全 文 ：第 4 卷 第 6 欺
1 9 9 1 年1 2月
林 业 科 学研 究
FO R E ST R E S EA R CH
V o l
.
4
,
N o
。
6
D e e
。 ,
1 9 9 1
发根农杆菌Ri 质粒的研究和利用
王敬文 蒋 晶 陆秀华
(中国林业科学研究 院亚热带林业研究所 )
摘要 本文综述了作为遗传转化高等植物载体的发根农杆菌 R i 质粒 , 在其结构 、 功 能 及用
作基因导入方面的研究进展 , 并讨论了被转化植物的利用策略 。
关抽词 根 , 转化 , T 一 D N人
近10 余年来 , 已产生的遗传转化高等植物的一些技术 , 其中有些技术如电激 导 入 (el e -
ct ro P0 ra ti on )
、 脂质体融合、 微注射技术等都是基于动物细胞培养方面的工作 , 而另一些技
术是来自植物界独特的天然转化系统 , 其中包括已知能遗传转化高等植物的农杆菌 属 A gr o.
ba ct e1 l’u m 的二个种 , 即根癌农杆菌 A . 纽m ela ci 改 : 和发根农杆菌 A . 从fo ge 二 : 。 这两个种
都能将其致病质粒 T i或 R i所携带的 D N A (T 一D N A )插入到双子叶植物核基因组中。 T i质
粒诱发寄主植物产生冠瘦肿瘤 , R i质粒诱发产生毛状根 。 由于可以从毛状根培养物获 得 具
有完整 T e D N A 序列的有生育能力的再生植株工’] , 因此利用发根农杆菌 R i 质粒作为遗 传转
化高等植物的基因克隆载体的研究和利用日益受到重视 。 作为转化载体的根癌农杆菌及其 T i
质粒已有广泛的评述 , 我们只讨论发根农杆菌及其 R i质粒遗传转化方面的问题 。
虽然在30 年代就 已发现当植物茎部刺伤接种发根农杆菌时诱发产生不定根川 , 但只是近
些年来由于根痛农杆菌方面的工作才重新唤起对发根农杆菌的兴趣。发根农杆菌 R i质粒诱发
寄主产生毛状根 , A c ker m a n n( 1 97 )[ 3 ]首先从毛状根经愈伤组织途径获得完整植 株 , 并记
述了遗传表型的变化。 此后 , 许多学者相继测定并研究了毛状根培养物[’J 愈伤组 织 (W hi te
等 , 1 9 82) 和转化根再生植株(T e Pf er , 1 9 8 2 )中的 R I T 一D N A , 开始研究发根农杆菌 R i质
粒及其结构 , 研究 T 一D N A 在转化植物细胞中的表达。
本文一方面讨论 R i质粒的结构和功能 , 在几种植物转化组织 中 T 一D N A 的结 构 以 及
T 一D N A 基因的表达 , 另一方面还将讨论利用 R i质粒遗传转化植物方面的应用策略 。
1
。
1
发根农杆菌 R i质粒的结构和功能
发根农杆菌类型
发根农杆菌是革兰氏阴性的土壤杆菌 , 呈杆状 (。. 8 ~ 。. 7 卜m x 2 . 5 ~ 3 . 。件m ) , 有1~ 6根鞭
毛 , 属根瘤菌科(R hi 动b ia 此ae )农杆菌属(A gr ob ac teri 嫌 ) , 农杆菌包括 4 个种 : A . 扭二ef a -
cfe : s (根癌农杆菌 )、 A . , hiz o g e n 亡s (发根农杆菌 )、 A . : , 吞i(悬钩子 癌l肿 农杆 菌 )和 A 。 r ,
di ob ac to
, (放射形农杆菌 ) , 前三种都具毒性 , 能引起植物生病 , 共同点是使寄主细胞增殖形成
瘤或毛根等赘生物 。发根农杆菌各菌株及其 R i质粒是按其所诱导产生的冠瘦碱(O p ine )种类
本文于 1 , 9 1年 1 月2 6 日收到 ,
林 业 科 学 研 究 4 卷
来分类的[ 6一 ’] , 可分为 3 种类型 , 即农杆碱型 (A g r o p in e 一ty pe )) 、 甘露 碱型 (M an o p in e -
ty p e )和黄 瓜 碱型 (Cu c u m o p in e 一ty p e )。 目前研究和利用较多的主要是农杆碱型菌株 及 其
R i质粒。
1
.
2 R i 质位的结构和其与 Ti 质粒同派性
发根农杆菌 R i质粒和根癌农杆菌 T i质粒都能遗传转化寄主细胞 。 已对 T i质粒进行了
广泛的分析研究 , 它的几种功能也已定位 , R i质粒 的功能图基本上是根据它同 T i质粒的同
源性制出的 (图 l )。 与 T i质粒类似 , 三种类型的 R i质粒都含 有 vi r 区 、 T 一D N A 区 和 分
解冠澳碱的功能区 , 其所不同的是甘露碱型和黄瓜碱型 R i质粒中的 T 一D N A 区是连续的 ,
就是说只含一个 T 一区〔‘J , 而农杆碱型 R i质粒中有二个不连续的 T 一D N A 区 , 分别 为 T L二
图 1 月 . rh公之 。夕e o e : A ‘R i 质粒图 (八 . M . B ir o t e t
a 1
. ,
1 9 8 7 )
图中指示 出T L 一和T R 一 区及复制起动区 (。ri )的位皿 , 也标 出了与 T i
质拉 已知功能 同源区 : 毒性(vj r ), 生长素合成 (t m s) , 农 杆族合成
(a g s )
, 农杆碱降解(a g c )。 内环指的是缺失 T L 一区 (△T L )或块失
T R
一区 (△T R )的突变 体。
D N A 和 T R 一D N A 。
R i质粒毒性区(vi r) 参与T 一D N A
转移和把 T 一D N A 整合进植物细胞核
基因组中 , 它与胭脂碱型 、 章鱼碱型
T i质粒 的毒性区有 强 烈 的同 源 性
[‘一 ‘’1 。 H o o y k a s s等“ 9 5 4 ) [川 进行的
根癌农杆菌vi r 区缺失突变研究指出 ,
发根农杆菌 1 8 5 5 R i的 毒性功能能够
补偿无毒性的根癌农杆菌突变体。 在
o t te n 等 (1 9 5 5 ) [‘’1进行的共感 染 伽
蓝菜的实验中 , 发根农杆菌1 5 8 3 4对根
癌农杆菌 B 65 3的vi r F缺失突变体也
有补偿作用。
还有人测定了农杆碱型 R i质 粒
如 p R IA ; 的 T R 一区生长素合成基因
t m s i 和 tm s Z (参与呵{噪 一 3一乙酸合
成 ) 与 T i质粒 T 一区致瘤基因的同源
性 , 这种同源性不仅是在结构上 , 而
且 也表现在功能上【. , ’”l。 但 是 甘 露
‘,李
-护r心、,卜龟,-,.JI.叮口
碱型R i质粒p R i 8 1 9 6单独T 一区上的这些基因座与其 就 无任何同源性(L a h n er s 等 , 1 9 8 4 ) ,
杂交研究也没有观察到p R i 8 1 96 同 T i 质粒上的参与细胞分裂素合成的 t m r 基因座有任何同
源性 。 此外 , 杂交实验测定结果表明 , R i和T i质 粒上参与冠瘦碱合成和代谢的区段也有相
当的同源性。
1
.
