全 文 ： 1997—09—02收稿。
刘伟助理研究员,杨宝君(中国林业科学研究院森林保护研究所 北京 100091) ; 徐福元,葛明宏,张培(江苏省林业科
学研究所) ;王成法(山东省长岛自然保护区管理局)。
* 本文为国家“八五”攻关课题“松材线虫病综合防治技术研究”内容之一。
松材线虫病树早期诊断的研究*
Ⅰ.马尾松、黑松松材线虫病树的早期诊断
刘 伟 杨宝君 徐福元 葛明宏 张 培 王成法
摘要 树脂分泌停止是松树受松材线虫危害的主要症状之一。对南京地区黑松、马尾松接种树
调查表明, 20～30 a 黑松春季接种14 d 后以异常树为标准作早期诊断可使准确率达100% , 夏季接
种25 d 诊断准确率为93% , 30 d 准确率100% ;秋季30 d 准确率100%。10～15 a黑松不论接种季节
20 d 后准确率即达100%。马尾松接种线虫后随不同树龄、不同接种时间流胶情况差别较大,使准确
率达100%的接种天数普遍比黑松迟10 d 左右。溴酚蓝、二甲基黄染色剂用于病树早期诊断反应不
明显。据流胶试验, 在松材线虫病新发现区可用流胶法作早期诊断, 以尽早清理病树并达彻底清除
的目的。
关键词 黑松 马尾松 松材线虫病 流胶法 早期诊断
由松材线虫[ Bursaphelenchus xy lophilus ( Steiner and Buhrer) Nickle]引起的松树萎蔫病
对日本的松林造成了巨大威胁 [ 1]。该病害自1982年传入我国后造成黑松( P inus thunber gii
Parl . )、马尾松( P . massoniana Lamb. )大量死亡。对于松材线虫病目前国内外尚无经济而行之
有效的防治手段,所以在初发病点, 用早期诊断方法消灭侵染源就显得十分重要。日本早在70
年代即报道流胶停止是松树感染松材线虫的早期症状之一,但20 a 来未见有进一步报道。作者
于1994～1995年在江苏省南京市江宁县疫区,用流胶法和指示剂方法分别检测感病黑松和马
尾松,以寻求对松材线虫病快速、准确而简单易行的早期诊断方法。
1 试验林区
试验地设在南京市江宁县的江苏省林科所林区。20～30 a 大树试验选在黑松、马尾松和一
些阔叶树的天然混交林内, 10～20 a幼树试验选在黑松、马尾松种源试验林内。选择立地条件
一致、外观健康的黑松、马尾松各约150株作供试树。
2 试验方法
2. 1 流胶法
2. 1. 1 健康树不同时间、方位打孔 1995年6月选取20～30a黑松、马尾松健树各两株, 于
两个时间(早、晚)、三个部位(头顶部、胸高部、干基部)、四个方向(东、南、西、北)用打孔器(直
径15 mm)分别打一深达木质部的圆孔, 24 h 后观察树脂渗出情况。据树脂分泌状态划分为以
林业科学研究 1998, 11( 5) : 455～460
Forest Research
下5级: 1级为树脂从孔口流下,渗出量很多; 2级为树脂从孔口流下,但比1级少; 3级为树脂仅存
积在孔口下缘; 4级树脂渗出到圆孔壁上,呈粒状; 5级孔壁上无树脂渗出。
2. 1. 2 接种木打孔 在试验林内, 选取两个年龄段的黑松、马尾松若干株, 分别于1995年春、
夏、秋三季用线虫接种。方法如下:从黑松病死树上分离的松材线虫经 PDA 灰葡萄孢( Botry tis
cinerea Pers. )培养繁殖后用树皮有伤法(即于供试树的干基部用刀砍长约50 mm、深达木质部
的伤口) [ 3]接种,具体接种时间及接种量见表1。接种树每隔一天打孔1次, 次日观察流胶情况,
14 d后每5 d打孔观察一次,总计观察60 d。接种后2、3、6个月分别调查松树死亡率。
另外于1994年5月19日用同样方法接种20～30 a 黑松、马尾松约100株, 接种量5 000
条/株, 以菌液作对照, 具体接种株数见表4。6月29日调查流胶情况, 8月30日调查死亡率。
表1 黑松、马尾松供试树接种线虫的数量和时间
项 目 黑 松 马 尾 松
20～30 a 10～15 a 20～30 a 10～15 a
接种日期(月- 日) 04- 29 06- 26 09- 20 04- 29 06- 26 09- 20 04- 29 06- 26 09- 20 04- 29 06- 26 09- 20
接种量(条/株) 5 000 5 000 5 000 5 000 5 000 5 000 10 000 10 000 6 000 5 000 5 000 6 000
接种样树(株) 15 15 15 15 10 10 15 15 15 15 10 10
健树对照(株) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
2. 1. 3 自然林区内打孔 为与自然情况作比较,于1995年7月16日在疫区选一片林地,对其中
的黑松、马尾松逐一在胸高处打孔, 24 h后观察流胶程度, 3级以上用白油漆标记,于9月30日、
10月30日分别调查死亡率。
2. 2 染色剂法
随机选取已接种线虫30 d 而外观正常的20～30 a 黑松、马尾松若干株,在树干部用刀砍
约70 mm 深至木质部的斜面,在斜面上分别滴加1%溴酚蓝酒精( 50% )溶液、0. 04%溴酚蓝酒
精( 95% )溶液、0. 04%二甲基黄酒精( 95% )溶液,同时以未接种的健康树和接种死亡的枯树作
对照, 10 min 后观察斜面颜色反应。
3 结果与分析
3. 1 健康树打孔试验
