全 文 ：※生物工程 食品科学 2014, Vol.35, No.17 165
产黄樟素内生真菌交链孢霉LJX27的
发酵条件优化
徐 洲1,2，尹礼国1，张 超1,*，魏 琴2
（1.宜宾学院生命科学与食品工程学院，四川 宜宾 644000；2.发酵资源与应用四川省高校重点实验室，四川 宜宾 644000）
摘  要：以岩桂内生真菌交链孢霉（Alternaria）LJX27为研究对象，通过单因素试验研究各发酵工艺因素对黄樟素
产量的影响，在此基础上通过二次通用旋转组合设计和响应面法优化黄樟素发酵工艺参数。结果表明：交链孢霉
LJX27在初始pH 8、发酵温度 24 ℃、转速200 r/min、培养5 d的条件下，黄樟素产量最高，达2.13 g/L，比优化前黄
樟素的产量提高了67.72%。各因素对黄樟素产量的影响大小为初始pH值＞发酵时间＞发酵温度＞转速。该回归模
型可以用于优化黄樟素的发酵条件。
关键词：二次通用旋转组合设计；岩桂；黄樟素；发酵条件
Optimization of Fermentation Conditions of Alternaria LJX27 for Safrole Production
XU Zhou1,2, YIN Li-guo1, ZHANG Chao1,*, WEI Qin2
(1. College of Life Science and Food Engineering, Yi Bin University, Yibin 644000, China; 2. Key Laboratory of Fermentation
Resource and Application of Institutes of Higher Learning in Sichuan Province, Yibin 644000, China)
Abstract: The objective of this study was to optimize fermentation conditions of Alternaria LJX27 (an endophytic fungus
from Cinnamomum pauciflorum) for enhanced production of safrole by response surface methodology with quadratic general
rotary composite design. The production of safrole was investigated with respect to fermentation conditions including
inoculum amount, pH, fermentation temperature, fermentation time and shaking speed. Fermentation experiments performed
under the optimal conditions: medium pH 8; temperature, 24 ℃; shaking speed, 200 r/min; and incubation time, 5 d; resulted
in maximum production of 2.13 g/L, which was 67.72% higher than that obtained before optimization. Safrole production
was affected in decreasing order by initial medium pH, fermentation time, fermentation temperature and shaking speed. Our
investigations indicated that the developed regression model was applicable for optimizing the fermentation conditions for
safrole production.
Key words: quadratic general rotary composite design; Cinnamomum pauciflorum; safrole; fermentation condition
中图分类号：TS201.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）17-0165-05
doi:10.7506/spkx1002-6630-201417032
收稿日期：2014-05-30
基金项目：四川省科技厅应用技术研究与开发项目（2009JY0057）；宜宾学院科研启动经费项目（2009Q27）；
四川省高校科研创新团队建设资助项目（14TD0031）
作者简介：徐洲（1984—），男，讲师，博士研究生，研究方向为发酵工程。E-mail：zhxu23@126.com
