全 文 ：第 3 卷 第 6 期
1 9 9 0 年 1 2 月
林 业 科 学研 究
FO R E ST R E S EA R C H
V o l
.
3 , N o
.
6
D e e
。 , 1 9 9 0
苏云金杆菌发酵条件的研究
五 . 8 3 0 0 2菌株在1 4 1、发酵罐发酵条件与制剂生产
王学聘 戴莲韵
(中国林业 科学研究院林业研究所 )
摘要 以 苏云金杆菌8 3 0 02 菌袜在 14 L 发 酵难 条件下研究表明 : 培养温度和 搅
拌速度对菌数表现 出一 定的相 关性 , 但 ,扫吝养墓 p H 变化规律影响不 大 ; 培养基灭菌
前的初始 pH 值 高低衬发酵过程 中 p H 变化规律有一 定影响 , 培养温度 、 搅拌速度 、
培养基灭 菌前 p H 位 高低对发酵过程 中培养基 C 、 N 变化的规律均表现 出一定影响 。
上述结果 , 为苏云金杆菌发酵条件参数提供 了依据 , 确立 了各种剂型的制备工艺 。
关健词 苏云金杆菌 ; 发酵条件 , 剂型
在微生物杀虫制品的商品性生产中 , 除选择优良菌株外 , 尚需维持菌株的最佳生长条件
以获得 高产和优质 。 在苏云金杆菌制剂生产中 , 产品的杀虫活性是衡量制剂质量 的 主 要 标
准 , Maj u m b cr (1 9 6 6 )认为苏云金杆菌的杀虫活性取决于附有菱形伴袍靛l体 的活抱子 川 。 一
些学者还报道了苏云金杆菌不 同血清型在杀虫活性方面的差异 , D al m a g e (1 9 7。) 指出 杀虫
活性不仅取决于苏云金杆菌的品系 , 而且也与培养基成份有关 IZ J。 我们的试验结果进一步阐
明了即使在苏云金杆菌同一品系中的不同菌株 , 对目的昆虫的杀虫活性也表现出差异 。 同时
提 出 , 只有同一菌株在同一培养基上 , 其活抱子数与杀虫活性才有明显的相关性 :a] 。 在上述
试验基础上 , 本文以分离和筛选的一株优 良苏云金杆菌— 8 3 0 0 2菌株 , 在确定其发酵培 养基 后 , 用 14 L 发酵罐研究其发酵过程与培养温度、 搅拌速度 、 PH 变化的相 关性及其剂型 ,
现将结果报道如下 。
一 、 材料和方法
(一 ) 菌种来源
本试验所用菌株为8 3 0 02 , 菌种鉴定详见参考文献〔3〕。
(二 ) 发醉培养甚主要成份
玉米 面 0 . 5 % ; 豆 饼 粉
N a ZHPO
‘ 0 . 0 3 % ; Ca C0
3 0
.
1 % -
1 写 。
(N H
‘
)
2
5 0
‘
0
.
0 3 % ; M g SO
‘ 0 . 0 3 % ,
(三 ) 培养方法
1
. 种子制 备 取培养 4 天 (3 。士 1 ℃ )的克氏瓶 , 用 1 0 m l无菌蒸馏水洗下菌 苔 制 成
菌悬浮液 , 经同步处理后 为一级种子 。
本文于 19 9 0 年 5 )J 2 3 [l收 到。
6 期 王学聘等 : 苏云金杆菌发酵条件的研究 54弓
2
。 发酵罐培养 采 用 14 L 发 酵 罐 (L 。 E . MA R U B ICH I. C O 。 LT D 。 M J一N 一14 L
3
.
