全 文 ：林业科学研究 2005, 18( 1) : 106~ 108
Forest Research
文章编号: 10011498( 2005) 01010603
灵芝属木质素降解高效菌株筛选
张金萍, 王敬文, 姜景民, 杨卫东
(中国林业科学研究院亚热带林业研究所,浙江 富阳 311400)
关键词:漆酶; 木质素降解酶;锰过氧化物酶; 灵芝菌
中图分类号: S75981 文献标识码: A
收稿日期: 20040518
基金项目: 浙江省自然科学基金项目 酶法降解木质素的研究 (项目编号 202112)
作者简介: 张金萍( 1971 ! ) ,女,山西翼城人,助理研究员.
Comparison on Lignindegrading Enzymes of Ganodermalucidum Fungi
ZHANG Jinping, WANG Jingwen, JIANG Jingmin, YANG Weidong
(Resarch Institute of Subtropical Forestry, CAF, Fuyang 311400, Zhejiang, China)
Abstract: The diagnostic methods of extracelluar oxidasemat were used to select lignindegrading enzymes producers among nine
teen Ganoderma lucidum fungal strains. The results showed that the producing laccase activity of G . sp. var. Tianzhi was the high
est, followed by that of G. lucidum 10 and G. lucidum 8. The producing lignin peroxidase activity of G. sp. var Tianzhi was the
highes, and the producing Manganeseperoxidase activity of G. sp. var yuanzhi 6 and G. lucidum G 8 were the highest, followed by
that of the G . sp. var. Tianzhi and G. lucidum 10. It was found that G . sp. var Tianzhi, G . sp. var. Yuanzhi 6、G. lucidum 8 and
G. lucidum 10 showed the highest lignindegrading enzymes activity.
Key words: laccase; lignin peroxidase; manganese peroxidase; Ganderma fungi
木质素是人类可再生的纤维资源之一, 是植物
纤维中蕴藏太阳能极大的物质, 是石油最大的代用
品。目前,在纺织和制浆造纸等方面,木质素作为废
弃物被排放, 近 20多年的研究证明了白腐菌是主要
的木质素降解酶产生菌, 最终能将木质素矿化为
CO2和水。已知的白腐菌有数千种, 但目前用于木
质素研究的仅有 10余种, 主要有栓菌属( Trametes )、
烟管菌属( Bjerkandera)、平革菌属( Phanerochaete )、侧
耳属( Pleurotus)、香菇属( Lentinula )等[ 1]。自然界中
灵芝菌的菌丝只能利用木质素及其它小分子的碳水
化合物,留下纤维素和半纤维素,使朽木呈现白色腐
朽,因此在森林病理学中将灵芝属( Ganoderma)划归
在白腐菌种类。关于灵芝属木质素降解酶的研究少
见报道。本文从 16种食用灵芝菌中筛选出高活性
木质素降解酶产生菌, 并比较了 3种主要木质素降
解酶即漆酶( Laccase ,简称 Lac)、木质素过氧化物酶
( Lignin peroxidase , 简称 Lip)和锰过氧化物酶(Mang
nase peroxidase ,简称Mnp)的活性,其目的是从灵芝属
中筛选出对木质素降解能力较强菌株, 为进一步开
发利用木质素提供更多种类的菌株。
1 材料与方法
11 菌株
实验用菌株共 18株(包括 2株对照菌) , 2株购自
中科院微生物研究所, 4株构自中国农科院上海食用
菌研究所, 4株购自武汉华中农业大学, 8株购自山东
