全 文 ：第 3 卷 第 5 期
1 9 9 0 年1 0月
林 业 科 学研 究
FO R E S T R E S EA R CH
V 0 1
。
O Ct
.
,
N o
.
5
1 9 9 0
木麻黄根瘤内生菌的分离 、培养和回接关
康丽华 曹月华 吴英标
(中国林业科学研究院热带林业研究所 )
摘要 从福建、 广 东、 海南岛的木麻黄根瘤中分离到 16 袜 内生菌, 它们都具有
凡翻石a 菌的典型形态特征 。 回接鉴定表明 , 除 4 株不侵染原寄主植物外 , 其余12 株
均具有侵染能力 。 但各菌株的侵染能力不同 , 这些菌株在培养基上的培养特征有一
定的差异 , 实验菌株在 B A P 培养基上生 长最好 , 在 Ja n B lo m 、 Qm o d 等培养基上
生长较差 。
关键词 木麻黄 ; 内生菌
自从 1 9 7 8年美国的 Cal la ha m 等 工‘J首次从香蔽木根瘤中分离出内生菌之后 , 国内外许多
实验室也从恺木 、 杨梅、 沙棘 、 胡颓子、 木麻黄属等根瘤中分离得到弗兰克氏菌 的 离 体 培
养 [2 ‘ “x 。
1 9 5 6年我们用根瘤切片法 , 从普通木麻黄 (C a su a , 玄n a e口u ise士ifo l矛a )根瘤中分离得到 1 6株
纯培养的弗兰克氏菌 , 其中12 株回接到宿主苗木上 , 形成根瘤 , 并有固氮活性 。 这为筛选木
麻黄优良高效固氮菌株 , 以及对弗兰克氏菌的分类 、 生理生化及遗传特性等研究提供了有利
条件。
一 、 材料与方法
(一 ) 根瘤来源
木麻黄的野生根瘤采自福建省赤湖林场 、 海南省岛东林场 、 广东省湛江东海林场和港 口
林场等地 , 人工诱导根瘤取自本所木麻黄人工接种苗圃 。
(二 ) 分离方法
取新鲜幼嫩根瘤 , 洗净表面泥沙 , 在 95 % 的酒精溶液中浸泡 30 ~ 60 5 , 置于 0 . 1 %的
酸性升汞溶液中 , 经 5 一 8 m in 取出 , 用无菌水冲洗干净 , 切成约 。。 l~ 。. s m m 的薄片 , 置
于 S 液体培养基 [e1 中 , 在 28 ~ 30 ℃恒温下培养。 当瘤片长出菌落后进行镜检并转管培养 。
(三 ) 自生固氮活性洲定方法
制备无氮 B A P培养基 工7 ]于 1 6 m m x 1 8 0 m m 试管中, 每管分装 7 m l, 在 2 8~ 3 0 ℃的恒
温下培养30 天后注入 10 %的乙炔 , 静置培养 24 h , 然后测定固氮活性 , 每个菌株重复 3 次 。
本文于 1 9 8 9年 1 月 2 7 日收到 。
* 本项研究是 法国资助 的 FA O 项 目‘ 固氮木本树木改 良”的一部分, 中国科学院微生物研究所阮继生教授指 导本项工 作
并鉴定部分菌株, 参加本项工作的还有郭丽云、 姚玉华 、 林毅同志 。
4 8 4 牛仁业 手卜学 研 究 3 卷
(四 ) 回接试验
供回接试验的木麻黄有实生苗和扦插条两种 。 种子经 0 . 5 写的 K M n O ‘溶液消毒 , 扦播
条经 0 . 1 %的升汞溶液消毒 , 在灭过菌的容器内培养至发芽 、 生根 , 并进行砂培和水培。 培
养基质 (砂或蛙石等 ) 经高压蒸汽灭菌 , 水培液用凉水配制 , 营养液采用 Si d er is Y o u n g 配
方 〔8 1 , 育苗时加 (N H ‘): 5 0 ‘ (回接后不加)。
以 1 至 1 个半月菌龄接种 , 3 个接种管约含 15 0 个菌落 , 用灭过菌的玻璃研磨器研磨制
备菌悬液 。 每个菌株号接种10 ~ 15 株苗 。 将培养 2 个月的实生苗根部洗净 , 修剪苗木的根至
2 c m , 扦插条长至 1 0 c m 、 根长 2 c m 时接种 Fra , 无份 菌 。接种时将经过修剪后的苗木和扦插
条浸于上述制备的菌悬液中 , 经 30 m in 移入基质内 , 置于温度为 23 ~ 32 ℃ 、 光照为 6 0 0 lx
的室内培养 , 重复 1 ~ 10 次 , 每周补加营养液一次。 以不接种的苗木作对照 。
对人工接种诱导形成的根瘤 , 按沈善敏修改的方法取样 。, 1 9 , 以 Shi m d ez u M 一 gA 气
相色谱仪 , 测定乙炔还原活性 [’l , 重复 2 次 。
二 、 结 果
(一 ) 分离, 的一般形态特征
从木麻黄天然和人工诱导根瘤中分离的16 株弗兰克氏菌株 , 它们的形态特征相似 。 液体
培养时在试管底部呈圆球形颗粒状生长或菌落沿试管壁生长 , 菌落边缘不整齐 , 培养液不混
