全 文 ：林业科学研究 2006, 19( 3): 267~ 271
Forest R esearch
文章编号: 10011498( 2006) 03026705
具有光肩星天牛内切聚葡糖酶结合活性短肽的筛选
陈 敏 1, 2, 卢孟柱2* , 王敏杰 2, 张志毅 3
( 1.北京林业大学省部共建森林培育与保护教育部重点实验室, 北京 100083; 2.中国林业科学研究院林业研究所,国家林业局林木
培育重点实验室, 北京 100091; 3.北京林业大学教育部林木花卉遗传育种重点实验室, 北京 100083)
摘要: 内切葡聚糖酶 ( endog lucana ses)是光肩星天牛幼虫肠道的主要纤维素消化酶。本研究以光肩星天牛内
切葡聚糖酶的同工酶 AgEG2为靶分子, 从随机多肽噬菌体展示库中筛选与 AgEG2有亲和活性的短肽, 通过 3
轮筛选 , 短肽序列 TPHRSPL出现频率为 33. 7% , 而且展示该短肽的噬菌体均对 AgEG2有很高的结合能力。
进一步合成短肽 TPHRSPL, 并对肠道纤维素酶提取液进行了 W este rn分析 , 结果表明该短肽能特异结合内切
葡聚糖酶的同工酶 A gEG1 和 AgEG2, 而与粗酶液中其它蛋白组分均无结合特性。表明筛选获得的短肽
TPHRSPL对光肩星天牛内切葡聚糖酶具有特异结合亲和性。该短肽为研究光肩星天牛纤维素酶的特性及开
发天牛的生物防治制剂奠定了基础。
关键词: 光肩星天牛; 内切葡聚糖酶; 随机多肽噬菌体展示库; 短肽; 亲和性
中图分类号: S763 38 文献标识码: A
收稿日期: 20060110
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (批准号: 39900116)
作者简介: 陈 敏 ( 1973 ) ,女,四川宜宾人,博士
通讯作者, T e:l 01062888862; Em ai:l lum z@ forestry. ac. cn
Selecting and Identification of B inding Peptides of the Endoglucanases
from Anoplophora g labripennis
CHEN M in
1, 2
, LUM engzhu2, WANGM injie2, ZHANG Zhiyi3
( 1. Key Laboratory for S ilvicu ltu re and Conservat ion ofM in istry o fEducation, B eijing Forestry U nivers ity, Bei jing 100083, Ch ina; 2. R esearch
Inst itute of Forestry, CAF, K ey Laboratory ofT ree B reed ing and Cult ivat ion, State Forestry Adm in istrat ion, B eijing 100091,
Ch ina; 3. Key Laboratory o fGenet ics and Breed ing in T rees andO rnam en tal P lan ,t M in istry of Educat ion, Beijing
Forestry Un iversity, B eijing 100083, Ch ina)
Abstract: Endog lucanases are them ain cellulolytic enzym es in the gut ofAnop lophora glabrip ennis. In this study, random
pept ide phage display technology was em ployed to screen peptides that bound the AgEG2, a m em ber of endog lucanase
isozymes. Phage clones display ing peptide TPHRSPL accounted for 33. 7% of the selected phage population after three
rounds of screening, and showed higher phage recovery than the other clones in the binding assay. Peptide TPHRSPL was
chem ically synthesized and tested for its binding activ ity to AgEG2. The synthetic peptide exhib ited high binding specif ic ity
for AgEG1 and AgEG2. Th is ind icated that pept ide TPHRSPL had the affin ity to the endog lucanase ofA. glabrip enni,
wh ich could be used to study the biologica l ro le of the enzym e in the gut, and had the potent ial to be developed into b iolog
ical contro l agents ofA. glabrip enni.
