全 文 ：第 51 卷 第 7 期
2 0 1 5 年 7 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 51，No. 7
Jul．，2 0 1 5
doi:10．11707 / j．1001-7488．20150707
收稿日期: 2014 － 07 － 11; 修回日期: 2014 － 10 － 07。
基金项目: 国家自然科学基金项目(31170612)。
* 林同为通讯作者。
松墨天牛 ATP合成酶 D亚基基因的鉴定与表达*
罗淋淋 吴华俊 林 同
(华南农业大学林学院 广州 510642)
摘 要: 【目的】研究松墨天牛 ATP 合成酶 D 亚基基因的鉴定及其表达特性，为开展昆虫 ATP 合成酶基因研
究提供分子信息和参考，为深入研究 ATP 合成酶基因在松墨天牛中的生理、毒理作用奠定基础。【方法】对从松
墨天牛 cDNA 文库中克隆的一条表达序列标签 (EST)进行 3 cDNA 末端快速扩增，将获得的扩增序列与 cDNA
文库中的序列进行拼接，经开放阅读框 (OＲF)检索和 Blast 同源比对鉴定基因; 用 ProtParam tool 软件分析基因
编码的蛋白质性质，用 DNAMAN 软件构建系统发育树，用实时荧光定量 PCＲ 分析基因在不同虫态、成虫各部位
和幼虫组织中的表达特性。【结果】获得了 1 条长度为 1 133 bp 的 cDNA，其 5端非编码区长 89 bp，3端非编码
区长 294 bp，OＲF 长 750 bp，编码 ATP 合成酶 D 亚基，命名为 MaATPSE ( GenBank 登 录 号: KM101044 )。
MaATPSE 编码 249 个氨基酸残基，预测分子质量为 28. 21 kDa，等电点为 9. 40，稳定系数为 31. 13。MaATPSE 含
有 3 个丝氨酸磷酸化位点、4 个苏氨酸磷酸化位点、2 个酪氨酸磷酸化位点和 1 个糖基化位点。松墨天牛与黑腹
果蝇和家蚕的 MaATPSE 相似性均为 83% ; 松墨天牛与赤拟谷盗在系统发育树上聚成一支，相似性为 87%，与其
他非鞘翅目昆虫的遗传距离较远。MaATPSE 在蛹和幼虫的相对表达量分别是成虫的 3. 70 和 2. 65 倍，各虫态之
间表达有显著差异(P ＜ 0. 05) ; MaATPSE 在幼虫各组织中均有表达，在脂肪体中的表达量最高，为对照的 5. 94
倍，其次是体壁和血淋巴，分别为对照的 3. 93 和 2. 88 倍; 中肠和马氏管的表达量较低，分别为对照的 0. 24 和
0. 28 倍; 除马氏管和中肠的相对表达量无显著差异外，各组织均有显著差异 ( P ＜ 0. 05)。MaATPSE 在成虫头、
腹、触角、足和翅的相对表达量分别为对照的 2. 24，3. 09，3. 52，3. 39 和 4. 45 倍，胸部的表达量较低，为对照的
0. 68 倍; 成虫各部位之间相对表达量有显著差异(P ＜ 0. 05)。【结论】克隆到松墨天牛 ATP 合成酶 D 亚基基因
MaATPSE，包括 5和 3非编码和完整的 OＲF。MaATPSE 与赤拟谷盗 ATP 合成酶最为相似，MaATPSE 在松墨天
牛幼虫、蛹和成虫中都有表达，在幼虫各组织和成虫各部位中广泛分布。
关键词: 松墨天牛; ATP 合成酶; 基因表达; ＲT-qPCＲ; ＲACE
中图分类号: S763 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2015)07 － 0060 － 09
Characterization and Expression of Subunit D Gene of ATP Synthase
from Monochamus alternatus
Luo Linlin Wu Huajun Lin Tong
(College of Forestry，South China Agricultural University Guangzhou 510642)
Abstract: 【Objective】Mitochondrial ATP synthase exists in the plasma membranes of bacteria，thylakoid membranes
of chloroplasts and the inner membranes of mitochondria，and is described as a splendid molecular machine，and a key
enzyme for energy conservation in mitochondria． The proton motive force generated across the membrane by electron flow