Ja Pa n)
, 装液量 S L 进行一级发酵培养试验 , 其温度 、 搅拌速度、 p H 值测试和通风量均
为自动控制 。
3
。 发酵罐灭菌 用M O D E L H K SE R IE S 全自动高压灭菌器 (M OD E L : H K 一53 oE,
H IR A YA M A M A N U FA CT U R IN G CO R PO R A T ION
,
Ja pa n )
,
2 2 7 ℃灭菌 4 0 m in 。
4
。 接种量 为一个克氏瓶的菌悬液 。
(四 )菌数浦定
采用常规血球计数板方法间 。
(五 ) 培养基全氮(N )、 有机碳(C )侧定
培养基经灭菌 , 在接种前和接种培养后 1 6、 20 、 24 、 28 五取一定量经 5 。。。r / m in 离心
20 m in ( 4 ℃ ) , 取上清液进行分析 。 全氮采用凯氏定氮法一一瑞士布奇 (B U CH I 3 2 2) 全 自
动定N 仪测定 , 有机碳采用重铬酸钾法闹 。
(六 ) 乳化荆的选择
1
. 乳化 AlJ 的种类 选用以下 9 种乳化剂 : OP一4 , OP- 了, O P一 1 0 , 乳百灵 A , 平 0 5 一1 5 ,
平 A ‘2 0 , JE C , 油酸三异丙醇油醋 , 吐温(T W e e n )一8 0 。
2
. 选择方法 采用钢圈琼脂平板法 (杯碟法) [4l , 将混有被测菌株菌悬液的培 养 基 , 倾
入 中 9 c m 培养皿内 , 待凝固后放入内径 6 m m 的灭菌不锈钢圈 , 将待测乳化剂定量放于不
锈钢圈 内, 于 30 士 1 ℃培养 , 观察其抑菌圈大小。
二 、 结 果
(一) 培养温度与培养基全N 、 有机C、 pH 变化和菌数的相关性
在培养基初始 p H 、 搅拌速度、 通风量相同的条件下 , 进行了培养温度试验 , 分别 选用
25
、
30
、
35 ℃ 。 不同时间取样 , 测定培养基 N 、 C 、 p H 和菌数 , 其结果见 图 i 。 从 中可见 ,
不同培养温度培养基 p H 值变化 规律 基 本
相同 , N 、 C 在 16 h 以前25 ℃培养表 现为
上升趋势 , 30 ℃ 和 35 ℃培养表现 为下降 趋
势 , 2 5 ℃ 培养菌数高 峰为 28 h , 30 ℃ 和
35 ℃培养分别为24 h 和 16 h 。 在35 ℃培养
时 , 2 8 h 已有 1 / 4 ~ 1/ 3菱形晶体脱落 , 可见
培养温度高可相应缩短发酵周期 , 反之则相
应延长 。
(二) 搅拌速度与培养墓全 N 、 有机C 、
pH 变化和菌数的相关性
在培养基初始 pH 、 培养温度和通风 量
均相同的条件下 , 进行了搅拌速度 分 别 为
1 0 0
、 1 7 5 rPm 和 2 5 0 r Pm 试验。 不同 时间
r
1 6 2 0 2 4 2 8
人尸司了
闷
,
- 一 谧饭 、 口声‘二1 撼叫
君4 2 8
图 1 培养温度与培养蓦 N 、 C 、 p H 变化
和菌数的相关性
取样 , 测定培养基 N 、 C、 p H 和菌数 , 其结果见图 2 。 从中可见 , 搅拌速度对培养基 p H 变
化规律影响不大 , 但 1 0 0 r p m 时PH 值回升过慢 , 在28 h p H 值为5 . 7 , 因此使其菌 数 呈下降
亏46 林 业 科 学 研 究 3 卷
趋势 , 搅拌速度对培养基N 、 C变化规律影响不大 , 只是在 1 0 0 r p m 时 , 16 h 以前无 下 降
或略有下降趋势 。 1 7 5 r p m 和 2 5 0 r p m 其菌数高低 差异不大 , 但 2 5 0 r p m 在 2 8 h 已有 1 / 4
~ 1 / 3的菱形晶体脱落 , 可见搅拌速度高可相应缩短发酵周期 。
一 ‘·”
i
一加上 一写了 . ‘茄一亥不犷-一已\华戴翅乡一
八d,妇1上U心U
闪\理浅书体
沪℃人z九0工d
占气t -茄一亥一2 8 0 ” 1 6 2 0 2 4 丽发酵时间 (h )一 10 0 rP m ~ 一17 5 rP 清一 ‘ “ 一 ‘ . 2 5 0 rP m图 2 搅拌速度与培养基 N 、 C 、 p H 变化
和 菌数 的相关性
( 三 ) 培养签灭菌前 pH 值与培养 荟全
N
、 有机 C 、 pH 值变化和菌散的相关性
在培养温度、 搅拌速度、 通风量均相同
的条件下 , 培养基灭菌前 p H 值 分 别 调 至
6
. 。、 7 . 0和8 . 5 , 不同时间取样, 测定 培 养
基 N 、 C 、 p H 和菌数 , 其结果 见 图 3 。 从
中可见 , p H为 6 . 。和7 . 。时 , 发酵过程中 p H
变化在20 h 以前不出现下降趋势的规律 , p H
为 8 . 5时在 16 h 以前则 出现下降趋势 , 对培
养基 C 的变化规律影响不大, 而对 N 的变化
在 pH S . 5时 , 16 h 以前呈下降趋势 , 而 p H
6
.