K ey words: Anop lophora glabripennis; endog lucanases; random peptides phage d isplay library; b ind ing pept ides;
affinity
林 业 科 学 研 究 第 19卷
光肩星天牛 (Anop lophora glabrip ennis (Motsch. ) )
广泛分布于我国 24个省市自治区, 危害杨 ( Popu
lus)、柳 ( Salix )、榆 (Ulmus)、槭 (A cer )、槐 ( Sophora)、
桑 (M orus)等多种林木, 是我国杨树最重要的蛀干害
虫 [ 1]。天牛幼虫钻蛀树干隐蔽危害, 世代长且不整
齐,天敌种类少, 因而控制难度极大, 常规的防治方
法很难奏效 [ 2]。我国 三北 !防护林生态工程, 许多
以杨树为主的林分由于光肩星天牛的猖獗危害, 造
成大量树木被迫砍伐,甚至整个林分被毁灭,给我国
的杨树人工林带来严重威胁 [ 3]。
纤维素酶是天牛幼虫肠道的主要消化酶类, 是
研究天牛的生物学特性及开发抗天牛生物制剂的靶
标之一。作者对光肩星天牛幼虫肠道内的纤维素酶
体系进行研究表明, 光肩星天牛幼虫肠道内具有完
整的纤维素酶体系, 其中内切 1, 4葡聚糖酶活性
最高, 且具有广泛适宜的 pH 值和温度范围及较高
的热稳定性等特性。通过酶活性化学显色反应, 分
离出内切1, 4葡聚糖酶的两种同工酶, 分别命名
为 A gEG1( 26kD )和 A gEG2( 39kD) [ 4]。借鉴蛋白酶
抑制剂在害虫控制方面的成功经验, 开发天牛纤维
素酶的专性抑制剂或提高天牛杀虫剂的效果是一个
重要策略。但目前对天牛纤维素酶的研究主要集中
在纤维素酶的来源、组成及其特性等方面 [ 5~ 9]。仅
吴明等 [ 10]报道了 Cu2+对松墨天牛 (Monochamus al
ternatusH ope)纤维素酶的抑制作用。
近年来, 噬菌体展示技术 ( phage disp lay )的
迅速发展 ,已成为分子间相互作用研究的有力工
具, 也为筛选生物活性肽、蛋白质、受体以及开发
新型药物建立了新的方法 [ 11 ~ 16]。运用噬菌体展
示技术筛选出天牛纤维素酶的结合短肽, 可为天
牛纤维素酶的生物学特性研究及其抑制剂、杀虫
剂的开发提供基础。
本研究首次利用噬菌体展示技术进行了天牛
纤维素酶结合短肽筛选的尝试。以 A gEG 2作为
靶分子对随机七肽噬菌体库进行筛选, 获得特异
结合光肩星天牛内切葡聚糖酶的短肽序列, 并对
其结合特性进行了研究。本文还对该短肽用于
天牛纤维素酶特性的研究及其抑制剂的开发前
景进行了讨论。
1 材料和方法
1. 1 噬菌体展示库
随机七肽噬菌体展示库 PhD7Tm试剂盒购自
N ew Eng land B io labs(NEB ). 该噬菌体展示库以 M13
噬菌体为载体, 将编码随机 7肽的 DNA序列插入
M13噬菌体的 p∀基因,外源随机 7肽展示于外壳蛋
白 P ∀的 N 端。文库容量为 2 # 1012 Pfu ( plaque
form ing unit)。
1. 2 光肩星天牛幼虫
光肩星天牛幼虫采自天津地区的杨树被害木,
室内采用柳树 ( Salix sp. )和糖槭 (A cer saccharum
M arsh. )等枝条人工饲养, 备用。挑选生长健康、3
龄以上的幼虫作为实验材料。
1. 3 AgEG2的分离和纯化
按照作者介绍的方法进行 AgEG2的分离纯
化 [ 4]。从非变性聚丙烯酰胺凝胶的相应 AgEG2位
