全 文 ：第 51 卷 第 4 期
2 0 1 5 年 4 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 51，No. 4
Apr．，2 0 1 5
doi:10．11707 / j．1001-7488．20150408
收稿日期: 2014 － 06 － 27; 修回日期: 2014 － 10 － 12。
基金项目: 国家农业部公益性行业(农业)科研专项“蚕桑资源高值化加工利用技术及设备”(201403064) ; 国家现代农业产业技术体系建
设专项(CAＲS-22)。
* 余茂德为通讯作者。
桑树 MLX56 基因家族特性、克隆及表达分析*
韩淑梅 李 军 吕蕊花 王晓红 刘长英 赵爱春 鲁 成 余茂德
(西南大学生物技术学院 重庆 400715)
摘 要: 【目的】桑树乳胶蛋白基因在抗虫防御过程中起着重要的作用。从桑树基因组数据库中鉴定桑树
MLX56 基因家族，并进行基因进化、基因结构及基因的表达分析，为桑树 MLX56 基因的功能研究及利用奠定基础。
【方法】利用桑树基因组数据库，采用生物信息学方法，分析桑树 MLX56 基因家族结构及进化关系，并对 MLX56 基
因家族成员进行鉴定; 利用 MEGA4. 1 软件进行系统进化树分析; 通过半定量 ＲT-PCＲ 技术研究 MLX56 基因在桑
树不同种及不同组织之间的表达水平，构建原核表达载体 pET-28a-MLX56-6，并将其转入大肠杆菌 BL21(DE3)中，
IPTG 诱导融合蛋白表达，分别收集不同诱导时间段的菌液，SDS-PAGE 检测融合蛋白的表达情况。将高效表达时
段的菌液进行超声破碎，SDS-PAGE 检测目的蛋白的可溶性; 利用 Western Blot 印迹验证目的蛋白的表达。并研究
该基因对大肠杆菌生长速率的影响。【结果】利用桑树基因组数据库，鉴定 6 个 MLX56 家族基因，该家族基因含有
2 个几丁质结合域，且都含有信号肽，属于分泌蛋白。此外还克隆到 1 个新的 MLX56 基因，命名为 MLX56-7
(GenBank 登录号为 KJ496133)。系统进化树显示桑树 MLX56 基因与西洋接骨木类橡胶蛋白同源性最高，同源性
达 66%，与茶树几丁质酶、葡萄几丁质酶同源性较低，同源性分别为 49% 和 48%。半定量 ＲT-PCＲ 分析表明，
MLX56-1，MLX56-2，MLX56-4，MLX56-5，MLX56-6 和 MLX56-7 在桑树不同种中均有表达，组织表达特异性分析表明
MLX56-2，MLX56-4，MLX56-5，MLX56-6 和 MLX56-7 基因在广东桑‘桂优 62 号’各个组织中都有表达，MLX56-1 基因
仅在叶柄及茎中表达，MLX56-3 基因在桑树不同种及广东桑‘桂优 62 号’各个组织中都没有检测到表达。原核表
达结果表明，MLX56-6 蛋白在终浓度为 0. 5 mmol·L － 1的 IPTG 诱导下成功表达; 融合蛋白的可溶性检测表明该蛋
白主要以包涵体的形式存在; Western Blot 印迹检测也证实大肠杆菌 BL21(DE3)中表达了 1 个分子量为56 kDa的
蛋白。但在诱导表达过程中，大肠杆菌 BL21(DE3)生长速率受到 MLX56-6 基因的抑制。【结论】MLX56 基因家族
在桑树进化过程中发生了基因的重复，且在结构上出现了分化。根据 MLX56 基因家族的蛋白及结构特征，该基因
家族可能属于具有凝集素活性的几丁质酶。MLX56 基因在桑树不同种及不同组织中的表达存在差异，暗示这些基
因在桑树不同种及不同组织中的功能存在一定差异。
关键词: 桑树; MLX56 基因家族; 系统进化; 基因表达
中图分类号: S718. 46 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2015)04 － 0060 － 11
Characteristics，Cloning and Expression of the
MLX56 Gene Family in Mulberry
Han Shumei Li Jun Lü Ｒuihua Wang Xiaohong Liu Changying Zhao Aichun Lu Cheng Yu Maode
(College of Biotechnology，Southwest University Chongqing 400715)
Abstract: 【Objective】Mulberry(Morus) latex gene plays an important role in determining anti-insect and defense．
Identification the MLX56 gene family from the mulberry genome database，and analysis of phylogeny，gene structure and
gene expression in mulberry will be helpful to study the functions of plant latex genes．【Method】Based on mulberry
genome database，bioinformatics approach was used to analyze the structure and evolution of mulberry MLX56 gene family，
a phylogenetic tree was created using the MEGA4. 1 program． The expression of MLX56 gene in different mulberry species
