全 文 ：第 2 卷 第 2 期
1 9 8 9 年 4 月
林 业 科 学研 究 V O I
FO R ES T R ES E A R CH A P r
. ,
N o
。
2
1 9 8 9
外生菌根真菌纯培养的生态学研究 ‘
赵志鹏 郭秀珍
(中国林业科学研究院林业研究所 )
摘要 本 文研完 T B o le to s g r ise u s F ro s t . (灰盖牛肝菌) , B o le t u : s p . 和S uill: s
‘r o v illei (K lo tz . ) S in g . (厚环乳牛肝菌) s 株菌根菌在纯培养条件下对 温 度 、
p H
、 盐浓度和 水势等 4 个因子的 生态适应性 以 及同 油松和湿 地松纯培养合 成 菌 根
的能 力 。 结 果表明 , p H 和盆浓度对菌根菌生长的影响比较小 , 而 温度和水势则甘 真
菌的 生长具有很 大的 影响 。 其中 B . sP . 与 S。 g1 ev l’ ei 具有很强的 生态适应 能力 ,
而 B . g 石se u : 则稍差 。 此 外 , 结 果还表明 PE G 4 0 。可 能会促进菌根菌在液体 培 养
中的 生长 。 在菌根纯培养合成研 究 中 , 共 形 成 5 种菌根 , 其中 油 松 一 B . g 汀犯us
属新发现的外生菌根 。 5 种菌根中 , 以 油 松一 5 . 9 : e v illei和 湿 地 松 一刀 . 9 ; ise u s较
为理想。
关健词 外生菌根 , 真菌 , 生 态学
外生菌根在林业上的应用受到越来越广泛的重视 , 因而筛选优良菌株 , 通过生物工程的
方法商 品生产外生菌根真菌纯培养接种体 , 并应用于生产实践 , 成为一个很有前途的研究领
域 [ ’J。 1 9 了了年 J. M . T ra pp e[ Z J提出的选择优良外生菌根菌菌株的基本准则中 , 强调了菌根
菌的寄主广谱性及对生态的适应能力在菌根菌筛选中的重要性 。 其后 , 国外的菌根工作者先后
开展了这方面的工作 〔3 一 。〕, 但普遍缺乏系统性 , 而 国内这方面研究工作的报道却相当少。 本文
旨在探讨外生菌根菌对四个生态因子的适应能力 , 从而判定各生态因子在外生菌根菌筛选中
的重要性 , 同时还研究 T 3 种外生菌根菌同油松 (p in u s t a乡。 la 。! o ; 二 15 )和湿地松 (尸 . 。llio trii)
形成外生菌根的能力。
一 、 材料与方法
(一 ) 实验菌株与培养基
3 株菌根菌为 : 刀o le t u s g r is e u s Fr o s t . (灰盖牛肝菌 ) , B o le t u : s p . , 5 : izlu : g r e o illei
(K lo tz
.
) si n g
.
(厚环乳牛肝菌 ) , 分别从云南和北京采集分离。
实验中采用了两种培养基 ’》:
本文于五9 8 8年 1 0月 1 8 日收到。
· 本文系第 一 作者硕 士学位 论文研究工作的 一 部分。 在工作 中得到了 中国科学院毕国昌先生及本院王学 聘 、 旅莲的两位
老师的热情帮助 , 特此致谢。
” 郭秀珍等 , 19 助 , 林木的 两很及其研究方法 , 中国林业出版杜‘待 出版 )。
2 期 赵志鹏等 : 外生菌根真菌纯培养的生态学研究 13 7
PD A : 马铃薯 2 0 0 9 , 葡萄糖 2 0 9 , 琼脂 1 5一2 0 9 , 蒸馏水 1 0 0 0 m l。
MMN
:
C aC I
: 0
.
0 5 9 , K H : PO
‘
0
.
5 9
,
N aC I 0
.
