全 文 ：第 52 卷 第 1 期
2 0 1 6 年 1 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 52，No. 1
Jan．，2 0 1 6
doi:10．11707 / j．1001-7488．20160110
收稿日期: 2014 － 07 － 09; 修回日期: 2015 － 10 － 12。
基金项目: 四川省教育厅重点项目(09ZA068); 四川省西部大开发重点项目“长江上游重要生态公益林病虫防控技术研究和成果推广应用”。
* 刘应高为通讯作者。
华山松凋落针叶上的真菌多样性及 4 株真菌的
纤维素分解能力*
许秀兰1 杨春琳1 田 莎1 姜欣华2 刘 韩2 刘应高
(1． 四川农业大学森林保护重点实验室 成都 611130; 2．四川省甘孜州林业科学研究所 甘孜 626000)
摘 要: 【目的】研究二郎山林场华山松针叶凋落初期针叶上的真菌多样性，分析凋落物分解初期的真菌结构组
成及其功能性，揭示真菌多样性与凋落物分解的关系以及根球壳孢菌在针叶分解中的产酶特性。【方法】采用研
磨法对分别从海拔 2 750，2 650，2 510 和 2 460 m 采集的华山松新近凋落针叶进行真菌分离，结合形态学和真菌
ITS 序列的分子生物学对分离物鉴定分类。选取 3 株在形态学上存在明显差异的根球壳孢菌以及 1 株分离自华山
松的二郎山散斑壳为分解菌株，以华山松针叶为唯一底物，采用试管培养法进行发酵，探讨根球壳孢菌的腐生性
能。【结果】分离鉴定结果显示，从华山松凋落针叶中获得了 23 个属于不同分类单元的真菌，其中半知菌数量最
多，共有 15 个分类单元，子囊菌次之，为 5 个。所有分离菌株隶属 15 属，毛霉属、木霉属、根球壳孢菌属、青霉属和
蓝状菌属在 4 个海拔凋落物中均存在，为华山松凋落物前期的丰富物种。木霉属和青霉属等丝状真菌在数量上的
优势以及种类上的多样性，说明其在凋落物分解过程中发挥着重要作用，而担子菌在数量以及种类上的缺乏说明
其在分解前期参与少，推测其后期将从环境进入参与木质素的分解。通过测定 4 株真菌分解华山松凋落针叶时的
纤维素酶活，4 株真菌分泌的内切纤维素酶和 β －葡聚糖酶活性在第 13 天达到峰值，外切纤维素酶活性在第 17 天
达到峰值，但 4 株真菌菌株之间的各纤维素酶活力差异不大，引起的针叶质量损失率也并无显著差异。根球壳孢
菌和二郎山散斑壳对针叶的纤维素成分具有分解作用，内切纤维素酶、外切纤维素酶、β － 葡萄糖苷酶之间存在协
同效应。二郎山散斑壳分解的华山松针叶的平均质量损失率为 15. 74%，该菌多存在于落地华山松针叶上，而活体
针叶中鲜有发现，且未能造成华山松的落针病害; 根球壳孢菌在 25 天内引起华山松针叶质量损失率为 12. 00% ～
13. 40%。【结论】木霉属和青霉属等丝状真菌在凋落物初期发挥主要作用，且在不同海拔均为优势物种。二郎山
散斑壳与根球壳孢菌均存在弱腐生性，但其产纤维素分解酶能力是否与其致病力相关仍有待进一步研究。
关键词: 华山松; 凋落物; 真菌多样性; 根球壳孢菌; 二郎山散斑壳; 降解
中图分类号:S718. 8 文献标识码:A 文章编号:1001 － 7488(2016)01 － 0080 － 09
Fungal Diversity in Pinus armandii Litter and the Cellulose Decomposing Capacity of
Four Fungal Strains of Ｒhizosphaera and Lophodermium
Xu Xiulan1 Yang Chunlin1 Tian Sha1 Jiang Xinhua2 Liu Han2 Liu Yinggao1
(1 ． Provincial Key Laboratory of Forest Conservation，Sichuan Agricultural University Chengdu 611130;
2 ． Ganzi Institute of Forestry Ｒesearch of Sichuan Province Ganzi 626000)
Abstract: 【Objective】Pinus armandii distributes widely in the Erlang Mountain and is one of the dominant species in
the community． The Erlang Mountain Forest Farm is located in Sichuan Province and it contains rich microbial resources．
This article was intended to study the fungal diversity and analyze the relationship between fungal structure and their
functions at the beginning of the P． armandii litter decomposition period． 【Method】The grinding method was used in this
paper to isolate fungi on the P． armandii litter from the altitude of 2 750，2 650，2 510，and 2 460 m． The isolates were
further indentified according to the morphology combined with PCＲ amplification and sequencing using the universal
primers based on the ITS sequence of fungi． In addition， the Ｒhizosphaera was for the first time isolated from P．
armandii，and the relevant research on the fungi is still insufficient． There remains controversy on the fungal role as a
pathogen or weak parasitic fungus in foreign reports． The fungus was reported to cause disease on P． sylvestris var．
第 1 期 许秀兰等: 华山松凋落针叶上的真菌多样性及 4 株真菌的纤维素分解能力
mongolica in China in 2013． In this study，12 strains of Ｒhizosphaera were isolated from the four elevations． To study the
saprophytic performance，three strains of Ｒhizosphaera sp． with different morphological features，namely Ｒ． sp． 1，Ｒ． sp．