and different tissues were analyzed using semi-quantitative TＲ-PCＲ． A recombinant plasmid pET-28a-MLX56-6 was
constructed and transferred into Escherichia coli BL21 (DE3) ． IPTG was used to induce MLX56-6 protein expression．
Samples were collected from bacterial suspension at different times of induction and SDS-PAGE was used to analyze the
protein expressed by E． coli BL21 ( DE3 ) ． Ultrasonic wave was used to break the efficiently expressed bacterial
第 4 期 韩淑梅等: 桑树 MLX56 基因家族特性、克隆及表达分析
suspension，and SDS-PAGE was used to detect the solubility of MLX56-6 protein． Western Blot confirmed the successful
expression of MLX56-6 in E． coli BL21 (DE3)，and the effect of the MLX56 gene on the growth rate of E． coli was also
studied．【Ｒesult】A total of 6 MLX56 genes were identified from mulberry genome database，the mulberry MLX56 contains
two chitin-binding domains，and they all have signal peptide，belongs to secretory protein． A new MLX56 gene MLX56-7
(GenBank number:KJ496133) was cloned． Phylogenetic analysis revealed that the highest homdogy (66% ) was between
mulberry MLX56 gene and Sambucus nigra hevein-like protein，and a lower value ( 49%，48% ) between mulberry
MLX56 and Camellia sinensis chitinase and Vitis vinifera chitinase． The semi-quantitative ＲT-PCＲ showed that MLX56-1，
MLX56-2，MLX56-4，MLX56-5，MLX56-6 and MLX56-7 were expressed in all mulberry species． Tissue specific
expression analysis revealed that MLX56-2，MLX56-4，MLX56-5，MLX56-6 and MLX56-7 were expressed in all tissues of
M． atropurpurea‘Guiyou62’，MLX56-1 was expressed only in petioles and stems． MLX56-3 gene was not detected in
mulberry species and tissues in M． atropurpurea‘Guiyou62’． Prokaryotic expression results showed that the fusion protein
was successfully expressed with 0. 5 mmol·L － 1 IPTG induction． Solubility analysis showed that the fused protein mainly
existed as inclusion bodies． Western Blot confirmed that the molecular weight of the recombinant MLX56-6 was about 56
kDa． But the E． coli growth rate was inhibited by MLX56-6 gene．【Conclusion】In the process of mulberry evolution，gene
duplication happened in MLX56 gene family，and differentiation occurred in the structure of the gene family． Accordiong
to the protein and structure characteristics of MLX56 gene family，the gene family may belong to a chitinase with lectin
activity． The diversity among different species and tissues in MLX56 gene expression reveals that the functions of these
genes were different among different mulberry species and among different tissues of the same species．