0 2 5 9 , (N H
‘
) ZH PO
‘ 0 . 2 5 9 ,
M g S 0
4 · 了H : 0 0 。 1 5 9 , FeC 13 0 . 0 1 2 9 , V it B : 1 m g , 麦芽汁 (1 2一 i 8 B e ) IOo m l, 葡萄
糖 1 0 9 , 牛肉蛋白陈 1 5 9 , 蒸馏水 1 0 0 0 m l, p H 5 . 5一 5 。 7 0
(二 ) 温度效应[s1
将 3 个菌株分别接种到PD A 平板和含25 m l M M N 培养液的1 50 m l三角瓶中 , 每个处理
3 个重复 , 分别置于 5 ℃ 、 10 ℃ 、 15 ℃ 、 20 ℃ 、 25 ℃ 、 30 ℃ 、 35 ℃下进行培养。 PD A 平
板培养物每12 h 观测 1 次 , 记录菌落直径 。 MMN 三角瓶培养物在培养 15 d 后 , 过滤收集菌
丝体 , 然后置于 10 2 ℃下烘干 6 h , 测量菌丝体的干物质重量 。
(三 ) pH 效应 [”, ‘1
实验采用 S or ens e n 缓冲液〔‘。]初步调节经修改的M M N 培养液的 p H , 随后再分别用 IN
H C I和 iN K O H 准确调节培养液的 p H 至 4 、 5 、 6 、 7 、 8 、 9 。 该 p H 为培养基配制后
灭菌前的p H值 , 采用p H 81 一A 酸度计测定 , 待培养液灭菌后 , 再测 1 次实际 p H值。
修改后的 MMN 培养基为 : C a CI: 0 . 0 5 9 , N H ‘C I 0 . 0 2 5 9 , M g S O ‘· 7 H : 0 0 。 1 5 9 ,
FeC I
: 0
.
0 1 2 9
,
V it B ; 1 m g
, 麦芽汁1 0 0 m l, 蔗搪 1 0 9 , 牛肉蛋白膝 1 5 9 , 蒸馏水 1 0 0 0
m l
o
根据温度实验的结果 , 将B . gr ise us培养于20 ℃ , 而B 。 sP 。和S 。 g le 沉le f则培养于 30 ℃ 。
(四 ) 盐浓度效应I“J
培养及观测方法与温度和p H 实验相同 , 培养基中N aC I浓度分别为 o 、 2 、 4 、 6 、 8 、
1 0 9 / L
。
(五) 水势效应 16 〕
采用聚乙二醇 (PE G 4 0 0 0) 调节水势 , 依据 J. M e x ai 等 〔“]提出的对应 关 系 , 在MMN 培
养液中加入p E G 4 0 0 0 , 将其水势分别调节到。一 b a r 、 5 一 b a r 、 1 0 一 ba r 、 1 5 一 b a r 、 2 0 一 b a r 。
培养、 观测方法与以上实验相同。
为了试验PE G 4 0 0。是否会被菌根菌作为碳源利用 , 本文又进行了碳源实验 。 试验使用菌
根 M ye o r r h iz a 培养基 [‘0 ] : C aC 12 0 . 1 9 , N H ‘C I 0 . 5 9 , N a CI 0 . 1 9 , M g S 0 4 0 . 3 9 ,
K H ZPO
‘ 1 . 0 9 , FeC 13 0
.
