全 文 ：　　1996—06—15收稿。
范国强教授,蒋建平(河南农业大学泡桐研究所　郑州　450002)。
* 1996～1998年河南省杰出青年基金资助项目。
泡桐丛枝病发生与叶片蛋白质和
氨基酸变化关系的研究*
范国强　蒋建平
　　摘要　本文分别对楸叶泡桐、兰考泡桐、鄂川泡桐和台湾泡桐的同品种、同方位和同高度的同
一病株病叶、病健叶和健株叶片的蛋白质进行了 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳及其水解产物进行了分
析研究。结果表明, 4种感病泡桐植株的叶片内都出现了一条健康植株叶片内没有的、分子量为 12
KD的蛋白质谱带, 并且同一病株病叶内该蛋白质的量较病健叶的量多。此外,楸叶泡桐和台湾泡
桐病株病叶、病健叶和健株叶片蛋白质的氨基酸组成也存在着明显差异。随叶片感病程度的加深,
胱氨酸含量逐渐增多, 而苯丙氨酸则逐渐减少。泡桐叶片内的这些变化可能与丛枝病的发生有一定
联系。
　　关键词　泡桐　丛枝病　蛋白质　氨基酸
　　泡桐丛枝病严重影响泡桐生长甚至存活,是林业生产中急需解决的问题之一。以前人们从
生理生化角度分析了泡桐感病过程中激素及其它指标的变化[ 1, 2]。近年来, 林木兰等人 [ 3, 4]借助
于分子生物学手段研究了植物菌原体( phytoplasmas)的一些特性。然而,目前该病的发病机理
及其防治方法都没有较大进展。为了解决泡桐丛枝病的发病机理, 本文研究了不同种泡桐病株
病叶、病健叶和健株叶片基因表达最终产物——蛋白质及其组成基本单位——氨基酸的差异,
为进一步研究泡桐丛枝病提供基础数据。
1　材料与方法
1. 1　材料及处理
试验材料分别为 1995年 5月 5日采于河南农业大学林业试验站(郑州北郊)的楸叶泡桐
( Paulow nia catalp if ol ia Gong T ong)、兰考泡桐( P . elongata S. Y. Hu)、鄂川泡桐( P . albip h-
loea Z. H. Zhu)和台湾泡桐( P . kawakanii Ito)的同品种、同方位、同高度的同一病株病叶(病
叶)和病株健叶(病健叶)及健株的叶片(健叶)。称取采集后贮于液氮的 4种泡桐的不同叶片
10 g ,迅速放入盛有液氮的 4个研钵内研磨成粉末(必要时加入液氮以防止组织融化) , 并转移
到 4个 250 mL 的离心管内,分别加入 100 mL 冷( - 40℃)的 10%三氯醋酸(丙酮配制,内含
0. 07%的巯基乙醇)振荡混匀,在- 40℃条件下静置 1 h 后, - 4℃10 000 g 离心 30 min,倒去
上清液,沉淀用 100 mL 冷( - 40 ℃)丙酮(内含 0. 07%巯基乙醇)悬浮;然后,分别将其放入-
40 ℃冰箱内静置 30 m in后, 如上条件进行离心,沉淀真空干燥后用于提取蛋白质。
1. 2　试验方法
林业科学研究　1997, 10( 6) : 570～573
Forest Research 　　 　
1. 2. 1　蛋白质提取　分别称取 100 mg 上面处理的叶片干粉于 1. 5 mL 离心管内,分别加 1
mL UKS 溶液( 9. 5 mol·L - 1尿素, 5 mmol·L - 1K 2CO 3, 1. 25%SDS, 0. 5%二硫苏糖醇, 2%两
性载体电解质( pH3. 5～10) , 5%T riton X-100)混匀,在 60 ℃水浴中温育 10 m in, 然后,室温 1
万 g 离心 30 min,离心后的上清液即为电泳分析的蛋白质样品。
1. 2. 2　电泳　参照Laemilli和范国强 [ 5, 6]法。浓缩胶和分离胶浓度分别为4%和 13% ,电流强
度为30 mA/板,上样量为10
g 蛋白质样品。电泳结束后,凝胶用染色液( 0. 025%考马斯亮蓝
R250 , 45%甲醇, 10%冰醋酸)染色和脱色液( 10%甲醇, 7%冰醋酸)脱色,脱色好的凝胶用于照
相。
1. 2. 3　氨基酸的测定　将在林业试验站采集的泡桐叶片在 80 ℃条件下烘干,研成粉末,在 6
N HCl真空密封条件下进行酸水解 [ 7] , 然后在日立 835-50型氨基酸分析仪上进行氨基酸含量
的测定。每一数据测定 3次,取其平均值。