Key words: Morus; MLX56 gene family; phylogeny analysis; gene expression
地球上有 1. 2 ～ 3. 6 万种植物能够分泌乳汁
(Dussourd et al．，1991; 1987; Farrel et al．，1991;
Harborne，1993)，桑树(Morus)的根、茎韧皮部及叶
的维管束中均有乳管，是一种能分泌乳汁的木本植
物(柯益富等，1997)。乳汁成分富含多种酶类及蛋
白质，例如半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、几丁质
酶、凝集素等。木瓜蛋白酶和无花果蛋白酶都是半
胱氨酸蛋白酶的代表，其中，番木瓜(Carica papaya)
植物乳汁中含有的木瓜蛋白酶，对杂食性昆虫具有
较强的致死性，对黏虫的生长具有抑制作用(Konno
et al．，2004)。白花牛角瓜(Calotropis procera)植物
乳汁中含有几丁质酶，对四纹豆象 ( Callosobruchus
maculatus) 具有明显的毒害作用 ( Ｒamos et al．，
2007)，长叶莴苣( Lactuca dolichophylla)植物乳汁中
含有多酚氧化酶( PPO)、过氧化物酶( POD)及苯丙
氨酸解氨酶(PAL)，对带状黄瓜甲虫具有较强的耐
受性(Sethi et al．，2009)。
MLX56 是从桑树乳胶中纯化出来的一种几丁
质结合蛋白，大小为 56 kDa，在很低浓度时就表现
出对杂食性昆虫的抑制作用，N － 端含有 2 个几丁
质结合域，中间有一段伸展蛋白区域，C －端含有无
活性的类几丁质酶结构域 (Wasano et al．，2009 )。
MLX56 蛋白对多种杂食性昆虫具有较强的毒害作
用，但家蚕(Bombyx mori)却不受影响，说明 MLX56
基因在桑树抗虫防御过程中起重要作用。大量的研
究显示，几丁质酶在植物中不仅起到抗真菌病害的
作用，而且在植物发育、抗胁迫及共生固氮等方面有
着重要作用。人们对植物乳汁的研究越来越深入，
而桑科(Moraceae)植物均含有乳汁，不同种属间的
乳汁成分也不一样，说明了研究桑树乳汁的必要性。
本研究以桑树全基因组序列为对象，利用生物
信息学方法，鉴定桑树基因组中乳胶蛋白基因家族，
从分子水平解析 MLX56 基因家族的基本结构和组
织表达，并探讨桑树乳汁中的防御蛋白与其他植物
乳汁中防御蛋白的进化关系，对进一步研究桑树
MLX56 基因与鳞翅目(Lepidoptera)昆虫(尤其是家
蚕)的相互关系具有重要意义。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
1. 1. 1 植物材料 白桑(M． alba)品种‘枝垂桑’、
‘新一之濑’、‘红果 1 号’、‘红果 2 号’、‘紫荆桑’;
鲁桑(M． multicaulis)品种‘湖桑 32 号’、‘小鸡冠’;
华桑(M． cathayana)品种‘圆叶皮桑’; 广东桑(M．
atropurpurea)品种‘大 10’、‘伦教 40 号’、‘斯里兰
卡 1 号桑’、‘桂优 62 号’; 鸡桑(M． australis)品种
‘柬埔寨桑’; 山桑 (M． bombycis)品种‘西农 6071
桑’; 瑞穗桑(M． mizuho)品种‘火桑 1 号’; 以及长
果桑 ( M． laevigata )、印度桑 ( M． indica )、黑桑
(M． nigra)均取自西南大学桑树种质资源圃，选取
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林 业 科 学 51 卷
桑树幼嫩组织，用液氮速冻后保存于 － 80 ℃冰箱中
备用。
1. 1. 2 试验试剂 pMD19-T 载体、ＲNA 提取试剂
盒(ＲNAiso plus)、反转录酶 M-MLV、T4 连接酶、限
制性 内 切 酶 均 购 自 TaKaＲa 公 司，大 肠 杆 菌
(Escherichia coli) BL21(DE3)表达感受态细胞购自
北京全式金公司，一抗 (兔抗 His 标签多单克隆抗
体)、二抗购自南京金斯瑞公司，其他试剂为国产分
析纯。
1. 2 方法
1. 2. 1 桑树 MLX56 基因家族的鉴定与引物设计
根据 NCBI 已 报 道 的 桑 树 MLX56 蛋 白 序 列
(GenBank: EF535852. 2)，在桑树基因组数据库中
进行 BLAST 检索，获得相似度较高的序列，在 NCBI
数据库中利用 BLASTX 程序进行比对，以获得假定
的蛋白序列。根据桑树 MLX56 基因序列的特点，设
计引物 F1，Ｒ1 ( F1: ATGAAGTTKAKAACTCTTTT
AATMＲ; Ｒ1: CGAGCAACTTCYGAGAAATＲCGTTT)
用于扩增基因全长序列。
1. 2. 2 总 ＲNA 提取及反转录 取 0. 1 ～ 0. 2 g 桑树
组织于预冷的研钵中迅速研磨成粉末，参照 TaKaＲa
公司 ＲNA 抽提试剂盒说明书提取桑树组织总
ＲNA，利用 DNA 酶对总 ＲNA 进行消化。利用 1%琼
脂糖变性凝胶电泳及微量紫外分光光度计检测
ＲNA 质量和浓度。用 DNA 酶消化过的 ＲNA 为模
板，以 Ｒandom primer 为引物，利用 M-MLV 反转录
酶合成 cDNA 第 1 链， － 20 ℃保存备用。
1. 2. 3 PCＲ 产物的克隆与测序 用 DNA 凝胶回收
试剂盒回收 PCＲ 产物，将回收产物与 pMD19-T 载
体连接，经转化、抗性筛选后，随机挑选单菌落，扩大
培养后进行菌落 PCＲ 鉴定。选取阳性克隆送至南
京金斯瑞基因有限公司进行测序。
1. 2. 4 MLX56 基因的生物信息学分析 通过
MUSCLE 程序对克隆到的桑树 MLX56 基因序列进