0 1 9
, 葡萄搪 0 . 5 9 , 蒸馏水 1 oo o m l。 其中 , 碳源采用PE G 4 0 0 o
替代葡萄糖作为处理 , 而 以葡萄糖和无添加碳源作为对照 。 培养及测量方法同以上实验。
(六) 外生菌根菌同松苗纯培养合成菌根的研究 【卜 。, 川
以油松 (P in u s ta bu la efo ; m is) 和湿地松 (p . e llio trii)为寄主植物。 用于菌根菌接种体制
备的是V PMM N培养袋 (蛙石 : 泥炭 (1 : 1) + MMN 培养液) 。 纯 培 养的容器采用 20 x 2 . s c m
大试管 , 内装的培养物质为 : 蛙石 : 泥炭 (1 : 1) + MM N 培 养液 , 装量约为 1/ 3 。 对种子进行
层积、 温汤浸种和升汞表面消毒等一系列处理后 , 将种子移入装有湿滤纸圆片的培养皿内。
待种子发芽至 1一2 c m 后 , 将其移入经过灭菌的大试管内继续生长 , 至种皮脱落形成幼植株
后 , 向大试管内加入菌根菌接种体约 1 9 , 再适量加入无菌蒸馏水约 2一4 m l , 在试管 口上套
扎耐高温的塑料小袋 , 内衬纱布 。 每处理 20 个重复 。将培养物放入光照培养箱内 , 在 20 一30 ℃ ,
14 h / d 光照条件下 , 培养 6 个月。 每隔 2 月 , 加 1 次稀释MMN 培养液。
经 6 个月生长后 , 小心取出整个植株 , 自来水冲氏15 m in, 然后侧量松苗的生长参数 ,
13 8 林 业 科 学 研 究 2 卷
观察是否形成菌根及菌根化程度 , 对实验数据采用方差分析及 q 一检验法进行统计分析 。 取 1
段小根为材料 , 徒手切片 , 棉兰染色 , 光学显微镜下观察菌根形成情况及发育水平 。
二 、 结 果
(一) 沮度效应
图 1 显示了培养在PD A 平板上的 3 种菌根菌对温度不同的适应能力 。 图中每个菌株都由
最适与最差生长温度的生长曲线围成一个生 一长速度变化区 。 随着培养温度的变化 , 菌株的生
长曲线在该 区域内变化 , 因而该区域面积越小 , 斜率越大 , 说明菌株的温度适应能力越强 ,
生长越好 。
卿门朴洲Sgt. .卜1皿.1,..0.5.’32ƒ目„侧+长翻佃
‘ ’ “⋯ B . 夕ri s亡“s一 B . sP ·- - - -一 5 . 夕r e v ille ‘
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时I’q ( h )
图 1 示 3 种外生 菌根菌P D 八平板退度效应
的生长速度变化 区
退度 ( 5 、 1 0 , 1 5 ‘ 2 0 . 2 5 、 3 0 . 35 ℃ )
图 2 3 种外生菌根菌在M M N 三角瓶中生长
的沮度效应
整个实验结果表明 (图 1 , 2 ) , 温度对这 3 种菌根菌的生长有较大的影响。 其中 B . sP .
与 5 . gr ev l’ei 对温度变化的适应能力基本相同 , 都很强 , 生长也很快 , 而B . 91 15 。。s的适应
能力则稍弱 , 生长温度范围较窄 , 且在PD A 平板上生长较慢 。
(二 ) p H 效应
灭菌前后培养液的p H值有变化 ( 表 1 ) , 但加入Sor en se n 缓冲液的培养基同未加的相比 ,
加入的培养基p H值变动范围较小 , 为p H 4 . 0 一 8 . 1 50
裹 1 培养甚灭菌前后 pH 值的比较
培 养 基 侧定时间 . p H
M M N 夕
火 菌 芭了
灭 菌 后
9 0
6 0
So r e n s e n 一M M N
灭 菌 前
灭 菌 后
0 0
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p , ‘5 ⋯。,‘6 1 。于‘7 { p H S ⋯p ‘, 9
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由实验结果可以看出 (图 3 ) , p H 值的变化对 3 株菌根菌生长的影响比较小 , 3 株菌根菌
对 pH 变化的适应能力也比较强 。 其中B . 91 15 。。: 比较适宜于在酸性条件下生长 , S。 g le 厉“。i
熹中性 , 而 刀 . sp . 则偏碱性 , 但专一性并不强 , 相互差别较小。
仑期 赵志鹏等: 外生菌根真菌纯培养的生态李研究 1 39
(任。)理训她佃
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0.4.50.2
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4 5 6 7 8 9 4 5 6 7 8 9 4 5 6 7 8 9
培养液 p H
图 3 3 种菌根蔺在S o r e n s e n 一M MN 培养液中
生长的 p H效 应
时间 ( h )