0和 7 . 0时未见下降趋势 , p H 值对其菌数影响不大 。
( 四 ) 苏云金杆菌荆型的研究
1
. 乳化剂的筛选 用 9 种乳化剂对苏云金杆菌 8 3 0 02 菌株进行了抑菌试验 , 其结果见图
4
。 从中看出乳化剂 0 R 4 、 OP一7 、 油酸三异丙醇油醋对苏云金杆菌 8 3 0 0 2菌株无抑菌作用。
油酸三异丙醇油醋在常温下为膏状物 , 使用不便 , OR 4 、 0 R 7 均可用做苏云金杆菌制剂的
乳化剂 , 吐温一80 对 8 3 0 0 2 菌株也无抑菌作用 , 它在苏云金杆菌制剂中既可做乳化剂又 可 用
作分散剂 。 其它几种乳化剂对 8 3 。。2菌株表现出程度不等的抑菌作用。 其中以乳百灵A 和 JE C
最为突出 。
八闷\巴路易体
一 p H 6 . 。~ ’一 p晰 . 尹 - - 一 pH S . 5图 3 培养基灭菌前 p H 与培养墓 N 、 C、 p H
变化和菌数的相关性
图 4 乳化剂抑菌比较试验
1
.
O P一‘, 2 . O P一 7 , 3 . O P 一 1 0 , 4 . 乳一 灵 A ,
5
. 平 0 5 一 1 5 , 6 . 平 A 一 2 0 , 7 . J E C , 8 . 油酸三
异丙醉 油酷 , 9 . 吐温 一 80
2
. 苏云金杆菌不 同剂型的制备工 艺 小试 产 品 的 工 艺 基 本 上 按 D ul m a g e , et al ·
( 1 9 7 0 ) 的袍子一晶体回收方法 四 , 获得高菌数的粉剂再使用不同的乳化剂制备出油乳剂 和 乳
剂或悬乳剂的小试产品 。 在该工艺中也可以将离心分离的产物直接配制成悬乳剂 , 同样取得
较好效果 。
6 期 王学聘等 : 苏云金杆菌发酵条件的研究 5 4 7
三 、 讨 论
(一) 在苏云金杆菌发酵过程中 , 培养温度、 搅拌速度及培养基初始 p H 等最佳条 件 选
择 , 必须综合考虑 , 才能获得满意的结果 。 至于培养基 N 、 C 、 p H 变化与菌 生理代谢之向
的相关性 , 有待进一步研究。
(二 ) 试验表明 , 8 3 0 0 2菌株最佳发酵岗位参数 (对 14 L 发酵罐而言 ) : 培养温度30 士 1℃ , 搅
拌速度25 0 r p m , 培养基灭菌前初始 PH S 左右 , 既能减少动力消耗 , 又能达到最佳放罐要求 。
(三) 在苏云金杆菌生产中对数生长期之后 , 抱子囊形成后期 , 菱形伴抱晶体脱落 之 前
出现的菌数减少现象 , 可能是由于菌体自溶所致。 因此 , 要控制好放罐时间, 才能获得高菌
数和质量好的产物 , 一般在显微镜观察出现 1 / 3 ~ 1/ 4 的菱形伴抱晶体脱落时即可放罐提取 。
(四 ) 采用本试验所确定的苏云金杆菌后提取工艺流程 , 可获得含抱 量在 1 0 0 亿 / g 以
上高菌数粉剂 , 为制备适于林业用的液剂、 悬乳剂 和油乳剂提供了原料 , 保证了制剂的质量 。
参 考 文 做
〔i 〕 B u r g e s , H . D . , 1 0 7 1 , M ie ro b !a l e o n tr o l o f in s e et s a n d m ite s , A e a d e m ie Pr e ss .