*通信作者：张超（1966—），男，教授，博士研究生，研究方向为发酵工程。E-mail：chzh6122@126.com
黄樟素又称黄樟油素、黄樟脑，是合成胡椒基丁
醚、洋茉莉醛、异丁香酚、香兰素等系列产品的重要原
料 [1-2]，现已成为我国出口创汇的一种重要资源。由于
以黄樟素为原料的市场需求量日益增加，其在国际贸易
市场上长期处于供不应求的局面，致使近年来樟属类植
物，特别是针对黄樟树的砍伐盗挖问题日趋严峻。为了
保护植被，避免对生态环境的进一步破坏，各国先后制
定限制刨取黄樟树根的环境法规，巴西政府甚至严令禁
止破坏黄樟树的任何行为[2]。因此，在天然樟树资源日趋
枯竭的情况下，寻找一条替代天然樟属植物产黄樟素的
途径已成为相关研究者的必然选择。微生物因其具有繁
殖速度快、发酵周期短、节能环保的优点，而备受研究
者青睐，国内研究人员已经开始利用油樟内生真菌发酵
生产黄樟素。
岩桂（Cinnamomum pauciflorum）是四川省宜宾市
筠连县、珙县的一种特有的樟属、樟科植物资源[3]，其中
岩桂精油中黄樟素的比例高达90%～95%[4]。本课题组在
前期研究工作中，从岩桂叶中分离得到了一株具有抑菌
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活性的交链孢霉属（Alternaria）内生真菌LJX27，该菌
对灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）有较强的抑制作用。进
一步研究发现，LJX27能够发酵产生一定量的黄樟素，但
是在原有的实验条件下黄樟素的产量偏少、发酵条件苛
刻，有必要继续深入研究和改良其发酵条件。
二次通用旋转组合设计（quadratic general rotary
unitized design）具有准确性高、综合性好、系统性强、信
息量大等优点，现已被广泛应用于生产和科学实验[5-6]。为
了提高交链孢霉 LJX27产黄樟素的量，本实验在单因素
试验的基础上[7]，采用二次通用旋转组合设计，考察各因
素对交链孢霉 LJX27 发酵产黄樟素的影响，确定各因素
的最佳水平并建立数学模型，以期为深层次利用该菌株
产黄樟素提供技术参考和实验依据。
1 材料与方法
1.1 菌种、培养基与试剂
经18S rDNA序列分析技术鉴定为交链孢霉属（Alternaria）
的内生真菌LJX27，分离纯化于四川省宜宾市筠连县的岩
桂叶，菌种保藏于发酵资源与应用四川省高校重点实验
室，发酵产黄樟素的量为1.27 g/L。
PDA固体培养基、葡萄糖硝酸铵液体培养基。
乙醚、盐酸、磷酸二氢钾、乙酸钠、硝酸铵、硫酸
镁等试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
GC7890F气相色谱仪 兰州中科安泰分析科技有限
责任公司；HZQ-QX摇床培养箱 哈尔滨东联电子技术
开发有限公司；AR2130电子天平 美国奥豪斯仪器有
限公司；DHG-9145A恒温干燥箱 上海精密仪器仪表有
限公司。
1.3 方法
1.3.1 孢子悬浮液制备
将在实验室保藏的菌种LJX27转接到PDA斜面培养
基中，28 ℃条件下培养 72 h，随后用无菌生理盐水洗下
PDA斜面培养基上的孢子，转移到三角瓶中，用磁力搅
拌器搅拌10 min，备用。
1.3.2 单因素试验
1.3.2.1 发酵温度对黄樟素产量的影响
在初始pH 6、转速150 r/min、发酵时间5 d、接种量
2%、装液量100 mL条件下，测定不同发酵温度（20、
22、24、26、28 ℃）下黄樟素的产量。
1.3.2.2 接种量对黄樟素产量的影响
在发酵温度22 ℃、初始 pH 6、转速150 r/min、发酵
时间5 d、装液量100 mL条件下，测定不同接种量（1%、
2%、3%、4%、5%）下黄樟素的产量。
1.3.2.3 发酵时间对黄樟素产量的影响
在发酵温度22 ℃、初始pH 6、接种量2%、转速
150 r/min、装液量100 mL条件下，测定不同发酵时间
（3、4、5、6、7 d）下黄樟素的产量。
1.3.2.4 初始pH值对黄樟素产量的影响
在发酵温度 22 ℃、转速150 r/min、发酵时间5 d、
接种量2%、装液量100 mL条件下，测定不同初始pH值
（4、5、6、7、8）[8]下黄樟素的产量。
1.3.2.5 转速对黄樟素产量的影响
在发酵温度22 ℃、初始pH 6、发酵时间5 d、接种量
2%、装液量100 mL条件下，测定不同转速（100、150、
200、250、300 r/min）下黄樟素的产量。
1.3.3 响应曲面法优化发酵条件
在上述单因素试验基础上，在初始pH值、发酵温度[9]、
转速、发酵时间和接种量5 个因素中选取4 个影响作用较
大的因子，以黄樟素产量作为响应值，进行四因素二次
通用旋转试验设计优化。
1.3.4 色谱条件
色谱柱为AE.SE-54（15 m×0.25 mm，0.33 μm），
柱温145 ℃，进样温度250 ℃，检测器温度280 ℃，进样