行比对分析，利用 MEGA4. 1 程序，采用邻接法
(Neighbor-Joining，NJ)生成 MLX56 基因的系统进化
树，校验参数重复 1 000 次。使用 SMAＲT( http:∥
smart． embl-heidelberg． de /) 数据库工具建立桑树
MLX56 基因结构域模型，同时使用 SWISS-MODEL
(http:∥swissmodel． expasy． org /)网站对桑树 MLX56
基因的三维结构进行分析。MLX56 基因氨基酸序
列的分子量、等电点分析在 ExPasy 网站 ( http:∥
web． expasy． org /) 上进行。信号肽预测在网站
( http: ∥ www． cbs． dtu． dk / services / SignalP /) 上
进行。
1. 2. 5 18 份桑树种质材料 ＲT-PCＲ 分析 以 18 份
桑树种质材料的幼叶 ＲNA 为材料，利用桑树肌动蛋
白 基 因 MaACT3 ( Actin-F: AGAACACCCTGTT
CTCCTCACT; Actin-Ｒ: GATGACCTGTCCATCTGGC
AA) (李军等，2011) 为内参，调整各样品 ＲNA 浓
度，根据鉴定到的 MLX56 基因家族相关序列设计特
异引物(表 1)，采用半定量 ＲT-PCＲ 法研究 MLX56
基因家族的 7 个基因在不同桑树种质材料幼叶中的
表达情况。
表 1 半定量 PCＲ 引物
Tab． 1 The primers for semi-quantitative PCＲ analysis
基因
Gene
上游引物
Forward primer(5 － 3)
下游引物
Ｒeverse primer(5 － 3)
产物
Product / bp
MLX56-1 GGAGCTTGCTGCTTTCTTTGCTCAA ATACCTCTCATAGTGGTAATACGGC 465
MLX56-2 CCCGATCACAGGAAGGTGTGGAAGA TTGTCATTGCCATTGGTGGTCTCAT 450
MLX56-3 GGAGCTTGCTGCTTTCTTTGCTCAA ATAGTACCCATTACTAGTAGTAATA 481
MLX56-4 CCTAGAATGACCGATGTGGAAGAGC ATATCCCCATGCATATGGATCTTGT 413
MLX56-5 ACGGCAACCTGTGTTGTAGCCATTG ATTAGAGCAGAAAGGAGAGAATTCC 325
MLX56-6 CCCGCCTCCACCAAGTCCACCTCCA ATATCACCAGTAGTACCAAAATGAG 429
MLX56-7 TGTTGGAGTTCACCAAGCCCACCTC ATTAGAGCAGAAAGGAGAGATTCCC 203
1. 2. 6 广东桑‘桂优 62 号’ＲT-PCＲ 分析 以广东
桑‘桂优 62 号’成熟叶、幼叶、叶柄、茎、表皮、根
ＲNA 为材料，调整各样品 ＲNA 浓度，根据鉴定到的
MLX56 基因家族相关序列设计特异引物(表 1)，采
用半定量 ＲT-PCＲ 法研究 MLX56 基因家族的 7 个
基因在‘桂优 62 号’不同组织的表达情况。
1. 2. 7 桑树 MLX56-6 基因原核表达分析 根据已
克隆到的 MLX56-6 基因序列，设计原核表达引物
MLX56-6F: 5-CGAGCTCATGAAGTTKAGAACTCTT
TTAAT-3; MLX56-6Ｒ: 5-CCCTCGAGTTAGATGCG
AGCAACTTCYGAGA-3(下划线为 SacⅠ和 XhoⅠ酶
切位点)。将 PCＲ 产物经 SacⅠ和 XhoⅠ酶切消化
后插入已被 SacⅠ和 XhoⅠ酶切消化后的表达质粒
载体 pET-28a ( + )，构建原核表达载体 pET-28a-
MLX56-6，将重组质粒转化大肠杆菌 BL21(DE3)表
达感受态细胞中，挑取阳性重组子，进行测序鉴定。
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第 4 期 韩淑梅等: 桑树 MLX56 基因家族特性、克隆及表达分析
将鉴定好的阳性表达菌株 pET-28a-MLX56-6 接
种于 5 mL LB 液体培养基(含 50 μg·mL － 1卡那霉
素)，37 ℃振荡培养 12 h; 然后按 1 ∶ 100 比例接种
于 100 mL TB 液体培养基(含 50 μg·mL － 1卡那霉
素)中，37 ℃培养至 OD600 nm值在 0. 5 ～ 0. 8 之间，加
IPTG 至终浓度为 0. 5 mmol·L － 1，28 ℃诱导蛋白表
达，分别取 0，2，3，4，5，6 h 的菌体，对所收集菌体处
理后，进行 SDS-PAGE 电泳验证。
1. 2. 8 融合蛋白 Western Blot 检测 收集 6 h 的大
肠杆菌 BL21(DE3)菌液，4 ℃，12 000 r·min － 1离心
10 min，将得到的菌体用 PBS 缓冲液溶解后，进行超
声波破碎，直到溶液透明度高、黏稠度低时，停止超
声处理。将破碎后菌体离心(4 ℃，12 000 r·min － 1，
共 10 min)，分别收集上清和沉淀，经 12% SDS-
PAGE 电泳后，80 V 转膜 1. 5 h，用封闭液( TBST +
5%脱脂奶粉)4 ℃封闭过夜，随后与鼠抗 6 × His 单
克隆抗体(1∶ 1 000)室温孵育 1 h，TBST 洗膜缓冲液
清洗 3 次; 再与辣根过氧化酶标记的羊抗小鼠二抗
(1∶ 5 000)孵育 1 h 后，TBST 洗膜缓冲液清洗 3 次;
ECL 避光显色 5 min，置于成像系统曝光 1 min 后拍
照记录。
图 1 桑树 MLX56 基因家族结构
Fig． 1 The structure of MLX56 gene family in mulberry