3 R I T 一D N A 功能图
关于 R I T 一D N A 功能的分析研究 , 大多是以农杆碱型 R i质粒进行的 。 农杆碱型 R IT 一
D N A 有二个不连续的片段 , 即 T L 一D N A 和 T R 一D N A , T L 一D N A 上含有甘露碱型和黄瓜
碱型 R IT 一D N A 片断 , 与诱导毛根有关的四个位点 r ol A B CD 位于 T L一D N A 片 断 , 编 码
生长素和农杆碱合成酶的基因位于 T R 一D N A 片断上 。 至今仅有的序列资料是来自 sl ig h to n
等 (1 98 6) [‘’] 的研究 , 他们测定了菌株 A . 的 T L二D NA 顺序 , 在这个序列上鉴别出18 个 O R F ,
6 期 王敬文等 : 发根农杆菌R i质粒的研究和利用
T 卜D N A 右侧的 O R F g ~ 18 负责编码转化表型的遗传信息(如卷叶 )。 已有学者鉴别出 pR i
A
‘[ , ]和 p R i 1 5 5 5 (D e Pa o lis , 1 9 5 5 )农杆碱合成基因位 于 T R 一 区 的右侧 , p R IA ‘的农杆
碱代谢基因靠近合成基因而在 T R 一区之外 [’。1 。 另外 , 甘露碱 型 p R i 8 1 9 6 其 甘 露碱 合 成
功能也被定位 , 它是靠近单独 T 一区的右侧 (L a恤er s 等 , 1 9 8 4) , 农杆碱素C 合成基因也在
T 一区右侧 , 而农杆碱素的代谢基因则在 T 一区之外 , 并且是可以随 T 二D N A 转移 的 (B yr n e
等 , 1 9 8 3 )。
1
。
4 转化细胞中的 Ri 卜D N A
已有实验证明 , R I T 一D N A 插入了转化细胞的核基因组中, 许多学者对农杆碱 型 p R i
A
‘ 、
p R i 1 8 5 5 转化的植物组织中 T 一D N A 进行了广泛研究 , 其研究结果已汇总 成 图 I’‘l 。
p RI A 4和 p R i 1 8 5 5的 T- D N A 由二个分离的区段 (T卜和T R- )组成 , T L- D N A在大多数情
况下是相当恒定的 , 大约为19 ~ 20 K b , 而T R 一D N A变动较大 , 最短的T R- D N A 可少于10 K b ,
有时约为12 K b , 甚至还观测到更长的约为30 K b 的 T R 一D NA , 几乎达到了 T L一D N A 的右
侧 。
在转化根或植株中通常存在一个 以 上 的 T 一D N A 拷 贝 , 而 且’T卜D N A 的 或 T L二 和
T R 一D N A 的某些拷贝可以连结在一起 〔‘“, ‘“1 , 在减数分裂时 T 一D N A 按孟德尔法则传 递 给
子代〔‘, ‘7 1。 W illm it z e r 等(1 9 5 2 )至‘8 1首先报道 R I T 一D N A 在植物中转录 出 p o lyA + R N A ,
随后一些实验室就更详细地研究了几种植物中 R I T 一D N A 基因表达 。 三个研究小组 各自报
道了关于 T L一D N A 转录的研究结果 , T a y 1Or 等I’。1已建立了 p R IA ‘的 T L一D N A 转录图 ,
在诱发的光烟草 N 。 g lau ca 肿瘤系中 , 将这种肿瘤作为愈仿组织和根的混合物进行了体外培
养。 在发根农杆菌转化根再生植株中的其他转录图 , 在 D u r a n d ~T ar d if 等[“。1对 p R IA ‘皿
D N A 的研究中也建立起来 。 O o m s 等弹 1研究了 p R i 18 5 转化的马铃薯根 、 芽和 苗 中 T卜
D N A 的转录 。 而关于 p R i T R 一D N A 转录的仅有的结果是 T a ylor 等 I’7 1报道的 , 他们在菌
株 A ‘诱导的 N 。 g lau ca 肿瘤系中检测到 R i T R- D N A 的 6 种转录物 , 其中 2 种是 从 T R 月
D N A 的与 T i质粒上的 tm s 基因同源的区段转录的 , tm s 基因编码合成生长素 并部分地参
与 T i 的致瘤性。 在所检测过的 3 个肿瘤系的一个系中 , 唯有 p ol yA+ R N A 相应 于 tm sl 基
因 , 这暗示 tm 3 2 要么是转录水平很低 , 要么就是没发生转录 , 这也表明这条生长素合成途
径与转化表型无关 。 还有 1 种或 2 种其他的多聚腺普 R N A 从 T R- D N A 的 合成冠瘦碱的区
段转录出来 , 其余的转录物及其功能还不知道。
在转录研究中所观察到的鲜明特征之一是 R I T 一D N A 基因表达是高度变化的 。 D ur a n d ,
T a r di f等 [“。」观察到转化烟草中T L一D N A 基因表达的器官特异性 , Oo m s 等邝‘l观察到在转
化的马铃薯的根 、 芽和块茎中不同的表达行为 , 这同 T i T 二D N A 的基因截然相 、反 , 这些基
因的表达一般是不变的。 实际上 , 这三个研究组在所检测的组织中观察到 的 R I T 一D N A 转
录是1 . 25 ~ 1 . 4 K b 的转录 , 这一片断可能相当于 O R F 1 5 , ro 1 D 基因座 。 许多种类的植 物
产生二种表型的转化植株 , 即典型的转化表型 (T )和过份的转化表型 (T / ) , 这并不是由于可
观察到的 T 一D N A 结构的变化卿 ] 。 这 些学者仅在转化的烟草植株一个无性系 的 T / 个体 中
观察到相 当 于 0 R F 12 的 转 录 , 而 T h o m as (1 9 8 6 )在转化烟草的 其 他 系 中 把 T ‘表型同
OR F s 10 或 1 的转录物联系起来 , 同出现在 T 和 T 产两种植株的相当于 O R F 12 的转录联 系
起来 。 进一步研究 R i升D NA 基因表达应该澄清几个含糊的问题 , 如明显地异常转录 的 起
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因 , 以及 T三D N A 基因表达与 T 和 T , 表型的各个方面之间的关系 。 R I T 一D N A 基 因也可
是组织特异促进物的一种来源 , 这些研究可以帮助弄清这种调控是如何发生的。
2 利用发根农杆菌 R i质粒转化植物
2
.