2 and Ｒ． sp． 3，and one strain of Lophodermium erlangshanense were selected for decomposition test in vitro，in which the
P． armandii litter is the sole substrate． 【Ｒesult】The isolation results showed that 23 fungi taxa were obtained． The
imperfecti and ascomycetes were the major components that occupy 15 taxa and 5 taxa，respectively． All of the fungi
belonged to 15 genera． Mucor，Trichoderma，Ｒhizosphaera，Penicillium and Talaromyces were isolated from the plots over
the four different elevations， and were the abundant species． The filamentous fungi， such as Trichoderma， and
Penicillium，which had the quantitative superiority and diversity，undoubtedly would play an important role in the process
of litter decomposition． However，basidiomycete fungi，without abundant amount and species，might not participate in the
decomposition at the early stage． The basidiomycete fungi originated from the environment may participate in the further
lignin decomposition at the late stage． Through the determination of cellulose enzyme produced by the fungi，the activities
of endoglucanase and β-glucosidase reach the maximum at the 13th day． The activities of Cellobiohydrolase reach the
maximum at the 17th day． In general，there was no significant difference in the enzyme activities as well as the mass loss
among the four strains． Those results indicated that Ｒhizosphaera sp． and L． erlangshanense could decompose the cellulose
components，and there was a synergistic effect from the different cellulase enzymes ( endoglucanase，cellobiohydrolase，β-
glucosidase) ． The mass loss decomposed by L． erlangshanense was 15． 74%，while the loss caused by Ｒhizosphaera sp．
ranged from 12． 00% to 13． 40% ． According to the previous researches，L． erlangshanense was usually found in the litter
and rarely in alive needles，suggesting that it may not cause the needle disease． 【Conclusion】The results indicated that
filamentous fungi， such as Trichoderma， and Penicillium， played an important role at the beginning of the litter
decomposition period． They were both the dominant species in the four different altitudes． Ｒhizosphaera sp． and L．
erlangshanense were weak saprotrophic fungi in the P． armandii litter． However，it needs to be further verified that
whether the capacity of cellulose decomposing enzyme is related to their pathogenicity．
Key words: Pinus armandii; litter; fungal diversity; Ｒhizosphaera sp． ; Lophodermium erlangshanense; decomposition
目前，森林微生物资源的研究逐渐成为热点。
过去的几十年里，有关内生真菌区系的研究快速发
展，其中不乏对松(Pinus)属植物各组织内生真菌的
研究( Botella et al．，2011; Hoff et al．，2004; Hu et
al．，2007); 同时，森林凋落物以及土壤真菌的类群
研究也有了较大发展。真菌在凋落物中广泛存在，
不同类型腐生真菌在凋落物分解的不同时期发挥着
重要作用(陈辉等，1993);但是，凋落物中许多真菌
的生理生态功能仍未得到清楚的认识，科技人员仍
在不断扩大对真菌的研究，以发现新的功能菌株。
根球壳孢菌属 (Ｒhizosphaera)属于半知菌类球
壳孢目(Sphaeropsidales)(Kumi et al．，1979)，对该属
真菌的研究起 步较晚，其中对云杉 叶 疫 病 菌
(Ｒhizosphaera kalkhoffii) 的报道较多。云杉叶疫病
菌在多种云杉属(Picea)、冷杉属(Abies)、松属植物
的针叶中均可寄生(Kumi et al．，1979);其致病性在
不同地方、不同针叶树上存在差异 ( Kumi et al．，
1979; Livsey et al．，1992; Juzwik，1993)，有的认为
该菌是导致针叶落针的主要原因，有的则认为该菌
属于弱寄生菌。在西班牙冷杉( Abies pinsapo)的发