1. 2. 9 pET-28a-MLX56-6 重组质粒不同培养时间
生长速率的测定 将鉴定好的阳性表达菌株
pET-28a-MLX56-6接种于 5 mL LB 液体培养基(含
50 μg·mL － 1卡那霉素)，37 ℃恒温振荡 12 h; 然后
按1∶ 100比例接种于 100 mL TB 液体培养基(含 50
μg·mL － 1卡那霉素) 中，37 ℃ 培养至 OD600 nm值在
0. 5 ～ 0. 8 之间，加 IPTG 至终浓度为 0. 5 mmol·L － 1;
混匀后，以每支 5 mL 分装于标记为 0，0. 5，1，1. 5，
2，2. 5，3，…，6 的 13 支试管中，迅速把标记为 0 除
外的其余试管置于 28 ℃，220 r·min － 1摇床上振荡
培养; 以后每隔 0. 5 h 取出试管，以无菌的 TB 液体
培养基作为对照，在 600 nm 波长下，用分光光度计
测定不同生长时间培养液的 OD 值。每个样品 3 个
重复，取其平均值。
2 结果与分析
2. 1 桑树 MLX56 家族基因结构及系统进化分析
通过在桑树基因组数据库中 BLASTX 比对分
析，获得了 6 个假定的 MLX56 基因，位于 Scaffold
306 上，为串联重复序列(图 1)，各基因间核苷酸
序列具有极高的相似性，仅有几个碱基的差别。
将这 6 个 MLX56 基 因 分 别 命 名 为 MLX56-1，
MLX56-2， MLX56-3， MLX56-4， MLX56-5 和
MLX56-6。6 个桑树 MLX56 基因编码区序列长
约 2 000 bp，其中，4 个 MLX56 基因内含子数为
1，另外 2 个 MLX56 基因含有 2 个内含子。通过
对桑树 MLX56 基因家族的多重比对分析(图 2)，
结 果 显 示 MLX56-3，MLX56-1，MLX56-5 和
MLX56-6 聚类于一支，MLX56-2 和 MLX56-4 聚类
于一支，2 个类群各内部成员之间相似度较高，但
基因结构差别较大。
在 NCBI 数据库中下载了葡萄 ( Vitis vinifera)、
茶树(Camellia sinensis)、苦瓜(Momordica charantia)
等 8 个种的 9 个相似 MLX56 基因，通过同源性比对
发现 桑 树 编 码 的 氨 基 酸 序 列 与 西 洋 接 骨 木
(Sambucus nigra)类橡胶蛋白(AAL30422. 1)的同源
性为 66%，与欧洲栗(Castanea sativa)内切几丁质酶
(AAB01895. 1)、湖北海棠(Malus hupehensis)几丁质
酶(ACJ38195. 1)、苦瓜几丁质酶(ABD66068. 1)、二
色 补 血 草 ( Limonium bicolor ) 几 丁 质 酶
(ABD92819. 1)、异株荨麻 (Urtica dioica)同工凝集
素前体(AAD03614. 1)的同源性分别为 51%，51%，
51%，51%，56%，与茶树几丁质酶 (AET95643. 1)、
葡萄几丁质酶 ( CAC14015. 1 ) 的同源性分别为
49%，48%。
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林 业 科 学 51 卷
图 2 桑树 MLX56 基因家族核苷酸序列多重比对
Fig． 2 Multiple sequence alignment of nucleic acid sequence of MLX56 gene family in mulberry
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第 4 期 韩淑梅等: 桑树 MLX56 基因家族特性、克隆及表达分析
进化分析发现这些氨基酸序列可以聚为 2 个亚
群(图 3): Group I 和 Group II。其中 Group I 包括桑
树的 MLX56 蛋白、西洋接骨木类橡胶蛋白和异株荨
麻同工凝集素前体，其中异株荨麻同工凝集素前体
和 MLX56 蛋白是几丁质结合凝集素，西洋接骨木类
橡胶蛋白是含有几丁质结合域的类橡胶蛋白;
Group II 包括葡萄几丁质酶、茶树几丁质酶、二色补
血草几丁质酶、苦瓜几丁质酶、湖北海棠几丁质酶、
欧洲栗内切几丁质酶，它们都含有几丁质酶结构域;
桑树 MLX56 基因家族的 7 个基因与西洋接骨木类
橡胶蛋白和异株荨麻同工凝集素前体关系较近，而
与葡萄几丁质酶及茶树几丁质酶的关系最远。
图 3 桑树 MLX56 基因家族系统进化树
Fig． 3 The Neighbor-Joining tree of MLX56 gene family in mulberry
图 4 桑树 MLX56 基因家族结构域分析
Fig． 4 Domain analysis of MLX56 gene family in mulberry
2. 2 桑树 MLX56 基因家族成员鉴定
以 18 份桑树种质材料的幼叶 cDNA 为模板，采
用引物 F1，Ｒ1 对桑树材料进行 PCＲ 扩增，获得大小
约 1 100 bp 的 DNA 片段，将该片段克隆进 pMD19-T
载体，每份材料选取 10 个阳性克隆送至南京金斯瑞
公司测序。通过序列比对分析发现这些基因片段的
核苷酸序列高度相似，且多部分克隆为 MLX56-5 和
MLX56-6(图 4)。此外，还克隆到 1 个新的基因，命名
56
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为 MLX56-7。3 个基因具有一个典型的特征重复序
列，与预测的 MLX56 家族基因具有相同的特征。通
过 SWISS-MODEL 工具对 3 个类群的蛋白质三维结
构分析发现(图 5)，N 端重复序列与 MLX56 蛋白的