黑松、马尾松健康树共计打孔96个, 其中1级89个(占93%) , 2级7个(占7%) , 无3级以上流
胶。由此看出对于黑松、马尾松大树, 不同打孔时间、部位、方位其流胶程度没有差别。
3. 2 接种树流胶结果
黑松、马尾松两个年龄段、三个接种时间的流胶结果见表2、3。
黑松成年大树春季接种10 d 后异常树比例高达73%, 至第14天接种树全部异常,接种后
第10、12天作早期诊断,以异常树为标准可使准确率分别达73%、93%,第14天以后准确率可达
100%; 夏季接种第20天后异常树急剧增加( 80% ) , 此时准确率87% , 第30天以后准确率达
100%; 秋季接种异常树比例与春、夏无明显差异,但诊断准确率下降,第14天准确率80%, 30 d
只有93%。黑松10～ 15 a 幼树春季第10～12天流胶明显异常, 20 d 后诊断准确率
1 00% ; 夏季第6天已有60%异常, 第20天后准确率为100% ; 秋季接种异常树比例一直稳定
456 林 业 科 学 研 究 11卷
表2 黑松不同年龄、时间接种流胶情况比较 (单位: % , 1995年)
接种 天数
( d )
20～30 a 10～15 a
春( 04- 29) 夏( 06- 26) 秋( 09- 20) 春( 04- 29) 夏( 06- 26) 秋( 09- 20)
Ⅰ Ⅱ Ⅰ Ⅱ Ⅰ Ⅱ Ⅰ Ⅱ Ⅰ Ⅱ Ⅰ Ⅱ
0 0 0 0 7 0 7 0 0 0 0 0 0
2 0 0 0 7 0 7 0 0 0 0 0 0
4 0 0 0 7 0 7 0 0 10 0 0 0
6 6 6 13 20 20 27 0 0 60 0 60 60
8 13 13 20 27 67 60 0 0 70 0 80 80
10 73 73 33 40 47 40 47 47 90 47 70 70
12 93 93 20 27 40 70 100 100 80 100 70 70
14 100 100 20 27 87 80 93 93 60 93 100 100
20 100 100 80 87 93 87 100 100 80 100 100 100
25 100 100 87 93 93 87 100 100 100 100 100 100
30 100 100 93 100 100 93 100 100 100 100 100 100
35 100 100 93 100 100 93 100 100 100 100 100 100
40 100 100 93 100 100 93 100 100 100 100 100 100
45 100 100 93 100 100 93 100 100 100 100 100 100
50 100 100 93 100 100 93 100 100 100 100 100 100
55 100 100 100 100 100 93 100 100 100 100 100 100
60 100 100 100 100 100 93 100 100 100 100 100 100
接种2个月死亡率 90 100 40 100 100 10
接种3个月死亡率 100 100 40 100 100 10
至次年春季死亡率 100 100 93 100 100 100
注:Ⅰ——异常树比例(% ) = ( 3～5级株数之和) /接种株数×100% ;Ⅱ——诊断准确率( % ) = ( 1～2级活株数+ 3～5级
死株数) /处理株数×100% (以下各表同)。
增加, 10 d准确率70% , 20 d以后可达100%。
马尾松大树流胶下降较缓, 春季接种第6天出现异常,第12天后明显下降(异常树80%) , 60
d仍有8%正常树, 25 d以后准确率92% ;秋季接种异常树比例变化较稳定, 25 d准确率92%,
40 d 以后为100%。马尾松10～15 a幼树春季接种第12天异常树明显增加, 流胶明显减少, 第
30天以后准确率100%; 夏季接种从第8天明显异常,以后不断反复,至第60天仍有10%的正常
树, 40 d以后准确率在80%以上。秋季接种第6天两项指标明显变化, 45 d 准确率80%, 50 d 以
后可达100%。
作为对照的黑松、马尾松,两个树龄、三个季节打孔,其流胶量均为1级或2级,未出现异常
树。
黑松不论树龄, 春、夏季接种, 3个月内死亡率均达100% ,而秋季接种3个月死亡率只有
50%,这可能与秋季气温较低有关。马尾松3个月死亡率则随不同树龄、接种时间差别很大, 有
些接种季节死亡率为0,但至次年春季死亡率可达80%以上。
1994年接种结果见表4。接种40 d 后的6月29日调查, 接种树无1株死亡;黑松供试树外观
虽属正常, 但异常树高达100%, 至8月30日异常树全部死亡; 接种40 d 后诊断准确率可
达 100%。马尾松6月29日调查时异常树90% , 但仍有5株 (占10% )为1～2级状态 ; 至8月
4575期 刘伟等: 松材线虫病树早期诊断的研究(Ⅰ)
表3 马尾松不同年龄、不同时间接种流胶情况比较 (单位: % , 1995年)
接种后天数
( d )
20～30 a 10～15 a
春( 04- 29) 夏( 06- 26) 秋( 09- 20) 春( 04- 29) 夏( 06- 26) 秋( 09- 20)
Ⅰ Ⅱ Ⅰ Ⅱ Ⅰ Ⅱ Ⅰ Ⅱ Ⅰ Ⅱ Ⅰ Ⅱ