is used to drive the ATP synthesis from ADP and inorganic phosphate． The Japanese pine sawyer，Monochamus
alternatus Hope ( Coleoptera: Cerambycidae )， is a longicorn beetle that is notorious as a vector of the pinewood
nematode，Bursaphelen chusxylophilus ( Steiner etBuhrer) Nickle，which causes pine wilt disease． This beetle is widely
distributed in East Asian countries，including Japan，China and South Korea，vectoring the pine wilt disease there． The
objective of the present study is to provide molecular information and references for further researches on insect ATP
synthase gene，and physiological and toxicological functions of the ATP synthase gene of M． alternatus． 【Method】An
expressed sequence tag ( EST) from Monochamusalternatus cDNA Library was amplified by 3 rapid amplification of
cDNA ends． The cloned gene was characterized by splicing with the EST，open reading frame(OＲF) research and Blast
第 7 期 罗淋淋等: 松墨天牛 ATP 合成酶 D 亚基基因的鉴定与表达
homologous comparison． ProtParam tool and DNAMAN software were used to analyze the characteristics of deduced
protein and construct phylogenetic tree，respectively． The expression characteristics of the cloned gene at different
developmental stages and in different parts of adults and larval tissues of M． alternatus were analyzed by real time
quantitative PCＲ． 【Ｒesult】A cDNA with 1133bp length was cloned，containing a 89 bp at its 5 -UTＲ，a 294 bp at its
3 -UTＲ，and an OＲF of 750 bp which codes for ATP synthase D subunit designated as MaATPSE (GenBank accession
number: KM101044) ． The MaATPSE encodes 249 amino acid residues，and the deduced molecular weight，isoelectric
point and stability coefficient are 28 ． 21 kDa，9 ． 40 and 31 ． 13， respectively． The MaATPSE contains 3 serine
phosphorylation sites，4 threonine phosphorylation sites，2 tyrosine phosphorylation sites and 1 glycosylation sites． The
MaATPSE has 87% identity with Tribolium castaneum， 83% identity both with Bombyx mori and Drosophila
melanogaster，respectively． M． alternatus and T． castaneum are on the same branch in phylogenetic tree，and there is