三维结构直接相关。MLX56-7 与 MLX56-6 的蛋白质
结构相似度较高，MLX56-6 的蛋白质三级结构比
MLX56-7 多了一段无规卷曲，MLX56-5 与前 2 个类群
的蛋白存在较大差异，此蛋白三级结构缺失了 1 个
α 螺旋，暗示该蛋白的功能可能与其他 2 类蛋白存在
较大差异。3 个 MLX56 基因的理化性质分析(表 2)
表明: MLX56 基因最长的有 410 个氨基酸，最短的有
370 个氨基酸，其等电点(pI)为 6. 03 ～ 6. 48，分子量
为 41. 54 ～ 44. 88 kDa。信号肽预测显示，MLX56 基因
信号肽含有 22 个氨基酸，且含有较强的分泌信号，表
明它是一种分泌蛋白。
图 6 18 份桑树材料 MLX56 基因的半定量 ＲT-PCＲ 分析
Fig． 6 Semi-quantitative PCＲ analysis of MLX56 gene in 18 mulberry materials
1: 白桑‘枝垂桑’M ． alba‘Zhichui’; 2: 白桑‘新一之濑’M． alba‘Shinicinose’; 3: 白桑‘红果 1 号’M ． alba‘Hongguo1’; 4: 白桑‘红果 2
号’M ． alba‘Hongguo2’; 5: 鲁桑‘湖桑 32 号’M ． multicaulis‘Husang32’; 6: 鲁桑‘小鸡冠’M． multicaulis‘Xiaojiguan’; 7: 华桑‘圆叶皮
桑’M ． cathayana‘Yuanyepisang’; 8: 广东桑‘大 10’M ． atropurpurea‘Da10’; 9: 广东桑‘伦教 40 号’M ． atropurpurea‘Lunjiao40’; 10: 广
东桑‘桂优 62 号’M ． atropurpurea‘Guiyou62’; 11: 鸡桑‘柬埔寨桑’M ． australis‘Jianpuzhai’; 12: 山桑‘西农 6071 桑’M ． bombycis
‘Xinong6071’; 13: ‘长果桑’M ． laevigata; 14: ‘印度桑’M ． indica; 15: 广东桑‘斯里兰卡 1 号桑’M ． atropurpurea‘Sililanka’; 16: 白桑
‘紫荆桑’M ． alba‘Zijingsang’; 17: ‘黑桑’M ． nigra; 18: 瑞德桑‘火桑 1 号’M ． mizuho‘Huosang1’．
图 5 桑树 MLX56 基因家族蛋白质三维结构
Fig． 5 3-D structure of MLX56 gene family in mulberry
表 2 桑树 MLX56 的基因信息
Tab． 2 Basic information of MLX56 in mulberry
基因
Genes
氨基酸
Amino acid
等电点
Isoelectronic
point( pI)
分子量
Molecular
mass / kDa
Type Ⅰ
Type Ⅱ
Type Ⅲ
372
392
415
5. 30
7. 44
6. 57
41. 33
43. 01
45. 09
2. 3 18 份桑树种质材料 MLX56 基因半定量 ＲT-
PCＲ 分析
为研究 MLX56 基因在桑树中的多态性，利用半
定量 ＲT-PCＲ 检测 7 个 MLX56 基因家族在 18 份桑树
种质材料中的表达情况(图 6)，结果表明 MLX56-1，
MLX56-2，MLX56-4，MLX56-5，MLX56-6，MLX56-7基
因在白桑品种‘枝垂桑’和‘新一之濑’、鲁桑品种
‘湖桑 32 号’和‘小鸡冠’中均有表达，MLX56-2 和
MLX56-4 基因在 18 份桑树材料中均有表达，而
MLX56-3 基因在 18 份桑树材料中没有检测到表达。
其中，MLX56-1 基因在白桑品种‘枝垂桑’中的表达
水平较高，而在白桑品种‘新一之濑’、鲁桑品种‘湖
桑 32 号’和‘小鸡冠’中的表达水平较低，在其他桑
树种质材料中未检测到表达; MLX56-2 基因在白桑
品种‘枝垂桑’、‘新一之濑’、‘红果 1 号’、‘红果 2
号’，鲁桑品种‘湖桑 32 号’和‘小鸡冠’中的表达
水平较高，在其他桑树种质中的表达较低; MLX56-4
基因在华桑品种‘圆叶皮桑’和 广东桑品种‘伦教
40 号’中的表达水平较低，在其他桑树种质材料中
的表达水平较高; MLX56-5 基因在长果桑和白桑品
种‘紫荆桑’中未检测到表达，在华桑品种‘圆叶皮
桑’和广东桑品种‘伦教 40 号’中表达水平较低，在
其余桑树种质材料中的表达水平较高; MLX56-6 基
因在华桑品种‘圆叶皮桑’和 广东桑品种‘伦教 40
号’未检测到表达，在其余桑树种质材料中的表达
水平较高; MLX56-7 基因在白桑品种‘紫荆桑’和黑
桑中未检测到表达，在白桑品种‘新一之濑’、鲁桑
品种‘小鸡冠’及广东桑品种‘桂优 62 号’和‘斯里
兰卡 1 号桑’中的表达水平较高，在其他桑树种质
中的表达水平较低。
66
第 4 期 韩淑梅等: 桑树 MLX56 基因家族特性、克隆及表达分析
2. 4 广东桑‘桂优 62 号’MLX56 基因半定量 ＲT-
PCＲ 分析
利用半定量 ＲT-PCＲ 检测 7 个 MLX56 基因家
族在广东桑‘桂优 62 号’各组织的表达情况 (图
7 )，结 果 表 明 MLX56-1，MLX56-2，MLX56-4，
MLX56-5，MLX56-6，MLX56-7 基因在‘桂优 62 号’
的叶柄和茎中均有表达，MLX56-3 基因在各个组
织中没有检测到表达。其中，MLX56-1 基因在叶
柄和茎中的表达水平较低，在幼叶、成熟叶、表皮
和 根 中 未 检 测 到 表 达; MLX56-2，MLX56-4，
MLX56-5，MLX56-6，MLX56-7基因在‘桂优 62 号’