病针叶上还发现一种根球壳孢菌 ( Ｒhizosphaera
oudemansii)，该菌与非生物因子共同作用引起落针
病(Martinez et al．，1983)。国内关于根球壳孢菌的
报道很少，任玮 (1990)首次报道由云杉叶疫病菌
(Ｒhizosphaera kalkhoffii)在云南和四川地区的丽江
云杉(Picea likiangensis)上引起的云杉病害;而近期
报道在大兴安岭地区由该菌引起的樟子松 ( Pinus
sylvestris var． mongolica)病害(You et al．，2013)。
二郎山林场位于四川甘孜泸定县与雅安市天全
县交界处，场内针叶林居多，主要树种有冷杉、云杉、
落叶松(Larix spp． )、华山松(Pinus armandii)、云南
松( Pinus yunnanensis)、高山松 ( Pinus densata)、栎
(Quercus)、桦(Betula)以及杨(Populus)树等，其中，
华山松为主要建群树种之一。本研究对二郎山林场
华山松初始凋落针叶中的真菌进行分离鉴定，并对
丰富物种根球壳孢菌进行室内分解试验，旨在分析
亚高山华山松凋落物中的真菌多样性与凋落物分解
的关系，初探根球壳孢菌在针叶分解中的产酶特性，
为该菌生活习性的深入研究奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 供试材料
1. 1. 1 菌种来源 根球壳孢菌菌株 Ｒhizosphaera
sp． 1，Ｒhizosphaera sp． 2 和 Ｒhizosphaera sp． 3 分离
18
林 业 科 学 52 卷
自二郎山林场华山松凋落针叶;二郎山散斑壳
( Lophodermium erlangshanense)分离自二郎山林场
华山松，由四川农业大学森林保护重点实验室
提供。
1. 1. 2 材料 于 2012 年 10 月从二郎山林场海拔
分别为 2 750，2 650，2 510 和 2 460 m 的华山松林下
收集新近凋落针叶，放入无菌袋中带回实验室进行
真菌分离。
1. 1. 3 培养基 采用刚果红法 ( Teather et al．，
1982)对不同固体培养基上生长的菌落进行染色观
察并测量，以菌丝生长情况、分解圈透明程度以及透
明圈 /菌落比值作为筛选最优培养筛选的标准。最
终用于分解的培养基组成如下:MgSO4·7H2O 1. 25
g，KH2PO4 2. 5 g，KNO3 5. 0 g，FeCl4·6H2O 0. 01 g，葡
萄糖 0. 05 g，无菌水定容至 1 L。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 分离培养 采用松针研磨法进行真菌分离:
在无菌条件下，称取 1. 0 g 剪碎的松针 (0. 5 cm 左
右)于研钵中，加入 50 mL 无菌蒸馏水和少量石英
砂，研磨 3 min 后转入三角瓶。将研磨液用无菌水
稀释成 10 － 1，10 － 2和 10 － 3倍，分别取 100 μL 均匀涂
布在 PDA 培养基上，每个浓度重复 3 个平板，同时
重复 3 次分离。于恒温培养箱中培养，培养条件为
25 ℃、自然光 － 黑暗交替。观察菌落生长情况，对
单个菌落进行纯化保存。
1. 2. 2 室内分解材料处理 使用海拔 2 510 m 样地
新近凋落针叶为室内分解材料，用蒸馏水浸泡并洗净
表面残渣，再将处理后的针叶于 105 ℃杀青 15 min，
杀死针叶本身所带微生物，65 ℃烘干至恒质量，用剪
刀剪成 1 cm 针段，混匀保存于干燥器中备用。
1. 2. 3 分子生物学鉴定 分离纯化的真菌采用通
用引物 ITS 1 和 ITS 4 对 rDNA ITS 区进行扩增。ITS
1: 5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ( 19 bp ); ITS
4: 5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3(20 bp)。1)
DNA 的提取 将菌株在 PDA 平板上活化 3 ～
7 天，接种直径 5 mm 的菌饼于 50 mL 的 PDA 液体
培养基上，25 ℃、100 r·min － 1培养 5 ～ 7 天。用灭
菌的纱布过滤菌丝，再用灭菌后的滤纸尽量将水分
吸干，得到菌丝用于 DNA 提取。DNA 提取采用植
物基因组 DNA 提取试剂盒法 (天根生化科技 (北
京)有限公司)，具体步骤参见试剂盒说明。
2) PCＲ 反应体系 (50 μL) 引物各 2. 0 μL，
ddH2O 19. 0 μL，DNA 模板 2. 0 μL，2 × TaqPCＲ
Master mix 25. 0 μL。PCＲ 扩增程序 (35 个循环):
95 ℃预变性 DNA 5 min; 95 ℃变性 1 min，50 ℃退
火 1 min，72 ℃延伸 1 min; 72 ℃延伸 5 min。
3) PCＲ 产物检测及测序 PCＲ 反应终止后，对
产物进行琼脂糖凝胶电泳检测 (1% 的 1 × TBE)。
电泳结束后通过凝胶成像系统观察结果，若条带清
晰无杂条带，则将 PCＲ 产物送至上海生工生物技术
公司测序。
1. 2. 4 分解培养基筛选 3 种分解培养基配方如
下:① KH2PO4 ( 0. 50 g)、MgSO4·7H2O ( 0. 50 g)、
NaCl(0. 50 g)、CMC-Na(2. 00 g)、蛋白胨(1. 00 g)、
葡糖糖(0. 05 g)、琼脂条(20. 00 g)、蒸馏水 (1 000
mL);②KH2PO4(2. 50 g)、MgSO4·7H2O(1. 25 g)、
KNO3 ( 5. 00 g )、CMC-Na ( 2. 00 g )、FeCl3·6H2O
(0. 01 g)、葡糖糖(0. 05 g)、琼脂条(20. 00 g)、蒸馏
水(1 000 mL);③KH2PO4 (1. 00 g)、MgSO4·7H2O
(0. 20 g)、NaNO3 (2. 00 g)、KCl(0. 20 g)、酵母浸出
膏(0. 20 g)、CMC-Na(2. 00 g)、葡糖糖(0. 05 g)、琼
脂条(20. 00 g)、蒸馏水(1 000 mL)。分别配制以上
3 种固体培养基，在无菌条件下用打孔器取直径为 5
mm 的菌饼，每菌重复 3 个平板，置于恒温培养箱中
25 ℃静止培养 7 天。采用刚果红法( Teather et al．，
1982)对其进行染色观察并测量，以菌丝生长情况、
分解圈透明程度以及透明圈 /菌落比值作为筛选最
优培养筛选的标准。最终培养基②为选定分解培
养基。
1. 2. 5 针叶分解试验 发酵试验参照郝杰杰等
(2006)方法:称取 0. 500 g 针叶倒入中号试管(18
mm × 180 mm 作为唯一碳源，再加最优培养基 10. 0
mL。塞上棉塞并放入高压蒸汽灭菌锅 121 ℃灭菌
30 min，冷却备用。在无菌条件下，用打孔器打取直
径为 5 mm 的菌饼，每管接 4 块菌饼，同时以不接菌
作为空白对照管，每个处理接 18 管。自接种后第 5
