, 且三者之间差异
不显著( P< 005) ; 菌株 E对肌醇利用最差。
表 2 不同 N 源对供试菌株生长(透光度)的影响
%
N源 菌株 E 菌株F 菌株H
( NH4) 2HPO4 3595 c 8980 d 9050 d
NH4Cl 4512 d 9357 e 9233 e
( NH4) 2SO4 4635 e 9493 f 9300 f
NH4NO3 3550 c 9403 e 9047 d
KNO3 3853 f 9540 f 9353 g
蛋白胨 3230 a 1730 a 1876 a
牛肉浸膏 3383 b 2177 b 2113 b
酵母膏 4553 d 3677 c 3857 c
注:同列比较不同字母示差异显著( P < 005,下同)
表 3 不同 C源对供试菌株生长(透光度)的影响
%
C源 菌株E 菌株F 菌株 H
葡萄糖 4413 a 5673 b 5863 b
麦芽糖 6017 b 9653 d 9160 d
蔗糖 4303 a 5197 a 5470 a
乳糖 5977 b 9573 d 9320 e
淀粉 8470 e 8733 c 7713 c
肌醇 9680 f 9867 e 9543 f
山梨醇 7548 c 9907 e 9517 f
甘露醇 7540 c 9833 e 9577 f
632 林 业 科 学 研 究 第17卷
表 4 C源对菌株生长影响方差分析
统计量 变异来源 自由度 菌株 E 菌株F 菌株 H
离差 组间 7 0759 0812 0622
平方和 组内 16 6933E04 4113E04 3833E04
总 23 0759 0812 0622
均方 组间 0108 0116 8880E02
组内 4333E05 2571E05 2396E05
F值 2 500842* 4 510186* 3 706337*
注: * 号表示差异显著( P < 005,下同)
223 不同 pH 值对菌株生长的影响 pH 值是影响菌体新陈代谢的重要因素。培养液 pH值
在3~ 4时,经灭菌后 pH值略有提高,而 pH 值在 6以上的培养基灭菌后 pH 值下降。如表 5、
表6所示, 3菌株在 pH 值 6~ 10范围内均能生长,其中菌株 E、F 在初始 pH 值为 74时生长最
佳,菌株H 在初始pH 值为 76时生长最佳。在 pH 值3~ 4时,透光度都在98%以上, 3菌株几
乎不生长。菌体生长过程中, 由于新陈代谢产生酸性物质, 使得培养液 pH 值降低。经回归分
析,培养后的培养液 pH 值( y )与初始 pH 值( x )呈正线性相关( P< 001) (见表 7)。
表 5 不同 pH值对供试菌株生长的影响
pH 值
灭菌前 灭菌后
菌株 E
透光度/ % 培养后 pH 值
菌株 F
透光度/ % 培养后 pH 值
菌株H
透光度/ % 培养后 pH 值
300 347 9953 i 330 9883 j 325 9927 h 320
400 410 9917 h 380 9863 j 370 9923 h 372
600 595 5280 f 490 6773 i 481 5113 f 476
650 649 4953 e 500 5713 f 485 4667 d 482
700 686 4763 d 510 5520 d 487 4670 d 484
720 705 4537 b 515 5206 bc 490 4587 c 488
740 719 4233 a 518 4813 a 493 4353 b 490
760 739 4663 c 526 5170 b 495 4020 a 495
780 747 4970 e 532 5210 c 508 4597 c 497
800 767 5263 f 540 5660 e 514 5000 e 504
900 805 5550 g 565 5897 g 537 5020 e 512
1000 916 5583 g 647 6407 h 582 6226 g 612
表 6 pH值对菌株生长影响方差分析
统计量 变异来源 自由度 菌株 E 菌株F 菌株H
离差 组间 11 1281 0 994 1396
平方和 组内 24 1020E04 1213E04 5800E05
总 35 1281 0 995 1396
均方 组间 0116 9040E02 0127
组内 4250E06 5056E06 2417E06
F值 27 393046* 17 881072* 52 501994*
633第 5 期 贾秀贞等: 三种草坪草功能性细菌培养条件及其生理学特性
表 7 培养后的培养液 pH值( y )与初始 pH值( x)的相关分析
菌株 E F H
相关系数 0991 0981 0973
显著性 * * * * * *
回归方程 y = 2104+ 0425x y = 2342+ 0356x y= 2226+ 0369x
注: * * 表示差异极显著( P < 001)。
224 不同温度对菌株生长的影响 从表 8、表9可看出, 3菌株在 25~ 35 范围内均能良好
的生长,低于 25 和高于 35 3菌株生长情况较差(透光度都在80 %以上)。3菌株在30
时生长情况最好, 35 次之。经方差分析可知, 温度对 3菌株生长的影响差异显著( P<
005) , 3菌株在 30 和 35 生长情况差异不显著( P> 005) ,这说明菌株 E、F、H 最适培养温
度范围是 30~ 35 。
表 8 不同培养温度对供试菌株
生长的影响
温度/
透光度/ %
菌株 E 菌株 F 菌株 H
15 9753 e 9483 f 9583 f
20 9067 d 8867 d 8750 d
25 6097 b 5877 b 6053 b
30 3947 a 3897 a 4247 a
35 3990 a 4180 a 4263 a
40 8827 c 8673 c 8077 c
45 9053 d 9353 e 9483 e
表 9 不同培养温度对供试菌株生长的
影响方差分析
统计量 变异来源 自由度 菌株E 菌株F 菌株H
离差 组间 6 1144 1097 0982
平方和 组内 14 1960E04 6600E05 1520E04