a long genetic distance between M． alternatus and non Coleoptera insects． The relative expression level of MaATPSE in
pupae and larvae was 3 ． 70 times and 2 ． 65 times of that in adults，respectively． There was a significant difference in
expression among different developmental states (P ＜ 0 ． 05) ． The MaATPSE was expressed in various tissues of larvae，
the expression in fat body was highest，and 5 ． 94 times of that in control，and the expression in body wall and
hemolymph ranked the second，and was 3. 93 times and 2. 88 times of that in control，respectively． The expression in
midgut and Malpighian tubules was relatively low，and was 0 ． 24 times and 0 ． 28 times of that in control，respectively．
There were significant differences in MaATPSE expression among various larval tissues，except that between Malpighian
tubules and midgut ( P ＜ 0. 05 ) ． The relative expression level in adult head，abdomen，antennae，feet，wings and
thorax was 2. 24，3. 09，3. 52，3. 39，4. 45 and 0. 68 times of that in control，respectively． There were significant
differences in MaATPSE expression among various parts in adults ( P ＜ 0. 05 ) ． 【Conclusion】 The Monochamus
alternatus ATP synthase D subunit gene containing 5 -UTＲ，3 -UTＲ and a complete OＲF was cloned in this study． The
MaATPSE and ATP synthase of T． castaneum are the most similar at amino acid level． The MaATPSE is extensively
expressed in the larvae，pupae and adults，in various tissues of larvae and parts of adults of M． alternatus．
Key words: Monochamus alternatus; ATP synthase; gene expression; ＲT-qPCＲ; ＲACE
ATP 是细胞内绝大多数生命活动的直接能源物
质。在生物有机体中，生物体需要不断得到能量来
维持其一系列的代谢活动，其中 ATP 的合成是主要
的化学反应之一 (徐卫红，2004; 林江波等，
2014)。ATP 合成酶(ATP synthase) 是线粒体能量
守恒中的核心酶(Hong et al．，2008)，被描述为分子
机器(Boyer，1997)，广泛分布于线粒体内膜、叶绿
体类囊体、异养菌和光合菌的质膜上，其利用电子流
跨膜产生的质子原动力由 ADP 和无机磷酸盐合成
ATP，为生物体提供能量 (Mitchell，1966; 赵婷等，
2014)，能完成合成和水解真核细胞和细菌中 ATP
的双重任务(Cruz et al．，2012)。ATP 合成酶主要包
括 2 个功能不同的部分，即 F1 和 F0: F1 催化 ATP
的合成和水解; F0嵌合在膜上，是一个疏水蛋白复
合体，在膜内控制 H + 的运输 ( Arnold et al．，1988;
Leslie et al．，2000)。
迄今为止，微生物和植物 ATP 合成酶的研究
相对较多，昆虫 ATP 合成酶的研究极少，仅意大利
蜜蜂( Apis mellifera) (Younis et al．，2002; 2011) 有