体积1 μL，定量方法为外标峰高法。
1.4 数据分析
采用DPS7.05数据处理系统进行方差分析、显著性检
验[10]，使用Design Expert 7.1.3软件进行响应面法交互效
应分析[11]。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 发酵温度对黄樟素产量的影响
1.4
1.2
1.0
1.3
1.1
0.9
0.8
2220 24 26 28থ䝉⏽ᑺ/ć0.7咘ῳ㋴ѻ䞣/ ˄g/ L ˅
图 1 发酵温度对菌株LJX27产黄樟素的影响
Fig.1 Effect of fermentation temperature on the production of safrole
由图1可知，温度对黄樟素的产量有明显影响。温度
太低不利于LJX27菌体的生长和代谢，温度过高菌体易衰
老而影响其代谢产物的积累。内生真菌LJX27的临界温
度为24 ℃，当发酵温度在20～24 ℃区间时，黄樟素产量
随温度升高而增高，温度达24 ℃时代谢产物产量达到最
高，随后产量随温度上升而降低。
※生物工程 食品科学 2014, Vol.35, No.17 167
2.1.2 接种量对黄樟素产量的影响
1.2
1.0
1.3
1.1
0.9
0.8
21 3 4 5᥹⾡䞣/%0.7咘ῳ㋴ѻ䞣/ ˄g/ L ˅
图 2 接种量对菌株LJX27产黄樟素的影响
Fig.2 Effect of inoculum amount on the production of safrole
由图2可知，不同接种量对黄樟素的产量具有较大
的影响。接种量过少，菌体生长缓慢，产油量较低，随
着接种量的增加，黄樟素的量逐渐上升，当接种量为4%
时，黄樟素产量达到最高，为1.21 g/L。之后随着接种量
进一步增大，黄樟素产量反而下降。这可能是由于发酵
液中的营养物质主要用于菌体细胞增殖，有大量的代谢
废物生产[12]，抑制了菌体的进一步发酵产黄樟素。
2.1.3 发酵时间对黄樟素产量的影响
1.2
1.0
1.3
1.1
0.9
0.8
43 5 6 7থ䝉ᯊ䯈/d0.60.7咘ῳ㋴ѻ䞣/ ˄g/ L ˅
图 3 发酵时间对菌株LJX27产黄樟素的影响
Fig.3 Effect of fermentation time on the production of safrole
由图3可知，在一定时间范围内，随着培养时间的延
长，黄樟素的产量也随之逐渐增加，第3天到第6天增长速
率较大，第6天时黄樟素产量达到最大值，为1.18 g/L，之
后增长率很小，可以忽略。
2.1.4 初始pH值对黄樟素产量的影响
1.2
1.0
1.3
1.1
0.9
0.8
4 5 6 7 8ࡍ࿻pH0.60.7哴⁏㍐ӗ䟿/ ˄g/ L ˅
图 4 初始pH值对菌株LJX27产黄樟素的影响
Fig.4 Effect of initial medium pH on the production of safrole
由图4可知，发酵环境初始pH值对菌株LJX27产黄
樟素有较大的影响。每种微生物都有其生长的最适宜pH
值，pH值过高或过低都会导致菌体生长受阻，其主要原
因是pH值会引起细胞膜电位的变化，从而影响微生物对
营养物质的吸收[12]，进而引起产代谢产物能力的下降。
pH值为7时黄樟素产量达最大值，为1.28 g/L，pH值为8
时产量下降，为1.26 g/L。
2.1.5 转速对黄樟素产量的影响
1.0
1.2
1.1
0.9
0.8
150100 200 250 300䕀䗳/˄r/min˅0.60.7咘ῳ㋴ѻ䞣/ ˄g/ L ˅
图 5 转速对菌株LJX27产黄樟素的影响
Fig.5 Effect of shaking speed on the production of safrole
菌株LJX27发酵产黄樟素需要氧气，培养过程中增大
转速会影响发酵液的通气量，进而增加培养基的溶氧水
平[13]。由图5可知，转速为200 r/min时黄樟素产量最大达
1.13 g/L，转速为 250 r/min时黄樟素产量基本保持不变，
但继续增大转速，黄樟素的产量反而有所降低，可能是
由于转速增大的同时，剪切力也随着增大，过大的剪切
力会将菌丝切断，影响了霉菌的生长与产酶[13]。
2.2 黄樟素发酵条件优化
2.2.1 二次通用旋转回归组合设计试验
根据以上单因素试验结果，在考察的5 种影响因子
中，接种量对菌株LJX27产黄樟素的影响最小，因此选
取初始pH值（X1）、发酵温度（X2）、转速（X3）和发
酵时间（X4）为自变量，以黄樟素产量为响应指标，利
用DPS7.05进行四因素五水平的二次通用旋转组合设计试
验，优化工艺参数。试验设计及结果见表1。
表 1 二次通用旋转回归组合设计试验及结果
Table 1 Quadric general rotational composite design with
experimental values of safrole production
试验号 X1初始pH X2发酵温度/℃
X3转速/