仁2 二D u lm a g e , H . T . , 1 9 7。, Pr o d u e tio n o f sp o r e 一e n d o t o x in e o m p le x by v a r ia n t s o f B a e illo s t人。卜
io g ie o s fs in t w o fe r m e n ta t io n m e d ia
,
J
.
o
j l
。。 e r t . P a th
. ,
I G: 5 5 5 ~ 35 6
.
〔3 〕 王学聘等 , 1 98 5 , 苏云金杆菌发酵条件的研究 1 . 发醇条件 与昆虫毒性之间 的 相 关 性 , 林 业 科 学 , 2 4 (3) : 2 91 ~
2 9 6
。
〔4 〕橄生物研究 法讨论会编 , 1 9 7 5( 程光胜等译 , 1 9 8 1 ) , 微生物学实验法 , 科学 出版社。
〔5 〕 中国土坡学会农业化学专业委员会编 , 1 9 8 3 . 土坡农业化学常规分析方法 , 科学出版社 。
〔6 〕 D u lm a g e , H . T . e t a l . , 1 9 70 , C o p r e e ip it a ti o n w ith la e t o s e a s a rn e a n s o f r e e o v e r in g t h e
s p o r e
一 e r y s ta l e o m p le x o f B a e‘!Iu s t人“r￡”夕‘e ”s‘s , J . I n口 e r t . P a *h . , 1 5 : 1 5一 2 0 .
ST U D IE S ON TH E FE R ME NT AT !ON OF B A C IL LU S
TH U R IN G IE N S IS
1
.
FE RME NT AT IV E COND IT ION O F 1 4L FER ME NT O R
AND PR EPAR AT !ON PR ODU CT !ON
W an g X u ePin D a i Lian yu n
(T ho R 。 了口a r e h 1 0 5 *‘to re o f F o r口 str梦 C只F )
A b str a et In th is 那Pe r , th e r e la t ion shiP b e tw e e n the e u lt u r e te m Pe r a t u r e ,
sPe e d o f a g itat io n
,
th e PH b efe r e au to e la v in g w ith the v ar ie s o f N
,
C
,
p H
o f m e d iu m a n d b a e t e r ia l n u m b e r s d u r in g fe r m e n ta t io n Pr o e e s s w e r e stud i
e s
b y i 4L fe r m e n t o r
.
T h e e u lt u r e t e m Pe r a tu r e a n d sPe e d o f a g ita t ion a r e in
r e la t io n to ba e te r ia l n u m b e r s
.
T h e s ta r t in g PH be fe r e a u t o e la v in g o f m e d iu m
b e a r a r e la t io n t o PH v a r ia t io n d u r in g fe rme
n ta t iv e p r o e e ss
.
T h e e u lt u r e
te m Pe ra t u r e
, sPe e d o f a g ita t io n a n d s t a r t in g PH v a lu e h a v e a n e ffe t o n N
,
C o f th e m e d iu m
.
T e e h n o lo g ica l Pr o e e 3 s o f Pr e琳ra t io n t yPe o f B a c illu s
thu , in g ie件sfs h a s b e e n d efin ed
.
K ey w or d s B a c fll“5 th“r in g fe 刀s犷s ; fe r m e n ta t iv e e o n d itio n : Pr ePa r a t io n t yPe