相关报道。作为无脊椎动物，昆虫与微生物、植物
等有很大区别; 虽然同样具有 ATP 合成酶，但在
昆虫体内有其独特的作用机制。因此，克隆昆虫
ATP 合成酶基因，对研究其调控方式、表达模式，
进而分析其与昆虫能量转换之间的关系具有重要
意义。
Younis 等 (2002; 2011 ) 研究表明，DDT 可抑
制意大利蜜蜂 ATP 合成酶的水解活性。通过聚丙
烯酰胺凝胶电泳 ( PAGE)分析发现，昆虫酶活被
DDT 抑制与分子质量为 23 kDa 的蛋白有关。这一
蛋白存在于对 DDT 敏感的昆虫中，而在对 DDT 不
敏感的昆虫酶制剂中却缺失。如果从酶中移除该
蛋白，昆虫则表现为对 DDT 不敏感;如果将该蛋白
直接纯化，加入到对 DDT 不敏感的昆虫 ATP 合成
酶中，则 DDT 敏感性重新恢复。因此，ATP 合成酶
中的蛋白即是 DDT 的靶标蛋白。
松墨天牛(Monochamus alternatus Hope)又名松
褐天牛、松天牛，主要危害松树，是重要的蛀干害虫;
在 日 本 和 中 国，松 墨 天 牛 还 是 松 材 线 虫
( Bursaphelenchus xylophilus ) 病 的 主 要 传 播 媒 介
(Kobayashi et al．，1984;Yang et al．，1989)。松材线
虫与松墨天牛协同危害，对森林资源、自然景观和生
态环境产生了重大危害，给我国造成了巨大的经济
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林 业 科 学 51 卷
损失(杨远亮等，2013)。有效防治松墨天牛是控制
松材线虫传播的关键。化学防治是治理松墨天牛的
重要方法，但松墨天牛分子毒理的基础研究还较薄
弱，限制了农药的科学使用。DDT 作用于 ATP 合成
酶，对 ATP 合成酶的抑制作用与对目标生物的毒性
作用相类似; 且 DDT 对昆虫酶活的抑制作用是独
特的，与寡霉素或 N，N － 双环己基碳二亚胺
(DCCD)不同(Younis et al．，2002)，因此为探索不同
类型农药杀虫机制与 ATP 合成酶的关系提供了
参考。
本文从松墨天牛 cDNA 文库中克隆出 ATP 合
成酶基因相似序列，通过序列分析和氨基酸相似性
比较，推测其为松墨天牛 ATP 合成酶 D 亚基基因;
分析该基因在松墨天牛中的表达特性，旨在为开展
昆虫 ATP 合成酶基因研究提供分子信息和参考，为
深入研究昆虫 ATP 合成酶基因功能、能量代谢与农
药胁迫的关系、不同类型农药影响松墨天牛 ATP 合
成酶基因的表达模式以及科学指导松墨天牛防治实
践奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 供试天牛
松墨天牛幼虫由广东省林业科学研究院惠赠，
用人工饲料方式(徐金华等，2009)在避光的人工气
候箱内饲养至成虫，饲养温度为 25 ℃，相对湿度为
70%～ 75%。
1. 2 主要试剂
E． Z． N． A． TM Total ＲNA Kit II 总 ＲNA 提取试
剂盒购自 OMEGA 公司，3-Full ＲACE Core Set with
PrimeScriptTM ＲTase 试剂盒、LA Taq DNA 聚合酶、
pMD20-T Vector 试剂盒、大肠杆菌 ( Eescheria coli)
DH5 α Competent Cells、PrimeScript ＲT reagent Kit
With gDNA Eraser 反转录试剂盒、SYBＲ Premix Ex
TaqTM实时荧光定量试剂盒购自 TaKaＲa 公司，通用
型 DNA 纯化回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自天根
生物有限公司，IPTG、X-Gal 等试剂购自上海生工生
物工程有限公司。
1. 3 样本准备和总 ＲNA 提取
选取 30 头大小一致的 3 龄幼虫，清洗、体表消
毒、麻醉后，剪破腹足，轻压虫体，收集血淋巴于同一
无菌离心管中，用液氮迅速冷冻后放入 － 80 ℃冰箱
保存备用。将提取完血淋巴的幼虫固定在蜡盘上，
置于解剖镜下解剖，分离体壁、脂肪体、马氏管和中
肠，用 PBS 缓冲液冲洗后，将相同组织存放于同一
无菌离心管中，迅速用液氮冷冻，置于 － 80 ℃冰箱
内保存备用(孙猛等，2014)。分别取松墨天牛3 龄
幼虫、2 日龄蛹、2 日龄成虫、成虫头(去触角)、胸、
腹、足、触角和翅，加入液氮在研钵内研为粉末。用
Trizol Ｒeagent 提取总 ＲNA，操作按 Trizol 提取说明
书进行。
1. 4 引物合成
本实验室已经构建了松墨天牛 cDNA 文库(韦
春梅等，2014 )，从中克隆出一条序列与 GenBank
数据库中的序列进行 Blast 比对，得到与昆虫 ATP
合成酶基因的相似序列。根据此序列设计引物