省济宁。这些菌株包括: 紫灵芝( Ganoderma sinense
JDZhao, LWHsu et XQZhang )、韩国灵芝 1 号
( Gkoreanese 1)、韩国灵芝 2号( Gkoreanese 2)、红灵
芝( Gapplanatum ( Pers) Pat)、赤芝 G8( Glucidum
( Curt is: Fr) PKarst8)、甜芝( GspvarTianzhi)、台湾
血芝( Gformosanum Chang et Chen)、黑芝( G atrum)、
圆芝 6号( GspvarYuanzhi 6)、灵芝 10号( Glucidum
10)、泰山仙芝( G sp varTaishan 野生选育种)、赤芝
12号 ( G lucidum 12)、白边灵芝 ( G. albimarginatum
He)、南韩灵芝( Gsp)、日本红芝( G. japonicum ( Fr)
Lloyd)、大仙 823( GspvarDaxian野生选育)。以黄孢
原毛平革菌( Phanerochaete chrysosporium )简称 PC)
(CK1)和云芝( Coriolus versicolor )菌( CK2) [ 2]作对照菌。
12 培养基
PDA培养基( 1 L ) :去皮马铃薯 200 g,葡萄糖 20
g,KH2PO4 3 g, 琼脂 15 g,MgSO4∀7H2O 15 g, VitB1 微
量。
MS液体培养基( 1 L) :葡萄糖 20 g, NH4NO3 165
g, KNO3 19 g, CaCl2∀2H2O 044 g,MgSO4∀7H2O 037
g, KH2PO4 017 g, 微量元素液配方( 1 L ) : KT 083
mg,H3BO3 62 mg, MnSO4∀4H2O 223 mg, ZnSO4∀7H2O
86 mg, Na2MoO4∀2H2O 025 mg, CuSO4∀5H2O 0025
mg, CoCl2∀6H2O 0025 mg, Na2EDTA 373 mg, FeSO4∀
7H2O 278 mg。
13 方法
131 菌种培养方法 将待试菌斜面接种于灭菌
后的 PDA 固体培养基上活化培养, 将活化了的菌种
接种于平板上, 25 # 恒温培养 5~ 11 d, 进行显色能
力检测。在 250 mL 三角瓶中装入 50 mL MS 培养
液,灭菌冷却后接入 7 d龄菌丝, 28 # , 110 r∀min- 1
恒温振荡培养 7 d备用。
132 显色反应[ 3] 漆酶检测法:将 05 g愈创木酚
加入到 30 mL体积分数为 95%的乙醇溶液中,用此溶
液滴定在培养 5、8、11 d的菌落边缘,滴定区变红褐
色,表示有漆酶产生,依据显色程度目测其产酶能力。
过氧化物酶检测法: 将等体积的体积分数分别
为04%过氧化氢和 01%联苯胺混合液滴定菌落
边缘,当有过氧化物酶存在时,滴下区显黄褐色。
133 粗酶液制备 250 mL 三角瓶中装入 50 mL
液体培养基, 115 # 下灭菌 30 min, 冷却后接入 2 mL
接种母液,每菌种 3个重复, 110 r∀min- 1, 28 # 恒温
振荡培养, 于 6、8、10、12、14 d各取样 1次, 过滤制得
粗酶液,冰箱保存备用。
134 酶活性测定方法 ( 1)漆酶活性: 按周金燕
等[ 4]方法进行, 酶的单位定义为每分钟吸光值增加
01的酶液量为一个活力单位; ( 2)木质素过氧化物
酶活性测定方法见文献[ 5] ; ( 3)锰过氧化物酶活性
测定方法见文献[ 5] (略有改动)。
2 结果与分析
21 不同灵芝菌显色结果的差异
由平板显色结果看出,在相同的条件下,参试的
16株菌中有 10株菌在 5、8、10 d时分别有不同程度
的产漆酶和过氧化物酶能力(表 1) , 说明这些菌具
有一定降解木质素的能力。在变色实验观察中, 培
养温度会影响菌丝生长,菌丝生长与变色区有一定
的关系:有18%的菌株的变色区域超过菌丝生长, 说
明该菌分泌木质素降解酶的能力强, 有 12%的菌株
菌丝生长区超过变色区,说明该菌分泌降解木质素
酶的能力弱,其余菌丝生长处都显色。
平板显色结果表明: 漆酶活力检测中,甜芝、赤
芝 G8、灵芝 10号和对照 CK2 生长最快, 显色最快,
圆芝 6号次之,另一株对照菌 CK1不显色, 已知该菌
在静置条件下不产生漆酶[ 6] , 因此该结果与之相吻
合。木质素过氧化物酶和锰过氧过物酶被认为是过
氧化物酶降解木质素时的重要组成酶。通过对 16