3 种外生菌根菌 p D A 平板盐浓度效应的
生长速度变化区示意图
( 三 ) 盐浓度效应
盐浓度变化对这 3 株菌的生长影响很小 , 而真菌对盐浓度变化的适应能力也很强 ( 图 4 ,
5 )
, 可 以在所有测试的盐浓度下生长良好。 其中 B . sP . 在高盐浓度( 2 9 /1 以上 ) 下表现了
很强的生长能力 。 而 B . g : i s e u s 和 5 . 9 : e o flle i 则逊之 。
(四 ) 水势效应
菌根菌在 PE G 4 0 0 0一M y c o r r h iz a 培养液中不能生长 , 说明 PE G 4 0 0 0 不能做为碳源为
刀 . g r fs e u s 、 刀。 s p . 及 5 . g r e v ille f二3 株菌根菌所利用。
由实验结果可以得出结论 ( 图 6 ) , 水势对菌根菌的生长有相当大的影响 。 而所测试的 3
种菌根菌都表现出很强的耐旱 、 喜旱特性 , 在很低的水势下生长 极好 。 其 中 B . sP . 在 15
一 ba r 时的菌丝体生物量是 0 一 ba r 时的 8 . 5 倍 , B . g ; i s e u : 是 6 . 7 倍 , 而 5 . 9 ; e v flle f菌 丝
体生物量随水势的降低而不断提高 , 20 一 ba r 时的生物量是 0 一 bar 时的 3 。 7倍 。 总的来看 ,
以刀. s p . 耐旱生长能力为最强 , S 。 g ; 。。i lle i 和 B 。 g : is e u s 次之 。
(助„州十长翻阳
0.54.321
(灿)侧十耸创扭
N a C I 溶液浓度 ( g / L )
图 5 3 种外生菌根菌在 MM N 三角瓶中生长
的盐浓度效应
水势 ( 一 ba r)
图 6 3 种菌根菌在P E G ‘0 0 0 一MM N 培养液 中生长
的水势效 应
1 4 0 林 业 科 学 研 究 2 卷
(五 ) 菌根菌同松苗纯培养合成的外生菌根
通过整体及光学显微镜的观察 , 证明油松和湿地松同 3 种菌根菌共生能形成 5 种外生菌
根 (表 2 , 图版 工)。 其中 , 油松 一 B . g 汀se u : 菌根以前未有 过 报道 , 属新发现的外生菌 根 。
由表 2 的结果可 以看 出 , 在油松形成的 3 种菌根中 , 以油 松 一 5 . gr ev l’ri 为最仕 ; 而 湿地
松的 2 种菌根 , 则以湿地松 一 B 。 gr is e u : 较为理想 。
表 2 5 种外生菌根幼苗的生长今橄
一耳沐扮宙抽曹下渝⋯岚瞿加⋯囊”“伸势一梦· ‘ · ] 11· 2 · º }。·{i· } 于· i b {i · i资· i {· {i· ⋯竺·兰b , ⋯i·{i· { · ¹
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¹ 每 1 个 十 约10 % 的菌根化 , º a 、 b 、 c 表示差异显 著水平 , 具有相 同宇母的平均数值没有显著差异 ( P = 0 . 9 5) 。
三 、 讨 论
1 . 本文共研究了温度 、 p H 、 盐浓度 、 水势 4个生态条件对菌根菌生长的影响。 其中温
度和水势对菌根菌的生长影响极大 , 菌根菌的生长都有极限温度范围 , 同时在不同水势一下,
菌根菌生物量的差异相当大。 而 p H 和盐浓度对菌根菌生长的影响比较小 , 也说明菌根菌耐
极端 p H 条件和盐浓度影响的能力较强 , 而对温度和水势较为敏 感。 另 外 , B . 岁is e us 、 B .
s p
. 、
5
.
g o vl’lle i 3 种菌根菌在低水势条件下生长极好 , 预示着在某些菌根菌的培养 中 , 如
果加入 PE G 40 0 0 可能会增加菌丝体的生物量 。
2 . 在温度和盐浓度效应的研究 中 , PD A 平板实验与 MM N 三角瓶实验所得结 果 不 尽
相同 , 但总体上来说还是一致的 。 其中 PD A 平板生长反映了真菌二维生长的能力 , 而 MM N
三角瓶生长则反映了真菌菌丝体生物量的增殖情况 。 因为 PD A 平板实验比较简便 , 因 而是
一种生态条件实验的基本方法。
3 . 在选择各生态条件的实验范围时 , 除其它因素外 , 还应考虑到菌根菌寄主植物 生 长
的实地生态条件。 如选择适用于油松的菌根菌 , 就应考虑到北方的寒冷 、 干旱等因素 , 这样
才能有目的地筛选菌根菌 以适应生长环境 。
4 . 近些年来菌根工作者采用了许多新的菌根纯培养合成方法 。 而本文之所以采用 较 为
经典 、 周期较长的固体获质方法 , 主要是为了在纯培养条件下 , 除研究菌根菌与植物的共生
关系及菌根菌的寄主范围外 , 还能在接近实际生长条件下 比较不同菌根菌对寄主生长的促进
作用 , 以便于最后确定可应用的优良菌 株。
今 考 文 献
[ 1 〕 Pe t e r s o n ,
f o r e s t r y
R
.