(表 1)，用于后续 3 cDNA 末端快速扩增 ( rapid-
amplification of cDNA ends，3ＲACE)和实时荧光定
量 PCＲ (ＲT-qPCＲ)，以扩增基因 3末端进行基因全
序列拼接并用于基因表达分析。引物合成由上海生
物工程有限公司完成。
表 1 本试验中所用的引物
Tab． 1 Primers used in the experiments
引物 Primers 用途 Applications 核苷酸序列 Nucleotide sequences
通用引物(外)General primers( outer) ＲACE 5-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3
通用引物 (内)General primers( inner) ＲACE 5-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3
特异引物 (外) Specific primers( outer) ＲACE 5-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3
特异引物(内) Specific primers( inner) ＲACE 5- TCGAATGCTATCAAGACGGAACC -3
β －肌动蛋白 F β-actin F ＲT-qPCＲ 5-ATGTTAATGCAGGCTCGGCT-3
β －肌动蛋白 Ｒ β-actin Ｒ ＲT-qPCＲ 5-ATGTTAGCAGGCTCGGCT-3
ATP 合成酶 F ATP synthase F ＲT-qPCＲ 5-ATGTTAATGCAGGCTCGGCT-3
ATP 合成酶 Ｒ ATP synthase Ｒ ＲT-qPCＲ 5-ACCAACAGCTTTACGGCACT-3
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第 7 期 罗淋淋等: 松墨天牛 ATP 合成酶 D 亚基基因的鉴定与表达
1. 5 3cDNA 末端快速扩增
以特异引物(外)及试剂盒中提供的通用引物
(外) 进行第 1 轮 PCＲ，特异引物 (内)及通用引物
(内)通过巢式 PCＲ。PCＲ 反应条件: 94 ℃预变性
3 min;94 ℃30 s; 55 ℃ (第 1 轮)、58 ℃ (巢式) 30 s、
72 ℃ 1 min，35个循环; 72 ℃延伸 10 min。PCＲ 产物
经 1% 琼脂糖凝胶电泳分析。回收目的片段，与
pMD20-T 载体连接，转化大肠杆菌，挑选阳性克隆
测序。
1. 6 序列分析
将 ＲACE 反应测定的序列与 cDNA 文库中获得
的序列进行拼接，用 OＲF Finder 程序( http:∥www．
ncbi． nlm． nih． gov / gorf / gorf． html)分析开放阅读框
(OＲF)，用 Blast 程序 ( http:∥ blast． ncbi． nlm． nih．
gov /Blast． cgi ) 进 行 相 似 性 比 对，用 在 线 软 件
ProtParam tool ( http:∥ web． expasy． org / protparam /)
分析蛋白质结构。
1. 7 系统发育树
从 GenBank 数据库 NCBI ( http:∥ www． ncbi．
nlm． nih． gov /)中检索昆虫 ATP 合成酶的氨基酸序
列，用 DNAMAN 软件对松墨天牛 ATP 合成酶及其
他昆虫 ATP 合成酶进行相似性比对; 用 MEGA 4. 0
软件构建系统发育树(NJ 法)，自举检测 (bootstrap)
1 000 次计算树内各分枝置信度。
1. 8 实时荧光定量 PCＲ
以总 ＲNA 为模板，合成 cDNA 第 1 链; 以肌
动蛋白 ( β-actin) 为内参基因，无菌超纯水为阴性
对照，ATP 合成酶基因在 3 龄幼虫整体的表达量
为标准参量，ATP synthase F 和 Ｒ(表 1 )特异性引
物做 ＲT-qPCＲ，测定 ATP 合成酶基因在幼虫、蛹、
成虫整体以及幼虫体壁、脂肪体、血淋巴、中肠和
马氏管的相对表达量; 以 ATP 合成酶基因在成虫
整体的表达量为标准参量，测定其在 2 日龄成虫
头(去触角)、胸、腹、触角、足和翅的表达量。反应
条件为: 95 ℃预变性 5 min; 95 ℃变性 10 s、60 ℃
复性 20 s，共 40 个循环; 40 ℃冷却 30 s。反应仪
器为 LightCycler 480 荧光定量 PCＲ 仪，每个样品
设 3 次重复，反应结束后采集目标基因的 Ct 值和
内参基因的 Ct 平均值，利用 2 － ΔΔCt相对定量法计
算相对表达量( Livak et al．，2001)。采用 DPS 软件