1 发根农杆菌转化的位物种类
自从 D e C le e n e 和 D e L ey ( 19 8 1) 研究了发根农杆菌感染产生毛状根的寄主范围以来 ,
虽然认为它有很广泛的寄主范围 , 但在单子叶植物上.还没有接种感染成功的事例 , 发根农杆
菌的寄主范围可能只限于双子叶植物 。 据统计已有 17 个科属的1 12 种植物接种感染后诱 发 产
生毛状根 , 其中 n 种植物 由毛状根培养物分化成植株〔‘] 。 本作者实验室利用菌株9 4 0 2成功地
转化了丝石竹 并获得再生转化植株’〕, 随着研究工作的进展被转化的植物种类还会继续增加 。
Mug ul er
〔” ] 以发根农杆菌9 4 0 2接种各科属的植物试图建立毛状根培养系 , 有些 植物可
以很容易地建立起毛状根培养系 , 有些植物则很困难 。报春花科的琉璃繁缕 (A : 。ga l’ : ar ve -
: l’s )毛状根培养物在培养过程中伴随产生大量的转化植株 , 但在长 日照下不能开花 , 而非 转
化正常植株在长 日照下是开花的。 金鱼草 (A nt il 入i。。二 , aj us )再生植株虽然产生的少 , 但却
具有典型 的转化表型 , 叶 子卷曲 , 节间缩短 , 颜色更为暗绿 , 而且这些变化不影响开花 。 接
种感染毛食科和瞿粟科都没有成功 , 接种感染蔷薇科 、 胡桃科 、 胡颓子科和桑科的各属种的
植物往往可以致病。 接种感染木本植物相当困难 , 产生毛状根很慢 , 这可能是在接种伤口形
成过量的多酚类物质的缘故 。
2
.
2 用发根农杆菌导入外滚甚因
发根农杆菌 R i质粒基因载体系统的研究和利用 , 也与根癌农杆菌 T i 质粒基 因 载 体一
样 日趋成熟 , 它完全可能成为与 T i质粒载体系统媲美甚至更好的植物基因转移系统 。 R i系
统很适合在基因水平进行操作 , 现在利用 R i 系统导入外源基因的主要途径一是构建中间载
体 , 通过重组与 R i构成共整合体 , 二是构建由 p R i提供 vi r 或 T 一D N A 的二元载体 。
创造转化植株的整个程序 , 第一步是克隆所需目的基因和 R I T 一D N A 的一个片断 进入
一个中间载体 , 这个载体可以结合进发根农杆菌而在这个细菌中不能复制 , 通常是利用 p B R
32 2的衍生质粒 , 这种衍生质粒是可以随协助质粒 p R K 2 0 13迁移的。 最好是保留 p B R 32 2的
T et
“基因的完整性 , 此外还必须插入一个 K a n R . 基因以便选择中间载体与原 R i质 粒 的 共
组体(A m p “ 和 C a m “ 在发根农杆菌中几乎不表达) 。 第二步是将携带 YF G 的中间载休通过
共价结合导入发根农杆菌 , 然后在中间载体和 R i质粒之 间选择共组体。 在三种相应的 液体
培养基中培养三个亲本菌株过夜 , H B 川 (p R K Z o3 ) 培 养在 LB + 5 0 m g / L K a n 中 , H B 川
(中间载体)培养在 LB + 10 m g / L T et 或 50 m g / L K a n (取决于中间载体的抗性 标 志 )中 ,
发根农杆菌 A ‘培养在 M YA 十 1 0 m g Ri f + SOo m g / L SPc 中。 三个亲本菌株各取 等 份 分
别放入无抗菌素的 M YA 培养基中 , 为使共价结合在无抗菌素的固体 MY A 平板上 逐 步 吸
干(每菌株 10 。川)来混合三个菌株 , 作为对照每株各自置板并作仅二个亲本的假交配 。 28 ℃保
温过夜 , 第二天从平板上刮下菌丛 , 每丛悬浮于o . s m l无菌水中 , 各取 50 一 2 0 闪置板于固
体 MY A + 2 0 0 m g / L R if + 5 0 0 m g / L Sp e + 1 . 5 m g / L T e t(或 Z oo m g / L N e o , 如果 中 间
载体是 K a n R )的培养基上以便选择携带共组体质粒的发根农杆菌 。在28 ℃培养 5 天后将 出现
1) 利用发根农杆菌 R I T 一 D N A 遗传转化终石竹 , 林业科学 , 待发表 。
6 期 王敬文等 : 发根农杆菌R i质粒的研究和利用
菌落 , 表现相应的抗菌素抗性标志的菌落划线分离出来并保存在添加 了 相 应 的抗 菌 素 的
M YA 平板上(除非是中间载体携带 K anR 基因时 N eo 浓度应该减少到 10 0 m g / L) 。 这 是通
过 S o ut h er n 分析证实 Y FG 己真正插 入 T 一D N A 的一个很好的预报。 第三步将已获得了携
带共组体质粒的发根农杆菌菌株 , 有选择地接种 , 并诱导接种材料大量产生根 , 而没接种的
对照不产生根 , 一般贮藏器官表面消毒后的切片都是好材料 , 例如木本植物无菌苗的幼茎 、
芽或叶柄。 但不同器官组织的生理阶段 、 极性对接种感染有一定的影响 , 对不同类型的接种
材料预先要作敏感性测验。 接种组织在 28 ℃保温 , 直到出现毛状根后 , 再从接种组织上切下
毛根 , 培养在固体 M S 无激素培养基上 (培养基中还要加5 0 m g / L 节基青霉素以便 杀 死 带
来的细菌 ) , 再使转化根培养物再生植株 , 方法依赖于所研究的植物种类 , 有些种类如烟草、
田旋花等在无激素培养基上培养时就伴随着植株再生 (虽然细胞分裂素 1 ~ 2 m g / L 可 以 刺
激再生)。 马铃薯和油菜等邝’l则需要依次通过二种培养基才能获得再生植株。 另外一些种类