置切取胶块, 加适量 0. 1 mo l∃ L- 1 NaHCO3 ( pH 值
8. 6) 溶液洗脱 3次, 每次 30 m in, 最终酶液浓度稀
释到 100 g∃ mL- 1备用。回收酶液进行 SDSPAGE
( 12% )分析检验其纯度, 并用蛋白分子量标准估计
分子量。同时制备筛选过程中的对照洗脱液: 进行
AgEG2分离纯化时,留出两个泳道不加样, 电泳后切
取与酶带相同大小的空白凝胶, 用 0. 1 mo l∃ L- 1
N aHCO 3洗脱,方法同酶液的制备。
1. 4 噬菌体展示库的筛选
以 AgEG2作为靶分子对随机七肽噬菌体展示
库进行淘选, 筛选程序参照试剂盒说明书进行, 略有
改动。将 150 L A gEG2的 NaHCO3溶液加入酶标
板微孔中, 4 % 包被过夜, 同时包被空白胶的 N aH
CO 3洗脱液作为对照。倒掉包被液, 微孔中加满封
闭液 ( 0. 1 mo l∃ L- 1 N aHCO3, 5 mg∃ mL- 1 BSA,
002% NaN3 ), 4 % 孵育至少 1 h。采用酶液洗脱方
法制备空白聚丙烯酰胺凝胶的 TBS ( 50 mmo l∃ L- 1
T risHC l ( pH值 7. 5) , 150 mmol∃ L- 1 N aC l)洗脱
液。取该洗脱液 100 L稀释 10 L噬菌体原库 (约
2 # 1011 Pfu) ,并在 4 % 孵育 2 h, 以吸附原肽库中与
聚丙烯酰胺凝胶洗脱液特异结合的噬菌体。倒掉酶
标板中的封闭液, 用 TBST( TBS+ 0. 1% Tween20)洗
6次后,加入上述与聚丙烯酰胺凝胶洗脱液吸附过
的噬菌体七肽库, 4 % 缓慢振荡 4 h, 用 TBST洗 10
次,特异结合的噬菌体用 100 L 洗脱缓冲液 ( 02
mo l∃ L- 1 G lyc ineHC ,l pH值 2. 2, 1 mg∃ mL- 1 BSA)
洗脱 3次, 每次 10 m in, 洗脱液立即用 1 mol∃ L- 1
T risHC l缓冲液 ( pH值 9. 1) 中和。取少许洗脱液
(约 1 L)感染大肠杆菌 (E scherich ia coli ( M igula)
Caste llani and Chelm ers ) ER2738测定噬菌体效价,
268
第 3期 陈 敏等: 具有光肩星天牛内切聚葡糖酶结合活性短肽的筛选
以噬菌斑形成单位 ( P fu)表示, 其余噬菌体通过感染
宿主菌扩增后进入下一轮筛选。重复以上筛选程序
2轮, 从第二轮开始将 TBST中的吐温浓度增加为
05%。测定每轮筛选获得的噬菌斑数 (产出量 )以
计算噬菌体的回收比。噬菌体的回收比 =噬菌体的
产出量 /噬菌体的投入量。噬菌体的扩增、纯化和定
量按照试剂盒的使用手册进行。
1. 5 多肽序列分析
随机挑取第 3轮筛选获得的噬菌体克隆, 按照
试剂盒介绍的方法制备 DNA测序模板。用 310型
DNA自动测序仪 (美国 ABI)进行了 DNA序列分析。
推导展示短肽的氨基酸序列。
1. 6 单克隆噬菌体与 AgEG2结合活性测定
以上噬菌体单克隆分别进行扩增后, 按照上
述筛选方法测定与 A gEG2的结合能力。 1011 P fu
新扩增的单克隆噬菌体加入包被 AgEG2的酶标
板中, 按筛选程序进行结合和洗涤, 洗涤条件同
第三轮筛选。测定洗脱液中噬菌体效价 (噬菌体
的产出量 )。每个噬菌体克隆设三个重复, 以相
同投入量的随机七肽噬菌体展示库作为对照。
计算噬菌体的回收比。