（r/min）
X4发酵
时间/d
Y黄樟素
产量/（g/L）
1 1（7） 1（26） 1（260） 1（6） 1.75
2 1 1 1 －1（4） 1.83
3 1 1 －1（140） 1 1.76
4 1 1 －1 －1 1.67
5 1 －1（22） 1 1 1.75
6 1 －1 1 －1 1.73
7 1 －1 －1 1 2.09
8 1 －1 －1 －1 1.64
9 －1（5） 1 1 1 1.10
10 －1 1 1 －1 1.00
11 －1 1 －1 1 1.05
12 －1 1 －1 －1 0.85
13 －1 －1 1 1 1.10
14 －1 －1 1 －1 0.81
15 －1 －1 －1 1 1.48
16 －1 －1 －1 －1 1.03
168 2014, Vol.35, No.17 食品科学 ※生物工程
试验号 X1初始pH X2发酵温度/℃
X3转速/
（r/min）
X4发酵
时间/d
Y黄樟素
产量/（g/L）
17 －2.032 0（4） 0（24） 0（200） 0（5） 1.00
18 2.195 6（8） 0 0 0 2.13
19 0（6） －2.005 2（20） 0 0 1.21
20 0 2.074 0（28） 0 0 0.98
21 0 0 －2.172 0（100） 0 1.31
22 0 0 2.054 0（300） 0 1.20
23 0 0 0 －2.168 1（3） 0.98
24 0 0 0 1.984 9（7） 1.63
25 0 0 0 0 1.61
26 0 0 0 0 1.65
27 0 0 0 0 1.59
28 0 0 0 0 1.70
29 0 0 0 0 1.65
30 0 0 0 0 1.63
31 0 0 0 0 1.72
2.2.2 模型建立与方差分析
表 2 方差分析表
Table 2 Analysis of variance for the experimental results of safrole production
变异来源 平方和 自由度 均方 偏相关 F值 P值
回归模型 4.212 7 15 0.301 5 27.527 7 0.000 0**
X1 2.842 2 1 2.885 5 1.019 6 283.242 3 0.000 0**
X2 0.051 9 1 0.051 9 －0.510 6 4.834 3 0.045 1*
X3 0.022 7 1 0.023 0 －0.363 6 2.249 7 0.167 0
X4 0.336 7 1 0.353 2 0.857 9 33.670 9 0.000 0**
X1
2 0.000 3 1 0.000 3 －0.040 4 0.024 1 0.893 6
X2
2 0.422 9 1 0.422 9 －0.860 0 41.083 5 0.000 0**
X3
2 0.197 1 1 0.188 6 －0.777 4 19.224 3 0.000 7**
X4
2 0.141 5 1 0.141 5 －0.680 9 13.802 4 0.002 5**
X1X2 0.003 1 1 0.003 0 0.143 4 0.300 9 0.634 9
X1X3 0.005 7 1 0.005 7 0.195 4 0.551 8 0.501 6
X1X4 0.020 6 1 0.020 4 －0.348 9 2.041 4 0.189 5
X2X3 0.090 5 1 0.094 5 0.604 7 8.952 5 0.009 8**
X2X4 0.053 2 1 0.053 2 －0.521 0 5.178 9 0.042 8*
X3X4 0.048 2 1 0.049 6 －0.478 2 4.697 3 0.050 7
残差 0.166 7 16 0.010 8
失拟 0.158 6 11 0.015 7 6.972 3 0.014 6*
误差 0.013 6 6 0.002 2
总和 4.395 8 32
注：*. 差异显著（P ＜ 0.05）；**. 差异极显著（P ＜ 0.01）。
采用DPS7.05数据处理系统对试验数据进行拟合，计
算各项回归系数，得到黄樟素产量与4 个因素的数学回归
模型：
Y = 1.650 00＋0.335 83 X1－0.045 00 X2－0.030 00 X3＋
0.117 50 X4－0.002 92 X1
2－0.120 42 X2
2－0.080 42 X3
2－
0.067 92 X4
2＋0.013 75 X1X2＋0.018 75 X1X3－0.035 00 X1X4＋
0.075 00 X2X3－0.056 25 X2X4－0.053 75 X3X4 （1）
由表2可知，发酵温度、转速、发酵时间二次项偏回
归系数均达极显著水平（P＜0.01），说明各个影响因素
与响应值不是简单的线性关系。通过查F分布表得知，
回归方程的失拟检验F= 6.972 31＞F0.05（11,6）＝3.09差异
显著，而回归方程的拟合检验F＝27.527 70＞F0.01（15,6）＝