各个组织中都有表达，MLX56-4 基因的表达水平
较高。
图 7 广东桑‘桂优 62 号’MLX56
基因的半定量 ＲT-PCＲ 分析
Fig． 7 Semi-quantitative PCＲ analysis of MLX56
gene in M． atropurpurea‘Guiyou 62’
1: 幼叶; 2: 成熟叶; 3: 叶柄; 4: 茎; 5: 表皮; 6: 根。
1: Young leaves; 2: Mature leaves; 3: Petioles; 4: Stems;
5:Epidermis; 6: Ｒoots．
2. 5 桑树 MLX56-6 基因的原核表达分析
利用 SacⅠ和 XhoⅠ对重组子 pET-28a-MLX56-6进行
双酶切鉴定，此外重组质粒的测序结果与克隆序列
完全一致，表明桑树 MLX56-6 基因原核表达载体
pET-28a-MLX56-6 构建成功。
将酶切鉴定和序列测定正确的重组质粒 pET-
28a-MLX56-6 转化到大肠杆菌 BL21 (DE3)感受态
细胞中，经 0. 5 mmol·L － 1 IPTG 诱导表达后，用 12%
SDS-PAGE 凝胶电泳分析。结果表明，重组质粒
pET-28a-MLX56-6 产生了 1 条约 56 kDa 的条带(图
8)。诱导表达蛋白从 pET28a( + )载体上的 T7 启动
子开始翻译至终止密码子时分子量约为 49 kDa，经
SDS-PAGE 电泳后，蛋白质分子量为56 kDa，蛋白质
分子量实际值与预测值存在差异的原因可能与蛋白
的结构有关，有些重组蛋白表达后，趋向于形成二聚
体，同时，在表达过程中也有一些宿主菌的蛋白会附
着在目的蛋白上，所以分子量与理论值相差 10%属
正常现象。诱导蛋白菌液经超声波破碎后，经 12%
SDS-PAGE 凝胶电泳可溶性检测(图 9A)表明，目的
蛋白主要以包涵体形式存在。对表达产物的 Western
Blot 印迹分析(图 9B)表明，经 0. 5 mmol·L － 1 IPTG 诱
导 6 h 产生的蛋白条带与抗体发生很强的交叉反
应，表明融合蛋白得到表达。
图 8 重组 MLX56-6 蛋白的原核表达
Fig． 8 Prokaryotic expression of recombinant MLX56-6 protein
1: pET-28a( + )空载; 2 － 7:诱导时间分别为 0，2，3，4，5，6
h 的表达产物。
1: pET-28a( + ) ; 2 － 7: Expression products of the induced pET-
28a-MLX56-6 bacterial strain at the different time of 0，2，3，4，
5，6 h．
2. 6 重组菌株 pET-28a-MLX56-6 生长速率的
测定
在重组菌株达到对数生长期(OD≈0. 6)时，在
重组质粒的 TB 培养基中加入 0. 5 mmol·L － 1 IPTG
诱导，以加入 IPTG 诱导的空载 pET-28a( + )及未加
IPTG 诱导的 pET-28a-MLX56-6 重组质粒为对照(图
10)，结果表明，诱导后的空载随诱导时间的增加，
菌液 OD 值也在增加，6 h 后的菌液 OD 值达到
4. 15; 重组菌株在未经 IPTG 诱导的情况下，诱导时
间增加，菌液 OD 值也在增加，但涨幅相较于空载较
低，6 h 后的菌液 OD 值达到 1. 85; 加入 IPTG 诱导
后的重组质粒，诱导时间增加，菌液 OD 值变化不
大，涨幅较于前两者最低，6 h 后的菌液 OD 值为
1. 06。综上述，MLX56-6 基因对大肠杆菌 BL21
(DE3)有抑制作用，主要表现在对菌的生长有抑制
作用。
3 结论与讨论
本研究利用生物信息学方法从桑树基因组数据
库中鉴定到 6 个 MLX56 基因，按进化关系可分为 2
个亚家族，表明 MLX56 基因可能来源于基因的重复
事件，而且该基因在扩增的过程中，其结构发生了分
化，这也暗示了 MLX56 基因家族的基因表达与功能
的多样化。
成熟的 MLX56 蛋白含有 3 个部分: 第 1 部分
76
林 业 科 学 51 卷
图 9 重组 MLX56-6 蛋白的可溶性分析及 Western Blot 检测
Fig． 9 Solubility and Western Blot analysis of recombinant MLX56-6 protein
A:可溶性分析 1: 上清; 2: 沉淀; 3: pET-28a( + )空载。B:Western 印迹杂交分析 1: 6 × His 标签 Western 印迹杂交。M: 蛋白分子质
量标准。
A: Solubility analysis 1: Supernatant after ultrasonication; 2: Precipitation; 3: pET-28a( + ) ． B: Western Blot analysis 1:6 × His Western
Blot． M: Protein molecular weight marker．
图 10 MLX56-6 蛋白菌液生长速率
Fig． 10 Growth rate of MLX56-6 protein bacterial suspension
包含 2 个橡胶素类似几丁质结合域，第 2 部分是由
丝氨酸脯氨酸串联重复元件组成的伸展区域，第 3
部分由 C 端几丁质类似结合域组成，这种结构使桑
树具有强大的防御作用。研究表明，几丁质酶通过
水解真菌细胞壁中几丁质，从而抑制真菌生长 (王
志英等，2010)。而含有几丁质结合域的植物蛋白
对昆虫是有毒的(Van Damme et al．，1998)，伸展蛋
白只在植物和一些藻类中表达，主要分布于细胞壁
(Shpak et al．，2001)和分泌液(Estévez et al．，2006)