天起，每 4 天取样 1 次，每次取 4 管(3 根接菌管 +
1 根无菌管)，连续取样 6 次。
1. 2. 6 针叶质量损失率及酶活测定 用烘干至恒
质量的滤纸过滤试管中混合溶液，同时用柠檬酸缓
冲液(0. 05 mol·L － 1，pH4. 8)多次冲洗分解残渣，最
终所得滤液用缓冲液定容至 8 mL，即得到待测酶
液。残渣连同滤纸一起放入烘箱中，烘干至恒质量
(105 ℃处理 15 min，65 ℃烘至恒质量)，并称量。
针叶质量损失率(% ) = 0. 5 － 残渣质量0. 5
× 100%，
平均分解速率(% ) = 针叶质量损失率
培养天数
× 100%。
内切纤维素酶( endoglucanase，EG)酶活测定以
羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为酶解底物，外切纤维
素酶 ( cellobiohydrolase，CBH)和 β － 葡萄糖苷酶
(β-glucosidase，BGL)分别以微晶纤维素和水杨苷
28
第 1 期 许秀兰等: 华山松凋落针叶上的真菌多样性及 4 株真菌的纤维素分解能力
为酶解底物，测定参照许玉林等(2013)方法。
酶活定义:在特定条件下，1 min 水解底物产生
相当于 1 μmol 葡萄糖的还原糖量为 1 个酶活力单
位，以 U·mL － 1表示:
酶活力(U·mL －1) =
比色所得葡萄糖含量 ×待测酶液总体积 × 0. 093
比色所取酶液体积 ×保温时间
。
式中:指标单位为含量(mg)、体积(mL)、时间(h)。
1. 3 数据处理
使用 SPSS 20. 0 和 Excel 2007 软件对试验数据
进行统计和分析，MEGA5. 0 软件进行基因序列分
析，同时用 Origin 8. 5 软件作图。
2 结果与分析
2. 1 华山松针叶中的真菌多样性
查阅中国真菌志，试验最终从华山松凋落针叶
中分离得到 15 属的真菌(图 1)，分类于半知菌亚门
(Deuteromycotina)、子囊菌亚门 ( Ascomycotion)、担
子 菌 亚 门 ( Basidiomycotina ) 和 接 合 菌 亚 门
(Zygomycotina )。 15 株 属 于 半 知 菌 类，丝 孢 纲
(Hyphomycetes) 丝孢目 ( Hyphomycetales) 真菌 11
株，其中青霉属 ( Penicillium)真菌居多且种类最丰
富; 1 株属于丝孢纲瘤座孢目(Tuberculariales)镰刀
菌 ( Fusarium tricinctum ); 3 株 属 于 腔 孢 纲
(Coelamycetes)球壳孢目( Sphaeropsidales)，分别为
茎点霉属(Phoma sp． )、根球壳孢菌属(Ｒhizosphaera
sp． )和拟腊肠茎点霉属 ( Allantophomopsis sp． )。5
株分类于子囊菌亚门，包括散囊菌目(Eurotiales)的
蓝 状 菌 属 ( Talaromyces amestolkiae )、缨 霉 属
(Thysanophora penicillioides)，炭角菌目(Xylariales)
的拟盘多毛孢属 ( Pestalotiopsis vismiae )、球壳目
(Sphaeriales) 的肉座菌属 (Hypocrea pachybasioides)
以及柔膜菌目(Helotiales)的 Ceuthospora sp．。2 株
真菌属于接合菌亚门，分别为毛霉目(Mucorales)的
毛霉属 (Mucor abundans) 和伞状霉属 ( Umbelopsis
isabellina)。1 株为担子菌亚门伞菌目(Agaricales)
的鬼伞属(Coprinellus sp． )。
此外，不同海拔凋落物真菌分离频率存有差异
(表 1 )。Mucor sp．，Trichoderma sp．，Ｒhizosphaera
sp．，Penicillium sp．，Talaromyces sp． 5 属真菌在 4
个海 拔 均 可 分 离 得 到，其 中 Penicillium sp． 和
Talaromyces sp． 的分离频率相对最高，Penicillium
sp．在海拔 2 460 m 和 2 750 m 凋落物中分离频率大
于 50%，Talaromyces sp． 则在海拔 2 510 m 和 2 650
m 样地针叶中分离频率较高，分别为 45. 413% 和
53. 139%。Ｒhizosphaera sp． 的分离频率随着海拔的
升高而降低，从分离频率来看，该菌在数量上不占优
势，但在各样地均存在，说明其在该地区华山松凋落
针叶中具有普遍性。
2. 2 根球壳孢菌的系统发育分析
以真菌通用引物 ITS1 和 ITS4 对分离菌株的
DNA 进行 PCＲ 扩增并测序，测序结果在 NCBI 的数
据库进行 Blast 同源性比对。比对结果显示，12 株
分离菌株与已注册的根球壳孢菌属真菌同源性高。
选取同源性较高(同源性大于 97% )的菌株序列进
行系统发育树构建，该 12 株菌株与 Ｒhizosphaera sp．
(EU700373. 1)聚为一支，亲缘关系近; 从分支长度
分析，几株根球壳孢菌株与大多该属真菌的进化程
度相当。
表 1 凋落物中真菌的分离频率
Tab. 1 The isolation frequency of fungi in Pinus armandii litter
属
Genus
海拔 Elevation /m
2 460 2 510 2 650 2 750
分离频率
Isolation frequency(% )
Mucor sp． 0. 341 1. 712 0. 378 0. 034
Trichoderma sp． 0. 933 0. 105 0. 301 0. 023
Cladosporium sp． 0. 467 3. 053 — 20. 694
Ｒhizosphaera sp． 1. 138 0. 969 0. 343 0. 023
Phoma sp． — 8. 141 — —
Penicillium sp． 55. 781 12. 340 16. 239 56. 024
Talaromyces sp． 7. 965 45. 413 53. 139 10. 221
Thysanophora sp． 3. 641 6. 946 3. 813 —
Umbelopsis sp． — 19. 706 — —
Pestalotiopsis sp． — 1. 615 — 1. 023
Alternaria sp． 0. 626 — 0. 009 —
Allantophomopsis sp． 29. 108 — — 0. 230
Fusarium sp． — — 0. 017 —
Coprinellus sp． — — 24. 045 11. 727
Ceuthospora sp． — — 1. 717 —
真菌数量 Number of fungi /(103 cfu·g － 1 ) 8. 788 12. 382 11. 645 8. 698
38
林 业 科 学 52 卷
图 1 采用 NJ 法对 23 个分类单元建立系统发育树