如胡萝 卜、 大头菜等 (T e p fer , 1 98 4) 通过诱导体细胞胚再生 , 而丝石竹、 辣根等则 通 过 愈
伤组织途径再生 。同一个根培养物往往再生二种表型不同的再生植株 , 具有典型转化表 型 的
植株 (T 植株)有中度的卷叶 , 比正常植株略为矮化 , 而过份转化表型植 株 (T 了植株 )卷叶严
重 、 发育不 良。 也有某些种类如油菜(品种 o lei fer a) 、 颠茄其所有再生植株全是 T 产表型 。
T
产表型性状不良是不受欢迎的 , 但可对 T / 植株上产生的侧枝在枝条成熟时去顶 , 往往可转
变为 T 表型 , 由这侧枝所产生的种子发芽的苗基本上都是T 表型的。 另外 , 在 T / 植 株的转
化子代中也总有一些T 表型的植株 。
C o m a i 等 [ 2“]用PR IA ‘将嵌合基因导入烟草植株 , 来自S a lm o n e lla 云夕p无im u : iu m 一个突变
体的 a ro A 基因在这细菌中编码抗除草剂草甘磷的一种酶 , 包含 ar o A 基 因序列的构件 ,
通过重组引入 p R IA ‘的T L 区 , 所产生的发根农杆菌菌株接种在烟草上产生了转化根 , 由转
化根获得再生植株 , 这些转化植株有毛状根表型 , 并增加了对草甘麟的抗性。
对某一种属的植物能够成功地转化和再生的条件 , 并不一定适用于其他种属的植物 , 特
别是具野生习性的木本植物如杨属 , Pyt h oud 等 I“‘1(1 9 8 7) 曾试 图用通常的方法利用发根农
杆菌二元载体系统 (含有 p G A 47 2的 LB A 4 o 4) 转化杂种杨 H ll , 由于野生型发根农杆菌对杂
种杨的毒性很低 , 感染和转化都没成功 , 后来利用共组 质 粒叮V K 2 91 (K a m a ri et al . ,
1 9 8 6 )成功地使杂种杨H n 发生遗传转化 。 共组质粒 p T V K 29 1含有能授与超级毒性表型的根
癌农杆菌质粒 p T IB o 5 4 2 v ir 区部分 (H o o d e t a l。 , 1 9 5 4 ) , 通过三亲本交配迁移进入发根
农杆菌R 1 0 0 0和R 15O。菌株 , 获得毒性大为增强的发根农杆菌R1 6 0 和R 16 0 1菌株 , 用这二菌
株分别感染杂交杨H n 的幼茎 , 二周后开始出现根 , 一个月内60 % ~ 70 %的茎切段形成毛根 ,
So ut h er n 分析证明杨树细胞发生了稳定的转化 。
对于许多基因转移实验来说 , 改变了的转化表型没有什么特别的不利之处 , 而且毛状根
表型实际上是一种有用的测定子代转化个体的直观可见的标志 : 然而在一些种类中转化表型
从生产实践角度来看是不利的 , 例如转化的胡萝 卜和芭美菜植株产生纤维状根 , 而不是大的
直根。 几家实验室研究出二种策略以便保留发根农杆菌转化系统的有利之处 , 从而削弱或整
个地避免转化表型的不受欢迎的方面。 法国 D . T e p fe r 实验 室已改良了发根农杆菌毒性菌
株 , 这些菌株的 R i质粒要么仅具有T L一区 , 要么仅有 T R 一区 , 这些菌株诱导形成转化根的
能力仍然是稳定的 , 由于转化表型显然与T L 一D N A 的存在有关 , 那么由 T R 一D N A单独转化
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的植株就可能有正常的表型 。 A . Pet it 等所采用的第二个策略 是用一个野生型菌株和一个
携有被剪裁的供体的菌株共感染寄主植物 , 所产生的转化根往往携有来自二菌株质 粒 的 T -
D N A
, 随后筛选复合转化体 , 最后通过杂交使得基因分离 , 就可获得仅具剪裁过的T 二D N A
的子代了 。
发根农杆菌 p R i 系统很适合于在基因水平进行操 作 , 外源基因有的是插 入 R i质 粒 的
T 一D N A [zs l , 有的是用衍生自根癌农杆菌去除了致瘤力的载体 (例如 p B IN i g) 进行二元共转
化〔’“J。 在后一种情况下 , 从两种质粒来的T 一D N A插入到植物基因组中 , 由R i质粒 vi r 区的
D N A 启动转化 , 例如 , 插入细菌的新霉素磷酸转移酶 , 就可以产生抗卡那霉素的根。 S im -
Ps on 等 [“。1和其同事们描述了利用p R I T 一D N A 诱导根的二元载体系统 , 用含有野生型 p R i
A
‘和一个与 T I T 一D N A 边界联结的胭脂碱合成酶基因的载体的发根农杆菌菌株 , 接种在首
着和蕃茄上 , 被感染诱导的毛状根合成了胭脂碱 , 暗示发生了双重转化事件 , 在这事件中异
常的表型 , 能够在世代中分离 , 而产生含有有利的和 (或)不利的基因的转化植株 。
z
。
3 促进植物生长
早在6 0多年前 R ik e r (1 9 3 0 )和 H ild e b r a 立d (1 9 3 4 )就曾记述了发根农杆菌通过伤口侵染
植物根部 , 并导致长出次生根形成 “毛根病” , 但它从来就没 被 看 作为一种重要的病原菌。
M co re 等 (1 9 7 9) 也指出苹果树具有毛状根能比无毛根树更耐干早 。 近 年 来 利用发根农杆菌
R I T 一D N A 转化植物促进生根 , 增加生物量的研究日益引起人们的兴 趣 , 并先后有人申请
了技术专利(St r o b e l, 1 9 5 4 ;松井千秋等 , 1 9 5 4 ) 。
近年来 , 美、 日、 以色列学者先后利用发根农杆菌 R I T 一D N A 转化根促进扁桃、苹果 、