中，在大多数植物蛋白中，伸展蛋白区域可能有防御
功能，但具体的生物学功能尚不清楚。
桑树与其他植物系统进化关系表明，Group I 中
的植物结构域中均含有 1 个几丁质结合域，Group II
中的植物几丁质酶为几丁质结合凝集素，它们含有
1 个或多个橡胶素结构域。橡胶素是从橡胶树
(Hevea brasiliensis)的乳液中分离的，由 43 个氨基酸
组成的小分子蛋白，属于具有 1 个几丁质结合位点
的单凝集素。目前在荨麻科( Urticaceae)、罂粟科
(Papaveraceae)、禾本科(Gramineae)等植物中发现
了几丁质结合凝集素的存在，它们具有高度的序列
同源性(舒晓燕等，2006)。植物几丁质酶根据序列
同源性可以分成Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ和Ⅵ类( Shinshi et
al．，1990; Collinge et al．，1993; Meins et al．，1994;
Melchers et al．，1994)。Ⅰ类的特征是含有几丁质结
合域(CBD)和催化区，中间由可变交联区连接; Ⅱ
类的主结构区与Ⅰ类的相似但缺乏 CBD; Ⅲ类与前
2 类几丁质酶均不同，也无 CBD; Ⅳ类与Ⅰ类有类
似的 CBD 和保守的主结构区，但在 CBD 有 1 处缺
失，在催化区有几处共约 22 个氨基酸的缺失，并且
C －端延伸区也不完整，其成熟蛋白只有 241 ～ 255
个氨基酸，Ⅰ类约有 300 个氨基酸，Ⅰ类和Ⅳ类的氨
基酸序列只有 41% ～ 49%相同; Melchers 等(1994)
从烟草(Nicotiana tabacum)中分离到一种新的几丁
质酶，它的氨基酸序列与几种细菌的几丁质外切酶
相似，与已报道的植物几丁质酶不同，建议设为Ⅴ
类，并将Ⅴ类定义为刺荨麻凝血素 UDA 前体，成熟
的 UDA 是由前体切去了催化区而留下 2 个 CBD;
Ⅵ类包括与 Melchers 等(1994)从烟草分离的烟草
内切几丁质酶(ChiV)同源性达 50%以上的几丁质
酶，但Ⅵ类与Ⅰ到Ⅴ类的氨基酸序列无相似性而与
来自细菌的环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、黏质
沙雷氏菌( Serratia marcescens)、链霉菌( Streptomyces
plicatus)等的外切酶的序列非常相似。研究表明，
许多植物凝集素对鳞翅目 ( Lepidoptera)、同翅目
86
第 4 期 韩淑梅等: 桑树 MLX56 基因家族特性、克隆及表达分析
(Homoptera ) 等 害 虫 及 尖 孢 镰 刀 菌 ( Fusarium
oxysporum)、绿色木霉(Trichoderma viride)等真菌和
某些细菌具有防治作用，同时具有对环境无污染、稳
定性好及对高等动物相对安全等优点，成为防治病
虫害的重要研究对象。
桑科植物中大约有 1 000 个种能产生乳汁，尽
管它们具有相似的特性，但是乳胶成分在同一族、属
的近缘种中仍然存在差异(Konno，2011)。不同桑
种之间 MLX56 基因的表达情况表明，桑树 MLX56
基因的表达具有种间差异性。这在无花果亚属
(Subgen． Ficus)植物中也有报道，该亚属植物乳胶
中的主要防御物质是半胱氨酸蛋白酶，在大多数无
花果亚属植物的乳胶中，可以检测到半胱氨酸蛋白
酶活性，而在少数无花果亚属植物的乳胶中却没有
检测到半胱氨酸蛋白酶活性(Konno，2011)。另外，
MLX56 基因在各桑种之间的表达水平存在较大差
异，说明该基因的表达没有种间的相关性。MLX56
基因在同一桑种的不同组织中的表达水平也存在差
异，说明 MLX56 基因家族各成员之间可能存在功能
的分化。
桑树乳汁含有多种化学物质及蛋白质，朱越雄
等(1998)用桑树乳汁对部分细菌进行抑制试验，发
现桑乳汁对变形杆菌(Proteusbacillus vulgaris)、链球
菌(Streptococcus)的抑制效果最佳，但尚无法看出有
明显的抑菌范围。本试验克隆了桑树 MLX56-6 基
因，并构建原核表达载体 pET28a-MLX56-6，在大肠
杆菌 BL21(DE3)中成功表达了带 6 × His 标签的目
的蛋白，表明 MLX56 蛋白能在原核细胞中得以表
达，这为进一步研究该基因的功能提供了依据。
乳胶成分在植物近缘种中的差异性，是由植物
与昆虫之间的进化关系及相互选择、适应所致。在
植物与昆虫进化过程中，形成了相互适应机制，植物
利用诱导防御物质抵抗昆虫的危害，昆虫则利用其
特有的激发子 (包括 Volicitin、裂解酶、葡萄糖氧化
酶、脂肪酸 － 氨基酸轭合物及豆象素)降低植物的
防御反应(李新岗等，2008)。桑树乳胶中具有抗消
化酶类，MLX56 蛋白属于植物几丁质酶凝集素，通
过抑制蓖麻蚕 ( Samia cynthia ricini )、甘蓝夜蛾
(Mamestra brassicae)等鳞翅类昆虫的消化酶而影响
它们的生理反应。家蚕是专食桑叶的一种特种经济
动物，由于长期的进化与相互间的选择、适应，使得
家蚕能对桑叶乳汁中的葡糖苷酶抑制剂产生耐受
力，而不使之中毒; 而蓖麻蚕、甘蓝夜蛾等鳞翅类昆
虫虽然也能取食桑叶，但桑叶乳汁中的防御蛋白对
它们的生长具有 很强的抑制作用，甚 至 致 死
(Hirayama et al．，2007 )。 Konno ( 2011 ) 报 道 的
MLX56 是桑树乳汁中的一种防御蛋白质，它对鳞翅
类昆虫毒性很强，而对专食桑叶的家蚕却不造成毒
性，因此家蚕可能在长期的驯化过程中，对该蛋白具
有很强的耐受性，具体机制还有待进一步的研究。
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