L
. e t a l, 一, s‘, M y e o r r h i活a e a n d t he i r p o t e n t i a l u s e in t he a g r i e u lt u r a l a n d
i n d u s t r i e s , B i o t e e h
. z\d 、·5 . , 2 : 10 1一 120 .
2 期 赵志鹏等 : 外生菌根真菌纯培养的生态学研究 14 1
〔2 」 T r a p p e , J . M . , 20 7 了, S e lee t io n o f fu n g i fo r e e t o m y e o r r h i名a l in o e u la tio n in n u r se r ie s , A n n .
R e v
.
Ph y t o Pa th
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(S o w
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E u r
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Ph y to Pa t h o lo g ie a l So e ie t y
,
S t
.
P a u l
,
M in n
e s o t a
.
E COLOG IC AL ST UD IES ON EC TOMYC OR R H IZ AL
FUNG ! IN PU R E CULT U R ES
Z ha o Z hiPe n g G u o X iu z h e n
(T h e R e s e a r e h l ”: ti*u te o f F o r e str , C A F )
A b str a e t T h r e e e e to m ye o r r h iz a l fu n g i
,
B o le tu s g r ise左s , B . sP . a n d s左fllu s
g , ev illei
,
w er e e h o se n to b e st u d ied o n e e o lo g ie a l a d a Pta b ility to e n v ir o n m e n
-
ta l fa e to r s
, s u e h a s te m Pe r a tu r e
,
PH
, s a lt c o nc e n tr a t io n a nd w
a te r Po te n tia l
.
B鸽ld es , th e 3 fu n g i w e r e 崔犯d in Pu r e cu ltur e sy n t hes i3 o f Pf”赵 5 t a b u la ef盯m fs
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G ene r a lly
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s a lt e o n c e n tr a tio n h a d slig h t e ffe e ts o n th e g r o w th o f
ec to m y e o r r h iz a l fu lg i bu t t
em Pe r a tu r e a n d w a te r Po te n tia l h a d s tr o n g e ffe e ts
in th e ec o lo g ie a l a d a Pt a b ility e x Pe r im e n t s u sin g 3 fu n g i
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a d d itio n
,
it
,
5 ev id e n t th a t PE G 一4 0 0 0 e a n a e e ele r a te th e g r o w t h o f e e to m ye o r -
r hiz a l fu n g i in liq u id
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In th e Pu re e u ltu r e sy n thes is
,
fiv e ec t o m ye o r r hiz a e w e re fo r m e d
,
in w hieh
P
。
t a乙忍la efo , 机15 一 B 。 g r ise u s w e r e d isc o v e r e d fo r th e firs t tim e . P 。 t a bu la elo 了-
m is 一 S 。 g r e刀 illei a n d P 。 e llio t才11 一 B 。 g , ise 赵5 a r e be tte r o n es o f th e 5 m ye o r -
r hiz a e
-
苏e y w or d s eC to m yc o r r hiz a e : fu 鳍i ; e c o lo g y
赵志鹏等 : 外生菌根真菌纯培养的生态学研究 图版 工
1
. 湿地松 一 B . g 石se u s 外生菌根二分叉的形态特征 , 只0 X , 2 . 形 成初期 的湿 地 松 一 B . g 八招 “s 外 生菌根
4 00 0 x 一 3一年生的湿地松 一 B . g r ‘s e o s 外生 菌根 , 4 0 0。又 。 其 甲 ; M—菌套 ; H—哈蒂 氏网 。