1. 7 合成短肽与 AgEG2的结合分析
由赛百胜公司合成上述短肽 TPHRSPL(命名为
P2) ,并在短肽 N 端标记生物素 ( b iotin)以便于检
测.短肽用去离子灭菌水溶解后于 - 20 % 分装保
存。按梁国栋报道的方法 [ 17] , 以短肽 P2作为探针
与光肩星天牛幼虫的纤维素酶提取液进行W estern
分析, 检测该短肽的结合特性。光肩星天牛幼虫粗
酶液进行非变性 PAGE ( 12% )分离后, 立即将酶带
电转印到尼龙膜 (H ybondN + , Amershan pharmacia
产品 )上,为保持酶的活性, 缓冲液中不加甲醇,转印
条件为: 恒流 100 mA, 1 h。转移结束后取出尼龙
膜,用 TBS漂洗 1~ 5m in。用 10mL以 TBS 10倍稀
释的封闭液 & (购自 Roche公司 )于室温封闭 1 h, 用
TBS漂洗 2~ 5m in后,加入用 10 mL封闭液稀释的
P2探针 ( 1 g∃ mL- 1 ) , 4 % 缓慢振荡 2 h。用 TBS
洗膜并用碱性磷酸酶缓冲液 ( 100mmo l∃ L- 1 N aC ,l
100mmo l∃ L- 1 T ris, 5 mmo l∃ L- 1MgC l2, pH 值 95)
平衡后,将膜放入用封闭液按 1∋5 000稀释的链霉
素标记的碱性磷酸酶溶液 ( SPAP, Promega), 室温缓
慢振荡 1 h后,用适量 BC IP /NBT ( Roche)溶液于黑
暗中进行显色反应, 直到出现清晰的条带为止。用
无菌水冲洗后进行拍照、保存。
2 结果
2. 1 AgEG2的分离和纯化
从非变性聚丙烯酰胺凝胶中洗脱回收的 AgEG2
酶液,以羧甲基纤维素作为底物进行酶活性测定, 仍
保持内切葡聚糖酶活性, 且分离的酶液在 SDS
PAGE分析中呈单一酶带, 经蛋白分子量标准估计
分子量约为 39 kD (图 1)。以此分离纯化的酶液作
为靶分子,进行噬菌体随机多肽库的筛选。
图 1 SDSPAGE分析纯化的 AgEG2( A: AgEG2, M:蛋白分子量标准,
从上到下分别为 97KD、66KD、45KD、30KD、20. 1KD和 14. 4KD)
2. 2 噬菌体展示库的淘选
从随机七肽噬菌体展示库中取 2 # 1011 Pfu噬菌
体 (约包含 2. 8 # 109不同短肽的噬菌体克隆 )进行
筛选,并采取空白胶预吸附的方法去除噬菌体肽库
中与聚丙烯酰胺结合的噬菌体。从表 1可见, 三轮
筛选中噬菌体回收比不断增高, 由第 1轮的 6. 5 #
10
- 6升至第三轮的 3. 9 # 10- 3,升高了 600倍, 表明
筛选的富集效果是显著的, 有专一结合的噬菌体存
在。而对照每轮筛选的噬菌体回收比保持在 10- 5 ~
10
- 6左右, 说明没有噬菌体富集现象。
表 1 每轮筛选的噬菌体的回收比
轮数 靶分子 投入量 / Pfu 产出量 / Pfu 回收比
& AgEG2对照 ( CK )
2 # 1011
2 # 1011
1. 3 # 104
1. 0 # 104
6. 5# 10- 6
5. 0# 10- 6
( AgEG2对照 ( CK )
2 # 1011
2 # 1011
8. 2 # 105
2. 0 # 104
4. 1# 10- 4
1. 0# 10- 5
∀ AgEG2对照 ( CK )
2 # 1011
2 # 1011
7. 8 # 106
1. 2 # 104
3. 9# 10- 3
6. 0# 10- 6
2. 3 结合短肽的序列分析
从第三轮筛选的洗脱液中随机挑取了 11个噬菌