浊 , 慢生型 , 经光学显微镜观察 , 确认是属多态型抱囊放线菌 。 其形态特征 是 菌 丝 长 、 弯
曲、 分枝有隔 、 粗细不匀 , 直径为 。. 5 ~ 2 . 1 pm 。 菌丝任何部位均能膨大形成特征性抱囊。
抱囊形状各异 , 多呈回形 、 椭回形 、 草蓦形、 棒状形和穗形等 , 或呈不规则形状 , 大小不一 ,
通常约 4 ~ 35 ; m x 3~ 4 4 o m , 最大可达 50 ~ 60 , m 。 表面不光滑 , 有的可见到粗大抱囊柄 ,
柄上有横隔 , 成熟抱子囊壁膜破裂后释放出抱子 , 抱子圆形或不规则 , 直径约 2 “m ; 固氮泡
囊体 (vi 3 ic les )呈球形 、 卵圆形 , 表面光滑 , 多着生在菌丝体一侧的细小分枝上 , 其直径约
2 ~ 3
.
7 卜m (见图版 工)。 这些菌株形态特征均与 H . G . D te m 等人描述的相同 [’, “l。
(二 ) 不同培养甚的培养特征
上述分离菌株在 B A P、 无氮 B A P (BA P一N ) [ 7 ] 、 Ja n B lo m [‘。 ] 、 Qm o d t’‘; 、 B / 2 工’Z j、
S ‘“」、 S + T 工8 1、 葡萄糖夭门冬素 (G U A ) 〔‘“] 、 蔗糖硝酸盐 (YC Z ) [’“l 液体培养基上的生长情
况基本一 致 , 其中以 BA P 液体培养基的菌株生长最好 , 菌落呈 圆球形颗粒状沉淀 , 直径约
o
。
5~ 2
.
o m m
, 颜色呈荔肉白或蚌肉白。 经显微镜 观 察 , 在 BA P 液体培养基上可见到菌体
形成很多抱子囊 , 泡囊 (v e si cl es )较少 , 在无氮 BA P 培养基 _ L形成很多泡囊 , 抱子囊也较
多 , 在 Ja n B lo m 和 Qm o d 等液体培养基上生长较差 。
(三 ) 回接试验
在接种弗兰克氏菌后10 ~ 30 天内 , 不定根的侧根径权处长出星状毛 , 其下有白色或红色
小凸起 , 7 ~ 10 天后发育成小瘤瓣 , 继而长成一个小根瘤簇 。 同时星状毛延伸呈负向地性的
根瘤毛 。 根瘤颜色有白 、 黄白及红色三种。 瘤瓣有长形和短形两种 , 与野外观测结果相似 。
绝对空 白对照株均不结瘤 。
回接试验结果表明 , 在这些分离菌中 , 除 了 4 株 Fr an 无ia 菌不能在原宿主植物上形成根
5 期 康丽华等 : 木麻黄根瘤内生菌的分离 、 培养和回接 4 8弓
瘤外 , 其余 12 株菌均能在原宿主植物木麻黄根上形成根瘤 , 而且用乙炔还原法能测出其固氮
酶活性 。 但这 12 株Fla 硅ia 菌在侵染结瘤能力 、 结瘤数量和固氮活性上存在着差异(表 l )。
表 1 分离菌株的根抽来滚 、 结. 能力和固红醉活性洲定
寄主材料 ! 培养基质 培养条件 结 瘤 率 结 瘤 致
有 毒卡 号 根 疽 来 源 奚诬蓄{弄添 砂培 水培 室内 温室 (% ) (个 / 株 )
根瘤(鲜)乙炔还 原 活 性
(C : H : 件m o l/
g
·
h )
T FI 8 6 0 0 1
T FI 8 6 0 0 2
T FI 8 6 0 0 3
T FI 8 6 0 0 4
T FI 8 6 0 0 5
T FI 8 6 0 0 6
T FI 8 C0 0 7
T F I 8 7 0 2 3
T FI 8 7 0 2 4
T FI 8 7舀2 6
T F I 8 7 0 2 7
T F I 8 70 2 8
T FI 8 71 0 3
T FI 8 7 16 7
T FI 8 72 1 9
T FI 8 7 2 2 习
福建赤湖林场
海甫省岛东林场
海南省岛东林场
港 口林场
海南省岛东林场
海南省岛东林场
海南省岛东林场
广东东海林 场
广东东海林 场
广东东海林场
广东东海林场
广东东海林场
广东东海林 场
广州 热林所诱导根瘤
广州热林所诱导 根瘤
广东 东海林场
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2 ~ 3
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了识训一订召了召亿记训斌
三 、 讨 论
1
. 选择合适的分离培养基是分离成败的主要因素。 我们用酪蛋白水解物作培养基 氮 源
的 S 培养基后 , 均获得成功 。 说明木麻黄内生菌对氮源的要求较严格 。
2