4.32极显著，说明方程与实际情况拟合良好，模型的预测
值与实际值吻合较好，模型成立。
2.2.3 数学模型解析
2.2.3.1 主因子效应分析
由回归模型方程可知：一次项中的X1和X4的系数大
于零，X2和X3的系数小于零。一次项系数绝对值大小反
映了该因素对产量影响程度的强弱[14-15]，对模型进行主效
应分析，得到各个因素对菌株LJX27产黄樟素的影响大小
次序为：初始pH值＞发酵时间＞发酵温度＞转速。
2.2.3.2 单因子效应分析
将4 个因素中的其中3 个固定在0水平，对数学模型
进行降维分析，得到以其中1 个因素为决策变量的偏回归
模型：
Y1 = 1.650 00＋0.335 83 X1－0.002 92 X1
2 （2）
Y2 = 1.650 00－0.045 00 X2－0.120 42 X2
2 （3）
Y3 = 1.650 00－0.030 00 X3－0.080 42 X3
2 （4）
Y4 = 1.650 00 ＋0.117 50 X4－0.067 92 X4
2 （5）
上述4 个方程中，二次项的系数均为负值，说明其
表征的抛物线都开口向下，因此，4 个因素取值均存在最
佳值，过大或过小均会使响应值降低[5]。
2.2.3.3 响应面图及等高线图分析
对模型的方差分析表明，交互项中仅有因素X2X3对
黄樟素产量影响极显著（P＜0.01），而其他交互项均
未达到极显著水平。由于二次项系数之间具有相关性，
因此这些微弱的交互项，原则上不能删除[16]。因而在其
他因素条件固定不变的情况下，只需要探讨X2（发酵温
度）与X3（转速）交互作用对菌株LJX27产黄樟素的影
响，采用Design Expert 7.1.3对模型进行降维分析[17]。
等高线的形状可以反映因素间交互作用的大小，圆
形表示交互作用不显著，椭圆形表示交互作用显著[18-19]。
由图6可知，发酵温度与转速存在一定的交互作用[20]。
当发酵温度一定时，随着转速的增加，黄樟素产量先升
高后降低，在200 r/min达到最大值；当转速一定时，随
着发酵温度的增加，黄樟素产量也是先升高后降低，在
24 ℃时达到最大值。
通过Design Expert 7.1.3软件分析，得到内生真菌
LJX27产黄樟素的最佳发酵条件为：初始pH 8、发酵
温度24 ℃、转速200 r/min、发酵时间5 d，得到黄樟
素最大产量为2.13 g/L。为了进一步验证模型的可靠
性，在最佳发酵条件下，进行了验证实验，得到产黄
樟油素产量为2.24 g/L，实际值与模型最优值的比值为
1.06（＞1），说明本实验获得的二次通用旋转组合的最
佳模型是可靠的。
续表1
※生物工程 食品科学 2014, Vol.35, No.17 169
1.375 0
1.870 0
1.622 5
1.127 5
0.880 0
300 28
200
260 26
140
24
22
100 20
哴⁏㍐ӗ䟿/ ˄g/ L ˅
X
3䖜䙏/˄r/min˅ X 2ਁ 䞥⑙ᓖ/ć
20
100
24
200
28
300
哴⁏㍐ӗ䟿/˄g/L˅
260
1.214 77
1.324 56
1.434 35
1.214 77
1.214 77
1.214 770.995 186
1.104 98
140
2622
X2ਁ䞥⑙ᓖ/ćX 3䖜䙏/ ˄r/ min ˅
图 6 发酵温度与转速交互作用的响应面和等高线图
Fig.6 Response surface and contour plots for the interactive effect of
fermentation temperature and shaking speed on the production of safrole
3 结论与讨论
本研究通过单因素试验筛选出对黄樟素发酵影响较
大的4 个因素，并对这4 个因素进行了二次通用旋转组
合试验优化，获得内生真菌 LJX27发酵产黄樟素的最
佳条件为初始pH 8、发酵温度24 ℃、转速200 r/min、
发酵时间5 d，在此条件下黄樟素产量达 2.13 g/L，比
优化前黄樟素的产量提高了67.72%。各因素对黄樟素
产量的影响大小依次为：初始pH值＞发酵时间＞发酵
温度＞转速；响应面试验得出发酵温度与转速有一定的
交互作用。试验所建立的回归模型经显著性检验达到显
著水平，说明该模型用于内生真菌 LJX27产黄樟素发酵
条件的优化是可行的。
在检测方法上，本研究采用的是气相色谱法，以黄
樟素标准样品比对进行检测。由于内生真菌发酵液中的
成分复杂，其极性也各不相同，测定值可能存在一定的
误差，可以采用气相色谱-质谱联用法做进一步检测和
验证。以黄樟素为原料的市场需求量较大，四川省宜宾
市的岩桂资源优势突出，本研究结果能够为岩桂内生真
菌 LJX27进一步放大培养产黄樟素提供基础数据，可以
结合地方特色岩桂产业进行更深入的研究和应用。
参考文献：
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