269
林 业 科 学 研 究 第 19卷
体单克隆 ( b1~ b11),分别进行扩增后,对每个单克隆
进行 DNA序列测定。根据试剂盒使用说明书提供的
外源序列插入位点, 从噬菌体 DNA序列中查找出随
机七肽的基因序列, 推导出七肽的氨基酸序列 (表
2)。b3、b6、b8和 b9四个噬菌体克隆含有完全相同的
短肽 TPHRSPL序列,出现频率为 36%,此外, b5也包
含 PHR同源序列。以上结果表明经过 3轮筛选, 特
异结合的克隆得到了富集。从表 2还可看出, b6克隆
所插入的外源基因序列与 b3、b8和 b9不同,但它们
表达相同的短肽序列,表明结合作用取决于短肽的氨
基酸序列而不依赖于噬菌体本身。
表 2 短肽的 DNA序列和氨基酸序列
克隆 DNA序列 氨基酸序列
b1 5 CATTTGCTTATTCCTCATCCT 3 H LLI PHP
b2 5 GCTTTGGCTCAGAAGGGTCTT3 ALAQKGL
b3 5 ACTCCGCATCGTTCTCCTCTG3 TPHRSPL
b4 5 CCGAGTCATCTTCATCTTTAT3 PSHLHLY
b5 5 AGTTATGATCCTCCTCATCGT3 SYDPPHR
b6 5 ACTCCTCATCGGTCTCCTCTT3 TPHRSPL
b7 5 ACTGCTAATACGCATAGGACT3 TANTHRT
b8 5 ACTCCGCATCGTTCTCCTCTG3 TPHRSPL
b9 5 ACTCCGCATCGTTCTCCTCTG3 TPHRSPL
b10 5 TGGATGGCTTTTCAGAATACG3 WMAFQNT
b11 5 CTTCATTTGCCGACTCCTGCG3 LH LPTPA
2. 4 筛选出的噬菌体与 AgEG2的亲和力分析
上述挑取的 11个克隆 ( b1~ b11)进行扩增后分
别与靶分子进行结合筛选, 检测富集噬菌体与靶分
子的结合能力, 以相同投入量的噬菌体肽库作为对
照,结果如图 2。 b3、b6、b8和 b9克隆的回收比为 4
~ 6 #10- 2, 而其余克隆及对照的噬菌体回收比约
10
- 4
~ 10
- 6
, 前者是后者的 400~ 40 000倍, 表明富
集的噬菌体克隆与 AgEG2的亲和力显著高于其它
克隆。
b1~ b11为噬菌体克隆, CK为未筛选的噬菌体肽库。
结果为 3次实验的平均值 (示标准差 )
图 2 筛选出的噬菌体克隆对 A gEG2的结合回收比
2. 5 P2与内切葡聚糖酶的结合作用
为进一步验证短肽 P2的结合特性, 合成了该短
肽序列并进行了 Western分析 (图 3)。从图 3 B可
以看出,短肽 P2仅与尼龙膜上的 AgEG1和 AgEG2
两条蛋白带有结合作用, 而对纤维素酶提取液中的
的其它蛋白组分没有吸附作用, 表明短肽对光肩星
天牛的内切葡聚糖酶有特异结合作用。由图 3A可
见, 光肩星天牛粗酶液中 AgEG1的含量大于
AgEG2,而图 3 B中, 短肽 P2对 AgEG1的杂交信号
反而比 AgEG2弱,表明该短肽与 AgEG2的结合能力
比对 AgEG1的结合能力更强。
A: 光肩星天牛幼虫纤维素酶粗酶液 nativePAGE;
B: 短肽 P2作为探针与纤维素酶提取液印迹膜进行 W estern分析
图 3 合成肽 ( P2)与内切葡聚糖酶的特异结合作用
3 讨论
本研究利用噬菌体展示技术进行了筛选天牛纤
维素酶特异结合活性短肽的尝试。由于对天牛内切
葡聚糖酶的结构特性缺乏了解, 因此研究选用了库