的 Duncan’s 单因素方差分析法对 ＲT-qPCＲ 数据
进行统计分析。
2 结果与分析
2. 1 基因克隆与序列分析
本研究从本实验室已构建的松墨天牛 cDNA
文库中克隆一条表达序列标签 ( EST)，通过在线
Blast 比对，发现与昆虫的 ATP 合成酶 D 亚基基
因有很高的同源性。通过 3 ＲACE 反应，将获得
的扩增序列与 cDNA 文库中的序列进行拼接，最
终获得一条长度为 1 133 bp 的 cDNA。经 OＲF
检索和同源比对，发现该序列 5 端非编码区长
89 bp，3 端非编码区长294 bp，OＲF 长 750 bp，编
码 ATP 合 成 酶 D 亚 基，命 名 为 MaATPSE
( GenBank 登录号:KM101044 )。MaATPSE 编码
249 个氨基酸残基，推测的分子式为 C1 248 H2 063
N351 O369 S10，预测分子质量为 28. 21 kDa，等电点
为 9. 40，稳 定 系 数 为 31. 13，为 稳 定 蛋 白。
MaATPSE 含有 3 个丝氨酸磷酸化位点、4 个苏氨
酸磷酸化位点、2 个酪氨酸磷酸化位点和 1 个糖
基化位点(图 1)。
2. 2 序列比对和系统发育树的构建
昆虫的 D 亚基相似程度较高，相似性在 80%
以上。将 MaATPSE 与 NCBI 数据库中其他 17 种
昆虫的 ATP 合成酶氨基酸序列进行相似性比较
(图 2 )，结 果 表 明: MaATPSE 与 赤 拟 谷 盗
( Tribolium castaneum ) 最 为 相 似，与 黑 腹 果 蝇
(Drosophila melanogaster)和家蚕 ( Bombyx mori)的
相似性均为 83%。参与比对的昆虫种类和相应的
GenBank 登录号等信息列于表 2。基于昆虫 ATP
合成酶氨基酸序列构建的系统发育树 ( neighbor-
joining tree)显示，松墨天牛与赤拟谷盗聚成一支，
相似性为 87% (图 3)，与其他非鞘翅目昆虫的遗
传距离较远。
2. 3 松墨天牛 ATP 合成酶基因的表达特性
用实时荧光定量 PCＲ 分析了 MaATPSE 在不同
虫态、成虫各部位和幼虫组织中的表达特性，结果显
示: MaATPSE 在蛹和幼虫的相对表达量分别是成
虫的 3. 70 和 2. 65 倍，各虫态之间表达有显著差异
(P ＜ 0. 05) (图 4); MaATPSE 在幼虫各组织中均有
表达，其中在脂肪体中的表达量最高，为对照的
5. 94 倍，其次是体壁和血淋巴，分别为对照的 3. 93
和 2. 88 倍; 中肠和马氏管的表达量较低，为对照的
0. 24 和 0. 28 倍; 除马氏管和中肠的相对表达量无
显著差异外，各组织均有显著差异 (P ＜ 0. 05) (图
5)。在成虫头、腹、触角、足和翅的相对表达量分别
为对照的 2. 24，3. 0，3. 52，3. 39 和 4. 45 倍，胸部的
表达量较低，为对照的 0. 68 倍; 成虫各部位之间相
对表达量有显著差异(P ＜ 0. 05)(图 6)。
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林 业 科 学 51 卷
起始密码子 ATG 用下划线表示，终止密码子 TAA 以* 表示，特异性引物(外)以双下划线表示，特异性引物(内)以下划波浪线表示，3 个丝
氨酸磷酸化位点以下划粗线表示，4 个苏氨酸磷酸化位点以圆点表示; 2 个酪氨酸磷酸化位点以矩形表示，1 个糖基化位点以正方形表示，加
尾信号 AATAA 用矩形框标注。The translation start codon is underlined with a single line，and the stop codon is marked with asterisk． The specific
primer ( outer) is underlined with a double-underlined，three serine phosphorylation sites are marked in bold，four threonine phosphorylation sites are
designated with a dot，two tyrosine phosphorylation sites and a glycosylation site are designated with a rectangle and a square，respectively，the
polyadenylation signal AATAA is marked with rectangles．
图 1 MaATPSE 的核苷酸及推导的氨基酸序列
Fig． 1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of MaATPSE