油橄榄 、 柑桔 、 大豆 、 棉花、 蕃茄 、 葡萄、 菊花、 郁金香 、 黄瓜 、 甘薯等作物生长和提高产
量的研究 , 显示了在农业 、 林业和园艺上的应用价值 , 尤其在木本植物移栽方面 的应用进行
了 比较细致的研究 。 Str o bel 等(1 98 5) 从发根农杆菌菌株 T R 1 05 筛选出超级发根农杆菌菌株
2 3 2
, 该菌株比一般菌株有更强的诱导发根能力 , 而在 R i质粒 内切图上与T R 1 05 没有什么明
显差别 。 高50 c m 、 主茎直径 1 . 0 c m 和冠幅直径Z o c m 的扁桃幼树 , 被剪去大根约 Z c m 以暴
露根系的新鲜组织 , 浸于菌株 2 32 悬浮液中(菌数 1沪个/ m l) , 暗 中保温 (20 ~ 23 ℃ )2 4 h ,
然后取出栽植于容器中或 田间 , 90 天后检测菌株2 32 对根的生物学效应。 实验结 果 表明 , 只
有携带 R i质拉 的活细菌才能促进扁桃生根 , 细菌细胞提取物或杀死的细菌都不能促进生根 ,
这表明菌株2 32 所产生的任何外源激素都对促进生根无效。 接种菌株 23 2促进新生根数比对照
多。. 8 ~ 1 . 0倍 , 根干物重多0 . 5~ 0 . 8 倍, 叶数多。. 8~ 1 . 0倍 , 干直径增粗0 . 3倍 , 枝长增加约
0
.
5倍 , 生长1 50 天的植株枝长增加0 . 9 ~ 1 。 0倍 。 这些增长效应主要是 分 布在次生根上的大量
毛根吸收供水的结果 , 顶部生长更快更旺也是个重要原因 。 然而 , 虽然根组织发生了遗传转
化 , 但也不能排除植物激素质和量的变化对根的效应 。 Ja yn es 等 (1 981 ) 用 大豆做的实验 已
证明 , 大豆苗的异常生长不是由于接种了发根农杆菌而发生的遗传转化 , 而是由于发根农杆
菌所产生的植物激素所致。 在生长季末期从移栽树根际土壤取样 , 用菌株 2 32 处理的根际土
壤50 %一70 %的样品都能分离到这种杆菌 , 而对照植株根际土壤中无一存在 这种杆菌 。 由于
从对照株根际土壤中分离到的杆菌都无诱导发根能力 , 因而可以肯定处理株土壤中分离到的
杆菌 , 就是原先接种的菌株2 32 , 它们在整个生长季节存活下来了 。
用发根农杆菌接种苹果 、 葡萄 、 油橄榄 、 柑桔等幼树根系的试验也都获得了类似上述的
6 期 王敬文等 : 发根农杆菌R i质粒的研究和利用 6于亏
效果 。 接种发根农杆菌对促进生长的短期试验效果是明显的 , 但对林木发育 、 产量和转化植
株与其他生物(线虫、 病原真菌和细菌 )关系的影响的长期效应还需要进一步研究 。 总之 , 发
根农杆菌在农业 、 林业 、 园艺上应用前景还是乐观 的。
2
.
4 培养内生菌根菌
菌根是根与真菌相互作用的一种特殊形式 , 自然界绝大多数植物种类尤其林木植物都有
菌根 , 而且主要是内生菌根 (V A M ) 。 然而 , V A 真菌不能够体外培养 , 这是研究和实践应
用上的主要难题 。虽然已经能使琼脂培养基上培养的完整的无菌苗发生典型的V A M感染 12 ’] ;
用改良的W hi te 培养基培养使三叶草形成 V A M [ “s1 , 但是 , 由于把培养基已调整到真菌耐受
的临界限 , 而使得培养根再难以生长。 为此 , 这些技术甚至无法提供适于生理研究的足够数
量的根或菌丝体 , 更不可能生产批量的接种菌剂 。 毛状根生长潜力很大 , 利用转化的毛状根
建立起来的 V A 真菌感染系统 , 不仅能为进行内生菌根生理研究提供理想的模式系统 , 而且
也使大批量提供内生菌根接种剂具有现实的可能 。
利用转化根感染V A M菌进行生理研究的模式系统已建立起来〔“山 “。] 。 一个大的培养皿内
套一个小培养皿 , 或一个培养皿一隔为二 , 组成一个双隔室培养系统 , 隔室 A 含有足够支持
根生长的营养物质 , 隔室 B 含水琼脂 , 把母根培养物放入A 室 , 根尖伸向 B 室 , 暗培养几天
后 , 根向 B 室伸长并形成次生分枝 。 将预先萌发的菌抱子贴近放在分枝根延长区 , 25 ℃暗培
养 , 在合适的培养条件下 , 就可建立起 V A 菌感染转化根的培养系统 。 内生菌根形成的早期
事件和相应的生理状况 , 就是在这种双室系统的研究中获知的。 利用转化根双室培养技术有
很多方便 , 根作为很容易的通路使直接导入同位素标记物 , 没有植物代谢过程、 运转速率、
光和其他环境因子的千扰 , 根和真菌可在被干燥后 , 不破坏它们的空间关系 , 水溶性物质的
移动、 移动速率 、 同位素标记物的分布都可随之十分确切地得知 , 这些生理生化过程都可能
与感染阶段有密切关系 。 R i T- D N A 转化根能够耐受培养基成份的变化 , V A 菌 Cz’g as p o1 a
二al ga 行ta 抱子萌发也很少依赖培养基成份 。
利用转化根不仅研究了侵染和形成内生菌根的生理 、 生态问题 , 还研究了 G . 二al ga rit a
体外抱子形成。 在以往的研究中(M il ler 一W id e m a n 等 , 1 9 8 4) 平均每板只产生 3 一 5 个抱子 ,
而且多是发育不全的抱子 , 而在双室培养中抱子的形成依赖于所用的培养基成份 , 经研究和
改进每板可获 10 。个以上发育完全的抱子 , 使菌丝发育最好的培 养基产生的抱子数也最多 。
利用双室培养系统研究抱子的生物发生 , 就有可能生产大量的发育健全的抱子 , 从而大规模
生产 V A 菌接种剂。
2
.