。 根瘤表面消毒十分困难 , 为了防止污染 , 通常采用增加消毒剂浓度和延长消毒时间 ,
但这样极易造成消毒剂对内部有机体的损害 。 因为非豆科植物与豆科植物根瘤不一样 , 其细
胞间隙较大 , 氧分压高 I‘4 1 , 消毒剂通过细胞空隙浸入根瘤内部 , 损坏了有机体 。 所以 , 选择
合适的根瘤表面消毒剂及掌握适宜的消毒时间是十分重要的。 经过反复试验表明 , 认为本试
验所采用的消毒方法是较好的 。
3
。 在分离的 16 株弗兰克氏菌中 , 有 4 株不能在原宿主植物上结瘤 。 经测定 , 试管内纯
培养物具有一定的固氮活性 , 如 T FI 8 6 0 0 3 和 T FI 8 6 0 0 4 菌株的固氮 量 分 别 为 。。 20 1 2 和
。。 01 0 38 卜g /天 ·管 。 但这些菌株在原宿主木麻黄上反复回接 10 余次 , 又 用同属的细枝木麻
黄 (Ca su ar ina ‘”耐: 沙 a二i翻a) 交叉回接数次 , 均不见结瘤。 李忠伟等 [1 “1认为 , 分离所采用
的根瘤来源可能影响到菌株的侵染能力 , 直接从野生根瘤分离的菌株 , 回接效果较好 。 而我
们用人工诱导根瘤分离的 T FI 8 7 1 6 7 和 T FI 8 7 2 19 菌株 , 均能在原宿主植物上 结 瘤 。 相 反
地 , 直接从野生根瘤分离的 T FI 5 6 0 0 3 、 T FI 8 6 0 0 4 、 T FI8 6 0 0 6 和 T FI 8 7 2 2 3 等菌株 , 则不
能在原宿主植物上结瘤 。 因此 , 我们认为 , 弗兰克氏菌从与树木根瘤共生到腐生生活 , 菌体
在适应这种环境而产生的变异 , 可能会影响其结瘤能力。
4 8 6 林 业 科 学 研 究 3 卷
参 考 文 献
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FR OM T H E NOD U LE S OF C A S U A R IN A
K a n g L ih u a C a o Y u e h u a W u Y in g b ia o
(了’人e R e s e〔: r c 八 I o s t‘t :: te o f T r o p ‘。a l F o r e s tr , C A F )
A b s tr a et S ix t e e n e n d o Phyt ie a e t in o m ye e te s w e r e is o la te d fr o m th e n o d u le s
o f C a s : a ; i。a 。口u ise tffo lia p la n t e d in F u jia n , G u a n g d o n g a n d H a in a n is la n d .
A ll o f t h e m h a v e t h e ty Pie a l m o r Ph o lo g ie a l e ha r a e te r is t ie s o f F : a n 无ia . 1 2
o u t o f 1 6 s t r a in s h a ve in fe e t in g a b ilit ie s
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b u t in fe e t in g a b ilitie s o f th e s e
is o la te s a r e d iffe r e n t fr o m e a eh o th e r
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T h e s tr a in s s h o w e d d iffe r e n e e s in
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T h e t e s t e d s t r a in s g r ew w e ll o n BA P m e d iu m b u t
g r e w Po o r ly o n Ja n B lo m o r Qm o d m e d iu m
.
K e y w o r d s Ca su a 了i, a e叮u ise rffo lia ; e n d o Phytic a e tin o m ye e te