容量较大的随机七肽噬菌体库。
纤维素酶是由多种组分构成的复合酶系 [ 18] , 组
成复杂,因此纯化困难,通常的蛋白纯化方法易导致
酶分子的天然构象发生改变而失去活性。本研究以
非变性聚丙烯酰胺凝胶中洗脱回收的内切葡聚糖酶
作为靶分子, 既简便易行,又能很好地保持其原来的
构型和酶活性。但酶液中残留的大量聚丙烯酰胺凝
胶短链分子会吸附肽库中与其特异结合的噬菌体,
造成了前期筛选所获的富集噬菌体, 经检测均对聚
丙烯酰胺特异结合, 而与酶无结合作用。为避免酶
液中短链聚丙烯酰胺分子影响筛选结果, 对筛选程
序进行了改进, 将噬菌体展示原库以及每轮筛选的
270
第 3期 陈 敏等: 具有光肩星天牛内切聚葡糖酶结合活性短肽的筛选
噬菌体首先与空白聚丙烯酰胺凝胶的洗脱液吸附,
以去除噬菌体展示库中与聚丙烯酰胺分子特异结合
的噬菌体,然后再与靶分子进行吸附,确保所筛选出
的结合序列是酶分子的特异结合序列。每轮筛选的
噬菌体回收比、最后一轮筛选的单克隆噬菌体结合
力分析均表明, 改进的筛选方法能成功去除噬菌体
库中与聚丙烯酰胺分子特异结合的噬菌体克隆, 所
筛选出的富集噬菌体是通过与酶分子的特异结合而
获得,这证明以上改进是有效的,与靶分子特异结合
的噬菌体得到了有效富集。
为证明所获短肽 TPHRSPL可特异结合光肩星
天牛内切葡聚糖酶, 合成了短肽 P2。通过 W estern
分析, 发现 P2不但结合 AgEG2, 而且和 AgEG1也有
亲和结合作用, 而对粗酶液中的其它酶和蛋白却没
有结合作用。这证明了该短肽本身对内切葡聚糖酶
有较强的结合作用,同时也表明 AgEG1和 AgEG2为
同工酶甚至为同位酶,它们可能会有较高的氨基酸
序列同源性及类似的结构。许多研究表明, 同一物
种的内切葡聚糖酶同工酶往往有高度的序列同源
性,例如马铃薯线虫 G lobodera rostochiensis (W ollen
weber)的两个内切葡聚糖酶同工酶 G rEG1和 GrEG2
的分子量分别为 49. 7KD和 42KD, 而其 cDNA在 5
端有 95%的同源性 [ 19]。同样, 黄胸散白蚁 R eticuli
term es sp era tus( Ko lbe)的两个内切葡聚糖酶同工酶
RsEG1和 R sEG2的氨基酸序列有 98% 的同源
性 [ 20]。
初步测定了 P2与 AgEG1和 AgEG2结合后对其
活性的影响,结果酶活性没有明显的改变。原因可
能是短肽与酶分子的结合位点不是其活性作用的关
键部位,不至于影响其催化功能。虽然对酶活性没
有明显抑制作用,但这些与 AgEG1和 AgEG2特异结
合的短肽同样具研究和运用前景: ( 1)短肽可作为
标记, 研究天牛内切葡聚糖酶的诱导效应及在肠道
的分布特性,从而揭示天牛的消化和食性的机理, 为
开发天牛消化酶抑制剂奠定生物学基础; ( 2)短肽
可作为 向导 !, 与能抑制纤维素酶活性的物质相
连,使之更有效地找到靶部位, 增强对酶的抑制作
用,或结合能杀天牛的毒蛋白 [ 21] , 避免由于天牛食
性强、食物滞留时间短而造成毒蛋白在肠道中发挥
作用不充分; ( 3)短肽与其它大分子物质相连, 与纤
维素酶分子结合后形成物理障碍, 影响纤维素酶的
催化活性。因此特异结合短肽的获得为开发杀天牛
生物制剂或增加其杀虫效果奠定了基础。
参考文献:
[ 1 ] 张星耀,骆有庆.中国森林重大生物灾害 [M ] . 北京: 中国林业
出版社, 2003: 30~ 32
[ 2 ] 骆有庆,李建光.杨树灾害控制的应用技术和基础研究策略 [ J] .