Fig． 1 Phylogenic tree based on NJ analysis of ITS data for evolutionary relationships of 23 taxa
数字表示不同分类单元的距离; 符号表示不同目:●丝孢目;○球壳孢目;△炭角菌目;▲散囊菌目;◆瘤座孢目;■毛霉目;★伞菌目;
◇柔膜菌目;☆球壳目。Numbers on branches indicate distances among different taxa． Symbols represent the different orders appeared in the
analysis: ● Hyphomycetales; ○Sphaeropsidales; △Xylariales; ▲ Eurotiales; ◆ Tuberculariales; ■ Mucorales; ★Agaricales;
◇Helotiales; ☆Sphaeriales．
2. 3 根球壳孢菌的形态特征
根球壳孢菌在 PDA 平板上培养 12 天后，通过
菌落形态和显微观察发现，根球壳孢菌气生菌丝均
不发达或无，菌丝有隔且具分枝，菌丝宽 3 ～ 9 μm;
分生孢子椭圆形至长椭圆形，大小为(6 ～ 14) μm
× (4 ～ 7) μm。根据菌落颜色等特征，可将其归为
3 种不同的形态类型，代表菌株为 Ｒ． sp． 1，Ｒ． sp． 2
和 Ｒ． sp． 2，用于后期的分解试验。3 株菌株在 PDA
平板上生长速度不同，Ｒ． sp． 1(6. 3 cm) ＞ Ｒ． sp． 3
(5. 5 cm) ＞ Ｒ． sp． 2(5. 3 cm)，其菌落形态如图 2 所
示。
2. 4 根球壳孢菌的室内分解及纤维素酶活性
在室内发酵培养的前期，菌丝处于生长初期，通
过利用松针破碎时所释放的可利用糖类满足生长需
要;后期随着易分解成分消耗至尽，菌丝为了生存需
求便开始生成酶类对难溶物质进行降解。试验结果
显示，第 9 天时，各纤维素酶类活性均开始出现上升
趋势;第 13 天时，3 株根球壳孢菌株以及二郎山散
斑壳的内切纤维素酶和 β －葡聚糖酶活性均达到峰
值，而外切纤维素酶活性则在第 17 天时达到峰值;
随后至第 21 天，各酶活表现出下降趋势直至一个较
平稳的状态(图 3)。
同时，比较不同菌株在峰值的各纤维素酶活性大
小发现，根球壳孢菌与二郎山散斑壳之间的各酶活能
力相当。内切纤维素酶活性最大值为 Ｒ． sp． 1(0. 820
U·mL － 1) ＞ L． erlangsshanense(0. 777 U·mL － 1 ) ＞ Ｒ．
sp． 3(0. 713 U·mL － 1) ＞ Ｒ． sp． 2(0. 638 U·mL － 1 ); 菌
株 Ｒ． sp． 1 外切纤维素酶活性最高为 0. 821 U·mL － 1，
其次是 Ｒ． sp． 3(0. 717 U·mL － 1 )，Ｒ． sp． 2(0. 676 U·
mL － 1)，L． erlangshanense(0. 568 U·mL － 1); 而 β －葡
48
第 1 期 许秀兰等: 华山松凋落针叶上的真菌多样性及 4 株真菌的纤维素分解能力
图 2 PDA 平板上 3 株供试菌株的菌落形态
Fig． 2 The colony morphology of three strains of Ｒhizosphaera on PDA medium
图 3 室内分解过程中纤维素酶活性动态变化
Fig． 3 Dynamic activities of EG，CBH and BGL produced by Ｒ． sp． during the degradation
聚糖酶最高酶活性大小是 Ｒ． sp． 1(0. 655 U·mL －1) ＞
L． erlangshanense(0. 531 U·mL － 1) ＞ Ｒ． sp． 3(0. 498
U·mL － 1) ＞ Ｒ． sp． 2(0. 434 U·mL － 1)。
比较分析菌株分解松针的质量损失情况(图 4)
发现，在整个发酵过程中，松针的质量损失率随着时
间延长不断增加。L． erlangshanense 的平均质量损
失率为 15. 74%，分解速率为 0. 63%·d － 1; Ｒ． sp． 1
的平均质量损失率为 12. 00%，分解速率为 0. 48%·
d － 1; 其次是 Ｒ． sp． 3 (13. 40%，0. 54%·d － 1 )和 Ｒ．
sp． 2(12. 20%，0. 49%·d － 1)。根球壳孢菌和二郎山
散斑壳在针叶降解过程中均存在一定的降解能力，
但质量损失率在菌株之间均无显著差异。
3 结论与讨论
真菌作为微生物的一大类群，其应用受到广泛
关注，如内生真菌对病原菌的拮抗作用(顾沛雯等，
图 4 华山松针叶分解的质量变化
Fig． 4 Mass change of Pinus armandii needles in decomposition
2012; 蒋萍等，2007; 王静等，2013)、腐生真菌对
森林凋落物的分解作用(田朝光等，2010)等。森林
凋落物是森林生态系统中物质与能量的重要载体，
58
林 业 科 学 52 卷
凋落物分解在森林生态系统养分循环中极其重要。
影响凋落物分解的因素主要有气候因子( Chen et
al．，2000; 李雪峰等，2007)、凋落物自身性质(Xu et
al．，2005)和生物因子( Findlay et al．，2002; Wright
et al．，2005)。微生物是生物因子的重要组成部分，
其中又以真菌为主 (Korkama et al．，2008; Song et
al．，2004; 郝杰杰等，2006)，而腐生真菌是重要的
参与者(Boberg et al．，2011)。目前，木霉属、青霉属
和曲霉属等丝状真菌是纤维素分解研究较多的真菌
类群(郝杰杰等，2006; 李纪顺等，2013; 宋福强
等，2009)。O’Brien等(2005)借助分子手段研究发
现，子囊菌在凋落物分解中占据优势。早期，Osono
等(2002)认为担子菌对凋落物分解也发挥着重要
作用，但因担子菌具有较高的木质素分解能力 (严
海元，2010; Boberg et al．，2011)，故该类真菌主要
在分解中后期发挥作用。
本研究从华山松凋落物针叶中分离到的真菌有
半知菌、子囊菌、接合菌以及担子菌。受环境等因子
的影响，真菌群落组成会有差异，但 5 个优势种在 4
个海拔凋落物中均有分布，说明它们具有普遍存在
性。其中，华山松凋落针叶中占优势的青霉属以及
木霉属等半知菌类真菌，无疑为凋落物的纤维素分
解提供了充分保障。在华山松凋落物分解前期，仅
分离得到 1 株担子菌 Umbelopsis isabellina，说明后期
参与凋落物分解的担子菌主要来源于土壤等环境。
隶属于 5 属的子囊真菌为华山松凋落物早期的第 2
大类真菌，这些真菌的菌丝及其产生的胞外酶共同
作用于凋落物的前期分解，同时为后期分解提供基
础。综上可知，半知菌和子囊菌在凋落针叶分解初
期发挥主要作用，随着降解的发生，环境中微生物不
断进入并参与分解，真菌类群发生变化以有利于凋
落物中难分解成分的降解。
目前，国外关于 Ｒ． sp．的研究颇有争议，国内更