5 生产次生代谢产物
植物至今仍然是药物和其他精细化学药品的重要来源 。 很久以来 , 人们就认识到利用培
养植物细胞生产这些称为“次生”的代谢产物 , 比从植物组织中直接抽提更合算 。 但是商品化
生产进展缓慢 , 至今只有利用紫草左 th。; p el 二u m el 刀thlo 瘫f二 n悬俘细胞培养物生产紫草宁实
现了商品生产(T a bat a 等 , 19 8 5 ) , 而其生产潜力达不到文献中记述 的 那种程度。 一个严重
的障碍是目的化合物的生产速率一般不高。 虽然这个缺点可用筛选高产细胞克隆加以克服 ,
但要从未器官化的培养物中筛选高产细胞系是很不容易的 , 为了保持提高了的生产率 , 需要
反复筛选 , 否则培养物就会恢复到原来较低的生产能力。 这种遗传的不稳定性是与基因组水
平的变化和基因表达方式的变异相联系的。
林 业 科 学 研 ; 4 卷
自从发现发根农杆菌遗传转化高等植物 , 获得了生长迅速 、 生产效能高而稳定的器官化
的毛状根培养物以来 , 利用植物离体培养物生产精细化学 品的研究 和 应 用有了很大的进展
(F lo r e s
,
H a m ill等 , 1 95 6 ; K a m a ta 等 , 1 9 5 6 , M a n o 等 , 1 9 5 6 ) 。 毛 状 根 培养物第一个
主要特点是生产次生产物的效能高 。 毛状根由于其快速生长和增加分枝其生长速 度 是 惊 人
的 , 而且不会降低每单位生物量次生物质的产量 (F1 0r es 等 , 19 87 ) 。 与正常根不同 , 毛状根
可以发酵培养 , 在 1 ~ 15 L 的发酵器中几周内生产以千克计的鲜物重 。 由于毛状根培养物能
有效地制约培养基 , 起始接种量可以很少 , 50 m l的预培养物可接种 15 L 发酵器。 非器官 化
的培养物如悬浮细胞和愈伤组织 , 它们合成次生产物常常与团聚作用或再分化作用相关联 ,
因此 , 除少数物种外 , 几乎所有物种的生产和维持都很困难 。 毛状根的合成能力水平似乎能
准确地反映出它的亲本植株根的合成能力(N o r to n 等 , 1 9 5 6 , H a sh im o to 等 , 1 95 6 ) , 这可
能是毛状根中不存在长距离的输送作用的缘故 。 毛状根培养物具有一系列形态学和生理学状
态不同的细胞 , 每个根尖上有少量分生组织细胞 , 每条根都有细胞延长区和成熟组织区 , 该
区在继代培养开始不久立即发育 。 在所研究过的许多物种中 , 次生产物的积累大体上与生长
同步 , 即每单位重的产物含量基本上恒定不变 (H a m il l等 , 19 8 6 ) , 但 曼陀罗有所不同 , 毛
状根培养物停止生长后 , 天仙子胺仍继续合成 (Pay n e 等 , 1 987 ) , 其浓度至少增加 1 倍 。 这
种与生长无关的品系其商品意义更大。
毛状根培养物第二个主要特点是生产力十分稳定 , 染色体数与亲本的相等也 十 分 稳 定
(A ir d 等 , 1 98 了)。 毛状根培养物的稳定性不论在生长速度上 , 还是在产生的生物碱的量和类
型上也都能反映出来 , 例如天仙子毛状根培养物保持了一年以上稳定不变 。 相反地 , 非器官
培养物 (悬浮细胞或愈伤组织 )的生长则严重受到遗传和染色体异常的影响 , 并形成大量的多
倍体和非整倍体 。
利用转化的毛状根培养物生产植物次生物质 , 是对利用培养细胞进行生产的一次革命 ,
为有商业价值的生产系统提供了许多新的机会 。 现在 已建立了几十种毛状根培养 系 统 [“ ‘〕,
并研制了适用的根培养生物反应器 , 使每升的生物量以干重 计达到30 9 以上 。 然而 , 距实现
商业化生产还有一段距离 , 还需要研究解决一系列技术问题 , 例如必须能在高密度填充床条
件下使根保持活力 , 产物必须全部或大部从根中释放出来 , 必须做到使根的生长与生产产物
分开 , 以及根合成和释放次生代谢产物的动力学等 。
参 考 文 献
仁l 〕 T e p fe r , D . , 1 9 5。, R I T 一 D N \ fr o m 了吏夕r o ba e te r i“m r 八‘之 。夕e n e s : 八 s o u r e e o f g e n e s h a v in g a p p l-
ie a t io n s in r h iz o s p h er e b io lo g y a n d Pla n t d e v e lo Pm e n t
, ec o lo g y
, a 一ld e v o lu tio n . In Pla n t -
m ie r o b e in te r a e tio n s
,
m o le e u la r a n d g e n et ie p e r sP ee t iv e s
,
V o l
.
3
,
K o s u g e
,
A
.
a n d N e ste r
,
l二.
W
.
e d
.
p p
.
29 4一 3 4 2 , M e G r a w 一H ill P u blish in g C o m p a n y , N e w y o rk e t a l .
〔2 ] R ik er , 八 . e t a l . , 1 9 3。, St u d ie s o n in fe e tio n s h a ir y r o o t o f n u r s e r y a p Ple tr ee s , J . A g o . 刀e s . ,
4 1
:
8 8 7 ~ 9 1 2
.