总 20 1144 1098 0982
均方 组间 0 191 0183 0164
组内 1400E05 4714E06 1086E05
F 值 13 620821* 38 798949* 15 070958*
225 不同摇床转速及装液量对菌株生
长的影响 经方差分析后认为, 摇床转
速、摇瓶装液量以及两因素交互作用效应
均显著,说明不同摇床转速和摇瓶装液量
对3菌株生长影响差异显著,同时因素 A
与因素B具有交互作用。从方差分析结
果可选出2因素的最佳组合(表10) :对菌
株E来说, 2因素最佳组合为摇瓶装液量
100mL,摇床转速 100 r!min- 1, 菌体干质
量达到 8353 mg!L- 1;对于菌株 F, 2因素
的最佳组合为摇瓶装液量 100 mL, 摇床
转速100 r!min- 1,菌体干质量 4 6930 mg
!L- 1, 100 mL, 150 r!min- 1次之,菌体干质
量3 7403mg!L- 1;对于菌株H,摇瓶装液
量100 mL,摇床转速 100r!min- 1为最佳组
合,菌体干质量
表 10 摇瓶装液量和摇床转速对 3 菌株生长的影响
摇瓶装液
量/ mL
摇床转速/
( r!min- 1)
菌体干质量/ (mg!L- 1)
菌株 E 菌株 F 菌株H
50 4723 j 9360 j 9267 k
60 100 6380 f 1 1613 i 1 9063 h
150 5327 i 8233 k 8787 k
50 7623 bc 2 2817 f 2 1853 f
100 100 8353 a 4 6930 a 3 5630 a
150 6917 d 3 7403 b 3 1260 c
50 6717 e 1 5687 h 1 9023 h
120 100 8253 a 3 2717 c 3 2537 b
150 7773 b 2 3523 e 2 4760 e
50 6153 g 1 1590 i 2 0757 g
150 100 7510 c 2 5123 d 2 7883 d
150 5823 h 1 8520 g 2 2040 f
50 3763 k 9430 j 1 4173 j
200 100 5967 h 1 2140 i 2 1043 g
150 4647 j 1 1540 i 1 5777i
634 林 业 科 学 研 究 第17卷
为3 5630 mg!L- 1, 120 mL, 100 r!min- 1次之,菌体干质量 3 2530 mg!L- 1。
3 结论与讨论
最利于 3菌株生长的 N源为蛋白胨, 牛肉浸膏次之; 最利于 3菌株生长的 C源为蔗糖,其
次为葡萄糖。
3菌株在 pH 值 6~ 10范围内均能生长,其中菌株 E、F在初始 pH 值为 74时生长最佳,菌
株H在初始 pH值为 76时生长最佳。在 pH 值为 3~ 4时, 3菌株几乎不生长。
3菌株在 30 时生长情况最好, 35 次之。3菌株在 30 和 35 生长情况差异不显著,
这说明菌株E、F、H 生长的最适温度范围是 30~ 35 。
不同摇床转速和摇瓶装液量对 3菌株生长影响差异显著。对菌株 E来说, 2因素最佳组合
为摇瓶装液量 100 mL,摇床转速 100 r!min- 1; 对于菌株 F, 2因素的最佳组合为摇瓶装液量 100
mL,摇床转速 100 r!min- 1;对于菌株H,摇瓶装液量 100 mL,摇床转速 100 r!min- 1为最佳组合。
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The Culture Conditions and Physiological Characteristics of
Three Functional Bacteria Used in Turfgrass
JIA Xiuzhen, DING Mingming, WANG Yuan, LIANG Jun
( Research Inst itute of Forest Ecology, Environment and Protection, CAF, Beijing 100091, China)
Abstract:Three functional bacteria improving disease resistance and adversity resistance of turfgrass were isolat
ed and chosen in the lab. The authors studied their culture conditions and physiological characteristics. The re
sults indicated that the best N source and C source for three bacteria ( E, F and H) were peptone and sucrose
respectively, beef extract and glucose second; three bacteria could grow at a pH range of 6~ 10, of which the
bacteria E and F grew best when the initial pH value was 74 and bacteriumH at pH 76; themost suitable tem
perature for them to grow was 30~ 35 ; the dry weight of three bacteria had a significant variance at different
shaker speed and different solution amount when cultured in flasks.
Key words:turfgrass; functional bacteria; culture conditions; physiological characteristic
635第 5 期 贾秀贞等: 三种草坪草功能性细菌培养条件及其生理学特性