是报道甚少。近期发现，Ｒ． kalkhoffii 在四川二郎山
林场活体云杉针叶中寄生(许秀兰等，2014)。本研
究首次在二郎山林场 4 个海拔的华山松凋落物中分
离得到该属真菌，可见，该属真菌的寄主及分布广，
在针叶树上扮演的角色有待进一步研究。
在华山松针叶的分解试验中，Ｒ． sp． 与 L．
erlangshanense 均具有分泌纤维素酶的能力但差异
不显著。在病原菌与寄主植物关系中，致病因子常
分为毒素、酶和激素 3 大类。目前，林木病原真菌的
致病机制研究较多的是毒素的作用 (李姝江等，
2012; 骆军等，2010)。但李宝聚等(2000)通过对
黄瓜黑星病菌(Cladosporium cucumerinum)的研究发
现，细胞壁分解酶为该病害的主要致病因子; 且病
原菌产生的纤维素酶可分解细胞壁使植物细胞的超
微结 构 发生 病变 (李 宝聚 等，2001 )。杨 媚 等
(2012)研究水稻纹枯病菌(Ｒhizoctonia solani)发现，
纤维素酶和果胶酶对水稻叶片都具有显著的细胞膜
损伤和组织浸渍作用。Lophodermium sp． 主要寄生
于松属植物，常被作为病原菌予以报道。Boberg 等
(2011)的分解试验发现，兼性内生松针散斑壳( L．
pinastri)可对樟子松针叶中的纤维素产生分解作用。
L． erlangshanense 多寄生于华山松凋落的针叶上，偶
尔也在活体针叶顶端可见(刘应高等，2009)，但最
终导致针叶枯死而发生落针病害。本研究中，Ｒ．
sp． 与 L． erlangshanense 产生的纤维素酶作用机制
是否与其致病力相关有待深入研究，但根球壳孢菌
在二郎山林场华山松凋落针叶中广泛存在，且具有
分泌纤维素酶能力，在华山松凋落物分解中具有腐
生能力。
参 考 文 献
陈 辉，唐 明，刘安全，等 ． 1993． 人工竹林凋落物中真菌群落的
研究 ． 西北林学院学报，8(4) : 41 － 45．
(Chen H，Tang M，Liu A Q，et al． Mycoflora of litter in bamboo．
Journal of Northwest Forestry College， 8 ( 4 ) : 41 － 45． ［in
Chinese］)
顾沛雯，郝 丽，徐 润，等 ． 2012． 宁夏白芨滩自然保护区苦豆子
内生真菌的区系组成及其抑菌活性 ． 西北农林科技大学学报:
自然科学版，40(5) :209 － 216．
(Gu P W，Hao L，Xu Ｒ，et al． 2012． Diversity and antimicrobial
activity of endophytic fungi in Sophora alopecuroides L． from Baijitan
National Nature Ｒeserve of Ningxia． Journal of Northwest A＆F
University:Natural Sciences Edition，40 ( 5 ) : 209 － 216． ［in
Chinese］)
郝杰杰，宋福强，田兴军，等 ． 2006． 几株半知菌对马尾松落叶的分
解———木质纤维素酶的活性动力学 ． 林业科学，42(11) : 69 －
75．
(Hao J J，Song F Q，Tian X J，et al． 2006 Decomposition of Pinus
massoniana needle driven by deuteromycetes—dynamics of
lignocellulolytic enzymes． Scientia Silvae Sinicae，42 ( 11 ) : 69 －
75． ［in Chinese］)
蒋 萍，吴小芹，叶建仁，等 ． 2007． 松树两种病原菌拮抗微生物的
筛选 ． 南京林业大学学报:自然科学版，31(1) : 59 － 62．
( Jiang P，Wu X Q，Ye J Ｒ，et al． 2007． Screening of antagonistic
microbes to two kinds of pine trees pathogens． Journal of Nanjing
Forestry University:Natural Sciences Edition，31(1) : 59 － 62． ［in
Chinese］)
李雪峰，韩士杰，张 岩 ． 2007． 降水量变化对蒙古栎落叶分解过
程的间接影响 ． 应用生态学报，18(2) : 261 － 266
(Li X F，Han S J，Zhang Y． 2007． Indirect effects of precipitation on
litter decomposition of Quercus mongolica． Chinese Journal of
Applied Ecology，18(2) : 261 － 266． ［in Chinese］)
68
第 1 期 许秀兰等: 华山松凋落针叶上的真菌多样性及 4 株真菌的纤维素分解能力
李纪顺，陈 凯，李红梅，等 ． 2013． 通过染色体整合 β － 1，4 － 葡
聚糖酶基因 glu14 提高绿色木霉对小麦纹枯病的防治效果 ． 植
物病理学报，43(4) : 393 － 400．
(Li J S，Chen K，Li H M，et al． 2013． Enhanced bio-control activity of
Trichoderma viride against wheat sheath blight (Ｒhizoctonia cerealis)
through chromosomal integration of Bacillus megaterium β-1，4-
glucanase gene glu14． Acta Phytopathologica Sinica， 43 ( 4 ) :
393 － 400． ［in Chinese］)
李姝江，朱天辉 ． 2012． 杂交竹梢枯病菌毒素蛋白纯化及致病力 ．
林业科学，48(11) : 144 － 149．
( Li S J，Zhu T H． 2012． Purification of the toxic protein from Arthrinium
phaeospermun and its pathogenicity． Scientia Silvae Sinicae，48
(11) : 144 － 148． ［in Chinese］)
李宝聚，周长力，赵奎华，等 ． 2000． 黄瓜黑星病菌致病机理的研究
Ⅱ ．细胞壁降解酶及其在致病中的作用 ． 植物病理学报，30
(1) : 13 － 18．
(Li B J，Zhou C L，Zhao K H，et al． 2000． Pathogenic mechanism of
scab of cucumber caused by Cladosporium cucumerinum Ⅱ ． The cell
wall-degrading enzymes and its pathogenic action． Acta