2　结果与分析
2. 1　不同感病程度泡桐叶片蛋白质 SDS-PAGE
由楸叶泡桐、兰考泡桐、鄂川泡桐和台湾泡桐的病株病叶、病健叶、健株叶片蛋白质的
SDS-PAGE 结果(如图 1)可以看出, 4种泡桐叶片内蛋白质在大分子量( 43 KD以上)区域内
各种泡桐有一定的差异,即楸叶泡桐分别比兰考泡桐、鄂川泡桐和台湾泡桐多一条 A、B、C 带。
这说明 4种泡桐基因组方面存在着一定的差异。分别比较4种泡桐健株叶片、病株病叶和病健
叶蛋白质的电泳结果发现, 感病植株叶片蛋白质较健康植株多一条分子量 12 KD 的谱带 D,
但该蛋白质在病株病叶中的含量较病健叶内的高。这意味着该蛋白质含量的高低与其叶片的
感病程度有一定的关系。
图 1　不同感病程度泡桐叶片蛋白质 SDS-PAGE
1. 1, 1. 2, 1. 3楸叶泡桐健叶,病健叶,病株病叶　 2. 1, 2. 2, 2. 3兰考泡桐健叶,病健叶,病株病叶
3. 1, 3. 2, 3. 3鄂川泡桐健叶,病健叶,病株病叶　 4. 1, 4. 2, 4. 3台湾泡桐健叶,病健叶,病株病叶
2. 2　不同种泡桐病健株叶片氨基酸的含量
由楸叶泡桐和台湾泡桐病株病叶、病健叶和健株叶片氨基酸分析结果(见下页表 1)可以
看出,同一种泡桐感病程度不同,叶片的氨基酸含量存在一定的差异。这意味着楸叶泡桐和兰
考泡桐感病后叶片蛋白质的组成发生了变化。对台湾泡桐和楸叶泡桐来说,在所分析的氨基酸
5716 期　　　　　　　范国强等: 泡桐丛枝病发生与叶片蛋白质和氨基酸变化关系的研究
中,只有胱氨酸和苯丙氨酸表现出随叶片感病程度的加深, 呈现出的变化趋势相同, 即胱氨酸
的含量随叶片感病程度的加深逐渐增多,而苯丙氨酸的含量则逐渐减少,其它氨基酸变化则没
有一定的规律。苯丙氨酸含量的减少可能与叶片发生病变有一定的关系。比较楸叶泡桐和台
湾泡桐叶片碱性氨基酸(赖氨酸+ 组氨酸+ 精氨酸)的变化结果可以看出,病叶内的碱性氨基
酸含量最低, 病健叶内的较低,而健叶内的较高。这种变化也许与叶片DNA 的活动有关,最终
使叶片表现出病症。
表 1　不同泡桐病健株叶片的氨基酸含量 (单位: mg/ g)
氨基酸种类 楸叶桐健 楸叶桐病 楸叶桐病健 台湾桐健 台湾桐病 台湾桐病健
天冬氨酸( Asp. ) 14. 67 23. 94 20. 77 26. 32 24. 46 23. 12
苏氨酸( Th r. ) 5. 69 8. 79 7. 74 9. 87 7. 95 8. 10
丝氨酸( Ser. ) 8. 98 16. 66 25. 00 24. 01 18. 35 24. 00
谷氨酸( Glu. ) 3. 59 21. 52 19. 01 14. 80 12. 84 16. 82
脯氨酸( Pro. ) 16. 76 24. 85 25. 35 28. 94 24. 46 22. 52
甘氨酸( Gly. ) 5. 69 1. 51 8. 80 6. 25 8. 56 2. 70
丙氨酸( Ala. ) 2. 99 1. 21 4. 58 3. 62 1. 56 3. 30
胱氨酸( Cys. ) 1. 20 2. 73 2. 46 1. 64 4. 59 3. 90
缬氨酸( Vsl . ) 1. 80 3. 94 3. 87 3. 62 2. 47 2. 40
蛋氨酸( Met . ) 1. 80 1. 82 1. 27 4. 60 3. 98 2. 20
异亮氨酸( Il e. ) 2. 69 2. 76 5. 28 3. 32 3. 32 2. 70
苯丙氨酸( Phe. ) 6. 36 3. 89 5. 63 7. 56 1. 50 5. 81
赖氨酸( Lyr. ) 7. 89 4. 79 5. 98 8. 22 3. 90 7. 34
组氨酸( His. ) 2. 42 1. 50 1. 76 2. 63 1. 90 2. 14
精氨酸( Arg. ) 7. 58 4. 79 6. 69 8. 55 8. 71 7. 34
3　讨　论
　　蛋白质是基因表达的最终产物。植物体内任何一种蛋白质都有基因与其相对应。当外界
环境条件发生变化时, 植物体内的代谢活动也随之发生改变, 这种改变也将引起其体内基因表