〔3 ] A e k e r m a n n , C . , 1 97 7 , Pfla n z e n a u s 月 g r o b a e re r f“爪 r 人f之 o g e 。 。5 t u m o re n a n 卜ic o tia n a t a b a e u m ,
P la n t S e f
.
L e e t
. ,
8
: 2 3一 3 0 .
〔屯〕 C h ilto n , M . D . e t a l . , 2 9 5 2 , A g r o ba c te : ‘。成 : h i: o g e o e s in s e rt s T 一 D N \ in to t h e g o n o m e o f t he
h o s t Pla n t r o o t e ells
,
N a t“r e , 5 1 7 : 4 3 2一 4 3 4 .
〔5 〕 张毅等 , 1 9 8 9 , 植物基因工程的新载体—农杆菌 R i 质粒 , 生物工程学报 , 5 (3 ): 1 7 3 ~ 1 7 8 。
6 期 王敬文等 : 发根农杆菌R i质粒的研究和利用
〔6 〕 Pe tit , A . e t a l. , 1 0 83 , Fu r th e r ex t en sio n o f t he o Pin e e o n e e Pt : P la s m id in 姓夕r o ba c te r f“爪 r h f-
之 o g e” e s e o o per a te fo r o p in e d e g r a d a t io n , 万 o l. G 仑” . G e n e f . , 1 9 0 : 2 0连~ 21 透.
〔7 ] Pe t it , A . e t a l . , 1 0 5 5 , T h e fu n e t io n o f T 一D N A in n a t u r e . In m o lec u la r fo r m a n d fu n e tio n o f
t h e p la n t g e n o m e
,
L
.
v a n V lo t e n
一
D o t in g
,
G
.
S
.
P一G r o o t a n d T . C . H a ll, e d . , Ple n u m
Pu b lish in g CO
r p o rat i
o n , N e w Y o r k
, ‘2 5 ~ 6 3 6
[ s 〕 R is u elo , G . e t a l . , 1 9 5 2 , R e g io n s o f h o m o lo g y b et w e e n t u m o rig e n ie p la s m id s fr o m 月夕r o b a c t-
。r i。二 rhiz o 夕e n e : a n d 月夕r o ba c r e ri 。二 t“二e fa e ie o s , P la s杭 id 了: ‘s~ 5 1 .
〔, 3 H u ffm a n , G . et a l . , 1 9 3连. , H a ir y r o o t in d u e in g p la s m id : p h y s ie a l m a P a n d h o m o lo g y t o
t u rn o r
一
in d u e in g Pla sm id s
,
J
.
B a e te rio l
. ,
1 5 7
:
2 6 9 ~ 2 7 6
.
〔1 0〕 J o u a n in , L . , 1 9 8 4 , R e s tr ie t io n m a P o f a n a g r o P in e 一t y p e R i Pla s m id a n d it s h o m o lo g ie s w it h
T i p la sm id s
,
Pla s m fd
,
1 2
:
9 1 ~ 1 0 2
.
〔11〕 H o o yk a s s , P . J . J . et a l . , 1 9 8 4 , A e o m P a r is o n o f v ir u le n e e d et e r m in a n t s in a n o e to p in e T i
p la s m id
, a n o Pa lin e T i P la s m id
, a n d a n R i p la sm id by eo m p le m e n ta t io n a n a ly s is o f A 夕r o 6a c -
te r i。二 才。川e fa e i。” : rn u t a n t s , P la s二玄d , 1 1 : 1 9 5 ~ 2 05 .
〔i幻 O tt en , L . et a l . , 1 95 5 , Id e n t ifie a tio n o f a n A 夕r o ba e re r i。爪 t u用 e fa e‘e n : p T IBs5 3 v ir r eg io n
fr a g m e n t t h a t en h a n ee s th e v ir u len e e o f p T IC 5 s
, 五了0 1 . ‘e n . G 召 n e t . , 1 9 9 : 2 8 9一1 0 3 .
仁1 3〕 S lig h to m , J . L . et a l . , i , 5 6 , N u e leo tid e s e q u e n e e a n a ly s is o f T L一D N A o f 月夕r o 石a c te ri 。优 r h‘之 -
o 夕e ” e s a g r o p in e t y p e p la s m id : id e n t ifiea t io n o f o Pen 一 r e a d in g fr a m 亡s , 了. B io l. C 人e 爪 . , 26 1 :
1 0 8 ~ 1 21
。
仁1 4〕 Bir o t , A . M . et a l . , 1 , 8 7 , St u d ie s a n d u s es o f th e R i p la sm ld s o f 姓g r o 乙a e t忍r ‘“优 : h fz o 夕e , : e s ,
P la 八 t P h!/ s l’o I . B fo e几e川 . , 2 5 : 3 2 3一 3 35 .
〔1 5〕 o o m s , G . e t a l . , 1 9 5 5 , G e n e tie m o d ifie a tio n o f p o ta t o d e v e lo Pm e n t u s in g R I T 一D N A , T 人e o r
A 夕夕! . G e ” e * . , 7 0 : 4魂。~ 4屯6 .
E1 6〕 Jo u a n in , L . et a l . , 1 9 5 7 , Str u et u r e o f T 一 D N A in Pla n t s r e g e n er a t e d fr o m r o o ts t r a n s fo r m e d
b y 月夕r o ba e te r iu 协 r 人i之。夕e n e s s t r a in A ; , M o l. G e , . G 。 。e * . , 2 0 6 : 3 5 7 ~ 50 2 .
仁1 7」 T a y lo r , B . H . e t a l . , l o 85 a , T 一D N A a n a ly s is o f Pla n ts re g en e r吐e d fr o m h a ir y r o o t tu m o r s ,
M o l
.
G e ”
. ‘e n e t . , 2 0 1 : 5 5 4 ~ 5 5 7 .
〔1 . ] W illm it么er , L
.
e t a l
.
,
1 9 9 2
,
D N A fr o m A 夕r o ba e te rf。邢 rhfz o 夕e n e ￡ 15 tr a n s fe r r ed to a n d e x p r -
e ss e d in a x e n ie h a ir y r o o t Pla n t tiss u es
, 万 0 1 . G e n . G e n e t . , 1 8 6 : 1 6 ~ 2 2 .