Phytopathologica Sinica，31(1) : 13 － 18． ［in Chinese］)
李宝聚，周长力，赵奎华，等 ． 2001． 黄瓜黑星病菌致病机理的研究
Ⅲ ．细胞壁降解酶和毒素对寄主超微结构的影响及其协同作用 ．
植物病理学报，31(1) : 63 － 69．
(Li B J，Zhou C L，Zhao K H，et al． Pathogenic mechanism of scab of
cucumber caused by Cladosporium cucumerinum Ⅲ ． Effects and
synergism of cell wall － degrading enzymes and toxin produced by C．
cucumerinum on ultrastructure of cucumber． Acta Phytopathologica
Sinica，31(1) : 63 － 69． ［in Chinese］)
刘应高，潘 欣，杨 静，等 ． 2009． 华山松上散斑壳属一新种 ． 菌
物学报，28(4) : 473 － 475．
(Liu Y G，Pan X，Yang J，et al． 2009． A new species of the genus
Lophodermium on Pinus armandii． Mycosystema，28 ( 4 ) : 473 －
475． ［in Chinese］)
骆 军，刘应高，黄晓丽，等 ． 2010． 四川松针上散斑壳菌致病毒素
的确定 及 其 致 病 性 差 异 研 究 ． 林 业 科 学 研 究，23 ( 5 ) :
685 － 689．
(Luo J，Liu Y G，Huang X L，et al． 2010． Pathotoxin determination of
Lophodermium on pines in Sichuan Province and their differences in
pathogenicity． Forest Ｒesearch，23(5) : 685 － 689． ［in Chinese］)
任 玮 ． 1990． 云杉叶疫病的研究 ． 西南林学院学报，10 ( 2 ) :
176 － 179．
(Ｒen W． 1990． Studies on the needle blight of spruce． Journal of
Southwest Forestry College，10(2) : 176 － 179． ［in Chinese］)
宋福强，范晓旭，张星星，等 ． 2009． 三株丝状真菌分解樟子松凋落
物酶活性 ． 微生物学通报，36(5) : 635 － 639．
( Song F Q，Fan X X，Zhang X X，et al． 2009． Activies of Enzymes
during the litter of Pinus sylvestris var． mongolica degradation by
three strains of mycelial fungi． Microbiology，36 (5) : 635 － 639．
［in Chinese］)
田朝光，马延和 ． 2010． 真菌降解木质纤维素的功能基因组学研究
进展 ． 生物工程学报，26(10) : 1333 － 1339
(Tian C G，Ma Y H． 2010． Progress in lignocellulose deconstruction by
fungi． Chinese Journal of Biotechnology，26 ( 10 ) : 1333 － 1339．
［in Chinese］)
王 静，易晓华，魏 艳，等 ． 2013. 11 株侧柏内生真菌的农药活
性及分子生物学鉴定 ． 中国农学通报，29(15) : 183 － 187．
(Wang J，Yi X H，Wei Y，et al． Pesticide Activity and Molecular
Biology Identification of 11 Strains of Endophytic Fungi from
Platycladus orientalis ( L． ) Franco． Chinese Agricultural Science
Bulletin，29(15) : 183 － 187． ［in Chinese］)
许秀兰，张 翅，黄晓丽，等 ． 2014． 云杉叶栖真菌的群落结构与多
样性分析 ． 东北林业大学学报，42(3) : 122 － 125．
(Xu X L，Zhang C，Huang X L，et al． 2014． Community diversity of
dendrocola mycoflora in spruce needles． Journal of Northeast
Forestry University，42(3) : 122 － 125． ［in Chinese］)
许玉林，郑月霞，叶冰莹，等 ． 2013． 一株纤维素降解真菌的筛选及
鉴定 ． 微生物学通报，40(2) : 220 － 227．
(Xu Y L，Zheng Y X，Ye B Y，et al． 2013． Isolation and identification
of a cellulose degrading fungi． Microbiology，40 ( 2 ) : 220 － 227．
［in Chinese］)
杨 媚，杨迎青，郑 丽，等 ． 2012． 水稻纹枯病菌细胞壁降解酶组
分分析、活性测定及其致病作用 ． 中国水稻科学，26 ( 5 ) :
600 － 606．
(Yang M，Yang Y Q，Zheng L，et al． 2012． Component analysis，
activity measurement and pathogenic effect of cell wall degrading
enzymes from rice sheath blight pathogen Ｒhizoctonia solani．
Chinese Journal of Ｒice Science， 26 ( 5 ) : 600 － 606． ［in
Chinese］)
严海元，辜夕容，申 鸿 ． 2010． 森林凋落物的微生物分解 ． 生物学
杂志，29(9) :1827 － 1835．
(Yan H Y，Gu X Ｒ，Shen H． 2010． Microbial decomposition of forest
litter: a review． Chinese Journal of Ecology，19(9) : 1827 － 1835．
［in Chinese］)
Botella L，Diez J J． 2011． Phylogenic diversity of fungal endophytes in
Spanish stands of Pinus halepensis． Fungal Diversity，47 ( 1 ) :
9 － 18．
Boberg J B，Ihrmark K，Lindahl B D． 2011． Decomposing capacity of