表 2 参与序列比对的昆虫信息
Tab． 2 Information of insects used in the sequence alignment
昆虫名称 Insect name
GenBank 登录号
A GenBank accession No． 昆虫名称
Insect name
GenBank 登录号
GenBank accession No．
松墨天牛 Monochamus alternatus KM101044 丽蝇蛹集金小蜂 Nasonia vitripennis XP_001600508. 1
赤拟谷盗 Tribolium castaneum XP_975872. 1 点绛缘蝽 Ｒiptortus pedestris BAN20483. 1
褐透翅尖头叶蝉 Homalodisca vitripennis AAT01084. 1 埃及斑蚊 Aedes aegypti XP_001660426. 1
地中海实蝇 Ceratitis capitata XP_004523596. 1 蜡蝉 Peregrinus maidis AGJ51962. 1
家蝇 Musca domestica XP_005180029. 1 锥蝽 Triatoma infestans ABＲ27881. 1
人体虱 Pediculus humanus corporis XP_002432893. 1 豌豆蚜 Acyrthosiphon pisum NP_001119691. 1
湿木白蚁 Zootermopsis nevadensis KDＲ13105. 1 苜蓿切叶蜂 Megachile rotundata XP_003700155. 1
黑腹果蝇 Drosophila melanogaster NP_651987. 1 黑脉金斑蝶 Danaus plexippus EHJ69478. 1
军蚁 Cerapachys biroi EZA61236. 1 家蚕 Bombyx mori NP_001040286. 1
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第 7 期 罗淋淋等: 松墨天牛 ATP 合成酶 D 亚基基因的鉴定与表达
图 2 MaATPSE 与其他 17 种昆虫 ATP 合成酶氨基酸序列比对
Fig． 2 Amino acid sequence alignment of ATP synthase from M． alternatus and other insects
3 结论与讨论
松墨天牛虽然是重大害虫，但迄今为止还没有
进行过基因组测序。赤拟谷盗作为具有全基因组序
列的鞘翅目昆虫，为本研究提供了重要的数据资源，
MaATPSE 的开放阅读框的确定就是以比对赤拟谷
盗基因组为参考序列的。在克隆和拼接的基因序列
中，笔者找到了完整的开放阅读框、3末端 PolyA 尾
巴和加尾信号特征序列 AATAA; 通过同源比对，发
现克隆的序列与昆虫的 ATP 合成酶 D 亚基基因相
似，相似性在 80%以上; 相似性程度最高的是赤拟
谷盗，这也是比对到的唯一的鞘翅目昆虫。综上，笔
者推测克隆的基因为松墨天牛 ATP 合成酶 D 亚基
基因。
大多数昆虫的 ATP 合成酶 D 亚基或相似序列
由约 250 个氨基酸组成，在本研究中，克隆到的松墨
天牛 MaATPSE 的编码区编码 249 个氨基酸，与多数
昆虫 ATP 合成酶的长度一致。意大利蜜蜂 ATP 合
成酶 D 亚基(GenBank: XP394769)有 174 个氨基酸
(Younis et al．，2011)，与松墨天牛 MaATPSE 的相似
性为 82% ; 但其氨基酸序列和分子质量都不同于牛
心和鼠类肝脏，牛 ATP 合成酶没有同源物 (Higuti et
al．，1993)，鼠和牛相应的酶结构都含有 160 个氨基
酸，笔者也没有发现与松墨天牛 MaATPSE 相对应的
鼠或牛的相似序列。这表明昆虫与动物的 ATP 合
成酶基因无论是序列大小还是相似性都有较大
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林 业 科 学 51 卷
图 3 昆虫 ATP 基因系统发育树分析
Fig． 3 Phylogenetic relationships of ATP genes of insects
昆虫名称和 GenBank 登录号与表 2 相同。The origin names of insects，and the GenBank accession No． are the same as
those in Fig． 2 ．
图 4 MaATPSE 在松墨天牛各虫态的表达
Fig． 4 Expression of MaATPSE in
developmental stages of M． alternatus