[ i , 〕 T a y lo r , B . H . et a l . , i , ssb , T r a n se r ip t io n o f A 夕r o ba e te r 公“沉 rhf z og e n e s A 一 T 一D N A , M o l .
G e ”
.
G e 称e t
.
, 2 0 1
:
5 ‘6 ~ 5 5 3
.
〔2 。〕 D u r a n d 一T a r d if, M . et a l . , 1 9 5 5 , S tr u etu r e a n d e x p r es s io n o f R I T 一D N A fr o m A 夕r o 乙a c re r i“切
rh f之o g e ”e s in N fe o t ia ”a ta ba e u用 : o r g a n a n d p h en o ty p ie sP ee ifie ity , J . M o l
.
B io l
. ,
1 56
: 5 5 7 ~
5 6 4
.
〔2 1〕 o o m s , G . e t a l . , 1 0 5 6 , D e v e lo Pm e n t a l r eg u la t io n o f R i T L 一D N A g e n e e x P r e ss io n in r o o ts ,
s h o o ts a n d tu b e r s o f t r a n sfo r rn e d p o t a to
,
P la 月t M
o l
.
B io l
. ,
6
:
3 2 1~ 33 0
.
[ 2幻 M u g n ier , J . , 1 0 5 5 , E st a b lish m e n t o f n e w h a ir y r o o t lin e s b y in o e u la t io n w ith A g r o b a c re r iu 爪
r入i之o g e ”e : , P la n t C e ZI R e P . , 7 : 。一 1 2 .
〔2 3〕 C o m a i, L . et a l . , 1 9 8 5 , E x Pr e s sio n in Pla n t o f a m u ta n t a ro A g e n e fr o m S a l爪 。刀e lla 才h彗夕hf-
优赵r ‘u 爪 e o n for s to le r a n e e t o g lyPho sPy a te , N a t“r e , 3 1 7 : 7 41 ~ 7 4 4 .
[ 2 4〕P y th o u d , F . et a l . , 19 5 7 , In e r ea se d v ir u len e e o f A g r o ba e te : fu 从 r人i之o g e 月e s e o n fer re d by t he
v ir r eg io n o f PT IB o s‘2 : a pPlie a t io n t o g e n e tie e n g in ee rin g o f p o Pla r , B i o 了口e无刀 0 10 9 梦, 5 : 1 32 3一
1 3 27
.
〔2 5〕 H a m ill, J . e t a l . , i , s7 b , A s se s s m e n t o f th e e ffie ie n e y o f eo tr a n s fo r m a t io n o f th e T 一D N A o f
d is a r m ed v e e to r s d er iv e d fr o m A 夕r o 乙a e te o iu 。 才。二e fa e fe n s a n d t he T 一 D N \ o f 刀 . : 几f: o g e 。。 : ,
林 业 科 学 研 究 4 卷
P la ”t M o l
.
B ‘0 1. , 9 : 5 7 3~ 5 8‘.
二2 6〕 Sim p so n , R , B e t a l . , i, 5 6 , A d isa r m ed b in a r y v ee to r fr o m A g r o 乙a e te r ‘“二 tu 二e ja e f。 。s
fu n et io n s in A ‘r o so c te r‘u 阴 r h‘之。夕e 月 e : , fr eq u e n t e o 一 tr a n s fo r m a t io n o f tw o d ist in e t T 一 D N A s ,
P lo n l M
o l
.
B i o l
. ,
6 : 4 0 3 ~ d zs
.
〔2 7 1 A llen , M . F . et a l . , 1 9 7 , , G r o w t h o f V A m y c o r r h iz a l a n d n o n · m y e o r r h iz a l B o “t e lo “a 夕,刀 e‘11￡
in a d e fin e d m e d iu m
,
M 夕e o lo g l. a , 7 2 : 6 6 6 ~ 6 6 9 .
〔2 5 ] Mo s se , B . et a l. , 1 0 7 5 , V e s ic u la r 一 a r b u sc u la r m y e o r r h iz a l in fe c t io n s in r o o t o r g a n e u lt u re s ,
P 石U ‘l’o l . P I。”t P o r人0 1. , 5 : 2 1 5 ~ 2 2 3 .
〔2 9〕M u g n ie r , J . et a l . , 1 9 8 7 , V A m y c o r r h iz a l in fe e tio n in tr a n sfo rm e d r o o t 一in d u e in g T 一D N A r o o t s
g r o w n a x en iC a lly
,
Ph习to 夕a tho lo g y , 7 7 : 1 0 4 5一 1 0 50 .
〔5 0〕 B ee a r d , G . e t a l. , lo as , E a r ly e v e n t s o f V A m y c o r rh iz a fo r m a t io n o n R I T 一 D N A tr a n sfo r m e d
r o o ts
,
N e切 P hg t o l. , 1 0 5 : 2 1 1一 2 1 5 .
〔3 1〕 H a m ill , J . e t a l . , lo 8 7 a , N ew r o u t es to p la n t se e o n d a r y Pr o d u e ts , B ‘o *e e h月 o lo g y , 5 : 50。~ s。‘.
S tu d 夕 a n d U s o o f the R i P la s m id s o f 且g r o ba e te r iu n :
r hiz o g e n e s
W a n g Jin g w e n Jia n g Jin g L u X iu h u a
(T 方e R e : e o r c 儿 I o s riru te o j S o b , r o 尸ic a l F o r e s tr , C月F )
A b str a et R i Pla sm id o f A g ; o乙a c te ; iu 爪 rhiz o g e n e s 15 a n a t u r a l v e e t o r fo r
g e n e t ie a lly t r a n sfo r m in g h ig h e r p la n t
.
T h e r e s u lts o f s t r u e tu r a l a n d fu n e
-
t io n a l a n a lys e s o f the T 一D N A f ro m p R i w h ic h 15 t ra n sfe r r e d a n d in t e g r a te d
in to the g e n o m e o f t ra n sfo r m e d e e lls in d iffe r e n t P la n t sPe e ie s a r e d is e u s se d
fo r th e fir s t t im e
.
F in a lly
, t h e Po s sib le s t r a te g ie s fo r u s in g th e R i P la sm id
to o b ta in t ra n昭e n ie Pla n t s a r e d is e u s s e d .
K ev w o r d s R o o t s : t r a n s fo r m a t io n : T 一D N A