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
4 0 0 7 8 0 0 0 0 0 0 0 0
6 27 30 20 23 42 42 0 0 40 40 100 100
8 47 40 33 31 83 83 7 7 70 50 100 100
10 60 50 60 69 75 75 33 33 100 80 90 90
12 80 70 87 85 75 75 73 73 90 70 80 80
14 100 70 87 85 75 75 87 87 90 70 80 80
20 93 90 87 85 67 67 100 100 60 40 70 70
25 90 80 93 92 92 92 93 93 70 50 70 70
30 87 80 93 92 92 92 100 100 70 50 60 60
35 93 100 100 100 92 92 100 100 60 50 70 70
40 100 100 93 92 100 100 100 100 100 80 60 60
45 100 100 100 100 100 100 100 100 90 90 80 80
50 100 100 100 92 100 100 100 100 90 90 100 100
55 100 100 100 92 100 100 100 100 90 90 100 100
60 100 100 100 92 100 100 100 100 100 80 100 100
接种2个月死亡率 7 33 0 0 30 0
接种3个月死亡率 40 33 0 0 40 0
至次年春季死亡率 100 100 100 100 80 100
表4 1994年5月19日接种黑松、马尾松流胶情况 (接种量: 5 000条/株)
树 种 处理方法 处理株数
06- 29调查 08- 30调查
流胶级 株数 比例
(% )
死亡株数 死亡率
( % )
合计
( % )
准确率
( % )
1级 0 0 0
黑 2级 0 0 0
线虫 47 3级 3 100 3 100 100 100
松 4级 26 26 100
5级 18 18 100
菌液( CK) 10 1级 10 100 0 0 0 100
1级 4 1 25
马 2级 1 10 0 0
20
尾 线虫 50 3级 2 2 100 96
松 4级 21 90 21 100 98
5级 22 21 95
菌液( CK) 9 1级 9 100 0 0 0 100
30日异常树死亡率98% ,诊断准确率96%。在黑松、马尾松接种死亡的92株中均能检测到松材
线虫。两树种作为对照的19株供试树流胶均正常,无1株死亡。
458 林 业 科 学 研 究 11卷
3. 3 自然林区内打孔
结果见表5。疫区中所选林木共有松树(黑松、马尾松) 1 022株, 9月30日、10月30日调查时
1、2级死亡率均为0, 3～5级死亡数分别为24、39株,早期诊断准确率分别为90. 3%、91. 7%。9月
30日和10月30日该林分松树死亡率分别为2. 3%、3. 8%。
表5 自然林区内黑松、马尾松打孔后流胶调查 (打孔时间: 1995- 07- 16)
流胶级别 供试树
(株)
09- 30调查 10- 30调查
死亡数(株) 死亡率( % ) 准确率( % ) 死亡数(株) 死亡率( % ) 准确率( % )
1级 886 0 0 0 0
2级 13 0 0 0 0
3级 61 4 6. 6 90. 3 6 9. 8 91. 7
4级 30 8 26. 7 11 36. 7
5级 32 12 37. 5 22 68. 8
合 计 1 022 24 2. 3 39 3. 8
3. 4 溴酚蓝、二甲基黄染色剂检测结果
表6显示, 1%溴酚蓝染色黑松、马尾松的健康树、接种树、死树均显示桔黄色, 无明显差异。
健树和接种树对0. 04%溴酚蓝、0. 04%二甲基黄的反应一致,死树虽略有不同但差别不明显。
对供试树进行线虫再分离时,接种树和死树均能检测到线虫, 健康树则未受线虫侵染。
表6 溴酚蓝、二甲基黄染色结果
树 种 类 别 1%溴酚蓝 0. 04%溴酚蓝 0. 04%二甲基黄 检测线虫
黑 松 健康树 桔黄色 紫罗兰色 黄色 -
接种树 桔黄色 紫罗兰色 黄色 +
死 树 桔黄色 浅绿色 褐黄色 +
马尾松 健康树 桔黄色 紫罗兰色 黄色 -
接种树 桔黄色 紫罗兰色 黄色 +
死 树 桔黄色 灰黄色 褐黄色 +
注:“+ ”表示能检测到线虫,“- ”表示未检测到线虫。
4 结论与讨论
( 1)对于20～30 a 黑松、马尾松健树, 打孔时间、方向和部位对流胶程度没有影响。疫区内
一次性接种黑松大树, 春季接种14 d后以异常树为标准可使早期诊断准确率达100%,夏季接
种25～30 d 后准确率100%, 秋季30 d 后准确率93%。马尾松则随不同树龄、不同接种时间差
别较大,使准确率达100%的接种天数比黑松迟10 d 左右。春季接种的马尾松幼树当年死亡率
为零,至次年春季才全部死亡,这和松树的抗病性有关。黑松、马尾松接种松材线虫后流胶程度
不同,黑松达3级后较稳定, 而马尾松流胶情况反复较大, 这可能与两者的抗病性有很大关
系[ 3]。关于用流胶法早期诊断马尾松病树问题有待进一步研究。
本试验所用方法是人工一次性接种线虫,但自然界天牛的接种是间歇性的,接种量逐渐增