差别。
蛋白质的磷酸化反应是把磷酸基团从一个化合
物转移到另一个化合物上的过程，是生物体内存在
的一种普遍的调节方式。真核细胞的蛋白质磷酸化
位点主要发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基侧链
的羟基上。在本研究中，生物信息学分析显示: 松
墨天牛 MaATPSE 含有 3 个丝氨酸磷酸化位点、4 个
苏氨酸磷酸化位点和 2 个酪氨酸磷酸化位点，这些
磷酸化表明 ATP 合成酶在细胞信号的传递过程中
发挥重要作用。MaATPSE 还含有 1 个糖基化位点，
图 5 MaATPSE 在松墨天牛幼虫
各组织中的表达情况
Fig． 5 Expression of MaATPSE in
various tissues of M． alternatus larvae
MaATPSE 经过糖基化作用，形成糖蛋白，这一修饰
对 ATP 合成酶的功能起调节作用。
Mangiullo 等(2008)从分离出来的正常组织的
细胞外表面，如鼠的肝细胞上发现了 ATP 合成酶。
肝脏在功能上和昆虫的脂肪体相似。本研究中的
ＲT-qPCＲ 分析显示，蛹、翅、脂肪体中的 MaATPSE
分别在 3 种虫态、成虫 6 个部位和幼虫 5 种组织中
表达量最高，这说明由于蛹中进行剧烈的组织和器
官的重构、翅行使飞行功能、脂肪体要进行中间代谢
66
第 7 期 罗淋淋等: 松墨天牛 ATP 合成酶 D 亚基基因的鉴定与表达
图 6 MaATPSE 在松墨天牛成虫各部位的表达
Fig． 6 The expression of MaATPSE in various
parts of M． alternatus adults
和一些生化合成、转化反应等，因而这些虫态或组织
器官的能量代谢处于较高的水平。此外，保幼激素
结合蛋白( JHBP)分子在脂肪体细胞中合成后，脂肪
体膜上的 ATP 合成酶与 JHBP 在脂肪体上相互作
用，利用 ATP 参与了 JHBP 分子的运输 (Mangiullo
et al．，2008)，这也可能是 MaATPSE 在脂肪体中高
表达的重要因素之一。笔者还发现 MaATPSE 在足
和触角中相对表达量也较高，这与足是重要的运动
器官、成虫触角在补充营养时经常摆动以搜寻食物
或配偶相适应。线粒体 ATP 合成酶结构复杂，由 5
种基本亚基构成，不同生物亚基组成不同。亚基增
加会使酶结构更加复杂，以激发酶的调节作用。虽
然 ATP 合成酶是 ATP 合成的复合酶，但 ATP 合成
酶还参与多种生物过程，如埃及伊蚊(Aedesaegypti)
中肠刷状缘中的 ATP 合成酶 β 亚基是细胞表面蛋
白复杂网络的组成部分 ( Paingankar et al．，2010);
在大蜡螟 (Galleria mellonella)脂肪体细胞中，ATP
合成酶作为 JHBP 膜结合蛋白，存在于线粒体、胞液
和质膜上，在 JHBP 蛋白运输中发挥作用 (Mangiullo
et al．，2008); ATP 合成酶是在烟芽夜蛾 (Heliothis
virescens)中肠膜蛋白质组中发现的 CrylAc 毒蛋白
的 结 合 蛋 白 ( Krishnamoorthy et al．， 2007 )。
Heazlewood 等 ( 2003 ) 鉴定了拟南芥 ( Arabidopsis
thaliana)的 ATP 合成酶 D 亚基，但其功能并不清
楚。Younis 等 (2011) 用 2D 凝胶和质谱分析方法
鉴定了意大利蜜蜂的一种 23 kDa 的蛋白，该蛋白是
ATP 合成酶 D 亚基和寡霉素敏感给予蛋白 (OSCP)
的混合物。DDT 和 OSCP、D 亚基的相互作用可能
会使 ATP 合成酶不能机械旋转，并阻碍 ATP 的合
成。D 亚基可能在与 DDT 结合和选择中发挥作用，
昆虫的这种选择性蛋白亚基也许在阻遏酶活中起关
键作用(Younis et al．，2011)，但昆虫可能缺失 ATP
合成酶基因 D 亚基蛋白，以此结构调节机制适应环
境中的农药胁迫。
本文克隆了松墨天牛 ATP 合成酶 D 亚基亚基
基因，并在 mＲNA 水平分析了其表达动态和在松墨
天牛重要组织、器官的表达分布特征，旨在为研究
ATP 合成酶基因在松墨天牛毒理中的作用和其他功
能奠定基础。下一步工作方向将是重点研究农药单
独与 D 亚基作用还是与其他亚基一起作用; 用 X
射线对农药与 ATP 合成酶各亚基的作用途径做出
清晰的展示，查看农药是如何贮藏于酶之中的，这样
就能为理解农药与酶的互作方式提供必要的分子结
构信息。
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(责任编辑 朱乾坤)
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