fungi commonly detected in Pinus sylvestris needle litter． Fungal
Ecology，4(1) : 110 － 114．
Chen H，Harmon M E，Griffiths Ｒ P，et al． 2000． Effects of temperature
and moisture on carbon respired from decomposing woody roots．
Forest Ecology and Management，138(1) : 51 － 64．
Findlay S，Tank J，Dye S，et al． 2002． A cross-system comparison of
bacterial and fungal biomass in detritus pools of headwater streams．
Microbial Ecology，43(1) : 55 － 66．
Hoff J A，Klopfenstein N B，McDonald G I， et al． 2004． Fungal
endophytes in woody roots of Douglas-fir ( Pseudotsuga menziesii)
and ponderosa pine (Pinus ponderosa) ． Forest Pathology，34 (4) :
255 － 271．
Hu H L，Jeewon Ｒ，Zhou D Q，et al． 2007． Phylogenetic diversity of
endophytic Pestalotiopsis species in Pinus armandii and Ｒibes spp． :
evidence from rDNA and tubulin gene phylogenies． Fungal
Diversity，24: 1 － 22．
Juzwik J． 1993． Morphology，cultural-characteristics，and pathogenicity
of Ｒhizosphaera kalkhoffii on Picea spp． in northern Minnesota and
Wisconsin． Plant Disease，77(6) : 630 － 634．
78
林 业 科 学 52 卷
Kumi J，Lang K J． 1979． The susceptibility of various spruce species to
Ｒhiosphaera kalkhoffii and some cultural characteristics of the fungus
in vitro． Eurppean Journal of Forest Pathology，9(1) :35 － 46．
Korkama Ｒ T，Muller M M，Pennanen T． 2008． Decomposition and
fungi of needle litter from slow- and fast-growing Norway spruce
(Pice abies) clones． Microbial Ecology，56(1) : 76 － 89．
Livsey S，Barklund P． 1992． Lophodermium piceae and Ｒhizosphaera
kalkhoffii in fallen needles of Norway spruce ( Picea abies ) ．
Eurppean Journal of Forest Pathology，22(4) : 204 － 216．
Martinez A T， Ｒamirez C． 1983． Ｒhizosphaera oudemansii
( Sphaeropsidales) associated with a needle cast of Spanish Abies
pinsapo． Mycopathologia，83(3) : 175 － 182．
Osono T，Takeda H，2002． Comparison of litter decomposition ability
among diverse fungi in a cool temperate deciduous forest in Japan．
Mycologia，94(2) : 421 － 427．
O’Brien H E，Parrent J L，Jackson J A，et al． 2005． Fungal community
analysis by large-scale sequencing of environmental samples．
Applied and Environmental Microbiology，71(9) : 5544 － 5550．
Song F Q，Tian X J，Li Z Q，et al． 2004． Diversity of filamentous fungi
in organic layers of two forests in Zijin Mountain． Journal of Forest
Ｒesearch，15(4) : 273 － 279．
Teather Ｒ M，Wood P J． 1982． Use of congo red-polysaccharide
interactions in enumeration and characterization of cellulolytic
bacteria from the bovin rumen． Applied and Environmental
Microbiology，43(4) : 777 － 780．
Wright M S，Covich A P． 2005． Ｒelative importance of bacteria and
fungi in a tropical headwater stream: Leaf decomposition and
invertebrate feeding preference． Microbial Ecology，49(4) : 536 －
546．
Xu X N，Hirata E． 2005． Decomposition patterns of leaf litter of seven
common canopy species in a subtropical forest: N and P dynamics．
Plant and Soil，273(1 /2) : 279 － 289．
You C J，Tian C M，Liang Y M，et al． 2013． First report of pitch canker
disease caused by Ｒhizosphaera kalkhoffii on Pinus sylvestris in
China． Plant Disease，97(2) : 283 － 284．
(责任编辑 朱乾坤)
88