加,所以在实际应用中应根据不同地区天牛羽化始期和盛期的不同对早期诊断时间和次数作
相应调整,以提高诊断准确率。
4595期 刘伟等: 松材线虫病树早期诊断的研究(Ⅰ)
( 2) 1994年春季接种的20～30 a 马尾松死亡率较高, 可能与该年气温偏高、降雨量少有
关。
( 3)曾报道用溴酚蓝、二甲基黄染色剂区分松材线虫病树与健树[ 4] ,本试验试图用其作早
期诊断,但结果不理想,可能这两种试剂不能明显区分初期病树,到后期至枯树时反应才明显。
参 考 文 献
1 Mam iya Y. Init ial patholog ical changes and diseas e development in pine t rees in duced by th e pine w ood n ematode,
Bursaphe lenchus xylop hi lus. Ann. Phytopath . S oc. Japan, 1985, 51( 5) : 546～555.
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218.
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4 徐刚,粟子安.黑松感染线虫后树干中萜类成分的变化.林产化学与工业, 1994, 14( 3) : 49～54.
Study on Early Diagnosis for Pine Wilt Disease
Caused by Bursaphelenchus xylophilus
Ⅰ. Early Diagnosis for Pine Wilt Disease by Bur saphelenchus xy lophilus
Parasit ing in P inus massoniana and P . thunbergii
Liu Wei Yang Baoj un X u Fuyuan Ge Minghong Zhang P ei Wang Chengf a
Abstract T he stop of oleoresin exudation through trees is a major symptom of pine
w ood nematode disease. In Nanjing City, Japanese black pines and masson pines w ere inocu-
lated with nematodes. Weakened trees w ere taken as a diagnosis standard. Results w ere
show n: fo r Japanese black pine, accuracy w as more than 93% af ter 12 days in the spring in-
oculat ion, 80% af ter 20 day s and 93% after 25 day s in the summer inoculat ion. T her e w as no
obvious dif ference betw een 10～15 and 20～30 years old trees of the inoculated Japanese
black pines. T he amounts of o leo resin exudat ion o f the masson pines inoculated w ith nema-
todes w ere obv ious dif ferent w ith t ree ages and inoculation periods. Bromophenol blue and
dimethy yel low w ere used as indicators for early diagnosis, but the co lour react ions w ere not
distinct . Based on the test , early diagnosis of the t rees in new disease area through observing
the amounts of o leo resion exudat ion can be adopted to clean the disease t rees thoroughly .
Key words P inus massoniana P . thumbergii PWN disease o leo resin exudation
method early diagno sis
L iu Wei, Ass istan t Profes sor, Yang Baojun ( T he Research Inst itute of Forest Protect ion, CAF Beijin g 100091) ; Xu
Fuyuan, Ge Ming hong, Zh ang Pei ( Fores try Research Ins ititue of Jiangsu Province) ; Wang Ch engfa ( T he Adminis tr at ive Of-
fice of Ch angd ao Nature Reserve, Shandong Province) .
460 林 业 科 学 研 究 11卷