株灵芝菌过氧化物酶活性的检测, 间接反映了其产
木质素降解酶的能力,在过氧化物酶活力检测中甜
芝、圆芝 6号、赤芝 G8和2株对照菌生长最快,显色
最快,灵芝 10号、黑芝、紫芝、韩芝等次之。
表 1 漆酶和过氧化物酶平板检测产酶菌种
菌种名称 漆酶
5 d 8 d 11 d
过氧化物酶
5 d 8 d 11 d
赤芝 G8 + + + + + + + + + ∃ + + + + + +
圆芝 6号 + + + + + + + + + + + + + +
灵芝 10号 + + + + + + + + + + + +
甜芝 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
日本红芝 - - ∃ + + +
黑芝 - + + + + + + + +
紫灵芝 - ∃ + + + + + + +
白灵芝 + + + - ∃ +
韩国灵芝 - - ∃ + + + + + +
泰山仙芝 + + + - - ∃
云芝( CK2) + + + + + + + + + ∃ + + + + +
PC(CK1) - - - + + + + + + + + +
注: - 不变色; ∃ 开始变色; + 、+ + 、+ + + 变色能力渐增;
+ + + + 全变色。
22 漆酶活性比较
漆酶作为一种含铜的多酚氧化酶, 它在木质素
的生物降解中, 在各种酚类和丁香醛型化合物的反
应中发挥一定的作用[ 7]。对用平板显色法选出的10
株有显色反应的菌株(表 1)和 2株对照菌进行了漆
酶活性的比较。结果显示: 几乎所有菌株在第 14天
都表现出最大漆酶活性, 甜芝、灵芝 10号和赤芝 G8
的漆酶活性相对较高, 其中甜芝在第 12、14天时漆
酶活性超过对照 CK2, 其余 3株的漆酶活性略低于
对照CK2(图 1)。另一对照 CK1 几乎没有漆酶活性
(图中未显示)。
107第 1期 张金萍等: 灵芝属木质素降解高效菌株筛选
图 1 漆酶活性的比较
(图中仅列最高酶活性的 3株菌和 1株对照菌)
23 木质素过氧化物酶活性比较
木质素过氧化物酶( Lip)是自然界中唯一依赖
H2O2 为供体的氧化还原酶, 是含血红素辅基的酶
类,能将木质素降解为芳香醛、醌、酸等有用物质[ 7]。
对选出的产过氧化物酶能力较高的 9株菌(甜芝、赤
芝G8、灵芝 10 号、圆芝 6号、日本红芝、黑芝、紫灵
芝、白灵芝、韩国灵芝)和 2个对照菌( PC 和云芝)
进行活性测定, 结果表明:它们都具有较好的木质素
过氧化物酶活性, 第 12、14天时有 4 株菌出现高酶
活,第 12、14天时,甜芝是对照 CK1的 14和16倍,
是对照CK2的 32和 23倍(图 2)。
图 2 木质素过氧化物酶活性的比较
图 3 锰过氧化物酶活性的比较
24 锰过氧化物酶活性比较
锰过氧化物酶(Mnp)催化木质素降解,使 Mn2+ 变
成Mn3+ [ 8]。锰过氧化物酶活性测试结果表明: 第 12
天时圆芝 6号和赤芝 G8出现高酶活性;第 14天时,
甜芝和灵芝 10号及 2株对照菌出现高酶活性。产锰
过氧化物酶活性最高的圆芝 6号是对照 CK1 的 48
倍,是对照 CK2的 2倍。赤芝 G8的酶活性除第 14 d
略低于对照 CK2 外, 均高于 2株对照菌, 甜芝和灵芝
10号的酶活性高于对照CK1 而低于对照 CK2(图3)。
3 讨论
实验结果表明:在给定实验条件下的 16个灵芝
菌株中, 甜芝、圆芝 6号、赤芝 G8和灵芝 10 号为产
木质素降解酶最好的菌株,在平板显色试验中,有10
株菌在漆酶和过氧化物酶检测中显色, 这种显色试
验仅为简单判断,只能做初步筛选。图 1~ 3的酶活
性测定结果显示,前述酶活性较高的 4菌株和 2 对
照株菌的酶活性高低及变化趋势与平板显色结果基
本一致。本次试验虽然有 3株菌(甜芝、圆芝 6号赤
芝 G8)的 3种胞外木质素降解酶活性比 2株对照菌
的高,但此酶活性仅为一般条件下的初步筛选,不能
说明是每株菌的最高酶活性。液体培养基 ( MS)与
Kirk
[ 9]、Gold [ 10]、周金燕[ 4]等人的相比, 在试验条件
和方法上存在差异。3种胞外木质素降解酶是次生
代谢过程中, 在 C、N 源几乎耗尽的情况下分泌的,
因此,被筛选出来的菌株需进一步优化产酶条件及
产酶性质研究, 有关试验及对最好菌株进行直接降
解木质素的研究正在进行中。
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