北京林业大学学报, 1999, 21( 4 ): 6 ~ 12
[ 3 ] 骆有庆,刘荣光,许志春, 等. 防护林杨树天牛灾害的生态调控
理论与技术 [ J]. 北京林业大学学报, 2002, 24( 5 ): 160~ 164
[ 4 ] Ch en M in, Lu M engzhu, Zhang zh iy.i Characteris tics of cellu lases
from Anoplophora g labripenn is Motsch ( Coleoptera: C erambucidae)
[ J] . Forestry S tud ies in Ch ina, 2002, 4( 2) : 43~ 47
[ 5 ] 李庆.天牛消化纤维素的机制研究 [ J] .林业科学, 1991, 27( 4) :
417~ 424
[ 6 ] 殷幼平,程金秋,蒋书楠.桑粒肩天牛纤维素酶的性质研究 [ J] .
林业科学, 1996, 32( 5 ) : 454~ 459
[ 7 ] 蒋书楠,殷幼平,王中康.几种天牛纤维素酶的来源 [ J] . 林业科
学, 1996, 32( 5) : 441~ 446
[ 8 ] 索风梅,林长春,王浩杰,等.松墨天牛纤维素酶的研究 I.纤维素
酶性质研究 [ J].林业科学研究, 2004, 17( 5) : 583~ 589
[ 9 ] 殷幼平,曹月青,何正波,等. 桑粒肩天牛 3种纤维素消化酶的分
布 [ J] .林业科学, 2000, 36 ( 6) : 82~ 85
[ 10 ] 吴明,丁中文. 纤维素酶抑制剂对松墨天牛消化生理的影响
[ J] .浙江林业科技, 2003, 23( 1) : 1 ~ 4
[ 11 ] Dev lin J J, Pangan ib an L C, Devlin P E. Random pept ide l ibraries:
a sou rce of specific b ind ing rvolecu les [ J] . S cien ce, 1990, 249:
404~ 405
[ 12 ] M cGregor D. Selection of protein and p ept ides from libraries d is
played on f ilam en tous bacterioph age[ J] . M olecu lar B iotechnology,
1996, 6: 155~ 162
[ 13 ] Sm ith G P, Petrenko V A. Phage disp lay[ J] . Chem Rev, 1997,
97 ( 2) : 391~ 410
[ 14 ] W ang C I, Yang O, C raik C S. Isolat ion of a h igh inh ib itor of uro
kinasetype plasm inogen activator by phage display of ecot in[ J] J
B iolC hem, 1995, 270: 12250~ 12256
[ 15 ] W i llatsW G T. Phage display: Pract ical it ies and prosp ects[ J] .
P lan tMo lecular B io logy, 2002, 50: 837~ 854
[ 16 ] W ilson D R, F inlay B B. Phage disp lay: app lications, innova
t ion s, and issues in phage and host b io logy[ J ] . C an JM icrob io,l
1998, 44: 313~ 329
[ 17] 梁国栋.最新分子生物学实验技术 [M ] .北京:科学出版社, 2001
[ 18 ] B ayar E A. Properties of cellu lolytic enzym e [ J ] . B iochem Soc
Trans, 1985, 13: 407~ 410
[ 19 ] Sm an tG, S tokk erm an s J, Yan Y, et a.l E ndogenous cel lu lases in
an im als: isolat ion of b1, 4endoglucanase genes from tw o sp ecies of
plan tparasitic cyst nem atodes[ J] . P roc Nat lA cad S ciU SA, 1998,
95: 4096~ 4911
[ 20 ] Tokud aG, Lo N, W atanabeH, et a.l M etazoan cellu lase gen es from
term ites: intron / exon stru ctures and s ites of exp ression[ J] . B io
ch im B iophys Acta, 1999, 1447: 146~ 159
[ 21 ] Ch en Jun, Dai L ianYun, W ang XuePin, et a.l The cry3A a gene
ofBac illu s thu ring iensis B t886 encod es a toxin aga inst longh orn ed
beetles[ J] . A pp lM icrob iol B iotechno,l 2005, 67: 351~ 356
271