达活动的变化。对泡桐来说,当植物菌原体侵入树体后,必然引起各种生理生化反应的变化,虽
然研究这些反应有利于阐明泡桐丛枝病发生与这些反应的关系,但很难弄清该病的发生机理。
众所周知,氨基酸是合成蛋白质的基本单位,蛋白质又是基因表达的最终产物。因此,研究蛋白
质与泡桐丛枝病发生的关系,对于阐明泡桐丛枝病的发生机理具有重要的意义。Saho 用乙醇
和盐酸提取白花泡桐叶片发现, 感病和健康植株叶片的氨基酸含量没有差异,但盐酸提取出病
枝上小叶的氨基酸比正常叶片的低 1/ 5[ 8]。本实验结果与其有一定的差异,这可能主要是由于
所测氨基酸不同的缘故( Saho 所测氨基酸为乙醇和盐酸提取出来的, 而本文的结果则是叶片
全蛋白质的水解产物)。本试验通过电泳技术找出了蛋白质与泡桐丛枝病发生的关系,这点从
楸叶泡桐和台湾泡桐病株病叶、病株健叶和健株叶片蛋白质的水解产物的不同得到了进一步
证实。这些实验结果为以后了解泡桐丛枝病的发病机理提供了基础数据。有关该(类)蛋白质
在发病过程中的作用有待于进行深入的研究。
572 林 业 科 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　10 卷
参　考　文　献
　　1　王　蕤.激素对泡桐丛枝病发生的影响.见:中国林学会泡桐文集.北京:中国林业出版社, 1980. 40～45.
　　2　蒋建平,武禄光,刘廷志,等.泡桐丛枝病与过氧化物酶含量关系研究初报.河南农业大学学报, 1993, 26 ( 1) : 301～
304.
　　3　张春立,林木兰,胡勤学,等.泡桐丛枝病类菌原体的分子克隆与序列分析.植物学报, 1994, 36( 4) : 278～282.
　　4　林木兰,张春立.泡桐丛枝病类菌原体单克隆抗体的研制及初步应用.植物学报, 1993, 35( 9) : 710～715.
　　5　范国强,蒋建平.泡桐叶片蛋白质提取方法的研究.植物学通报, 1997, 12( 2) : 56～58.
　　6　Laemill U K. Cleavage of st ructural proteins d uring the ass emb ly of the h ead of basleriophage T 4. Natur e, 1997,
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　　7　Richter G. Phys iology and biochem ist ry of primary m etabolism . Florida: CRC Press , 1978, 377～387.
　　8　S ah o H . On the amino acids of Paulow nia tomentosa ( Th umb ) Stau d affected b y w itches′broom　Part I　Th e
amino acids of leaves and tw igs . J . Jap. For . Soc. , 1957, 39( 1) : 447～451.
Study on the Relation between Witches′Broom, Protein and
Amino Acid Change in Paulownia Leaves
Fan Guoqiang　 J iang J ianp ing
　　Abstract　T his paper dealt w ith the SDS polyacrymide gel elect rophoresis of pr oteins
and analysis of the amino acids in the diseased and healthy leaves, at the same side and same
height , of the same st rain of Paulow nia catalp if olia, P. elongata, P . albip hloea and P .
kawakamii r espect ively. T he results indicated that the leaves of 4 species o f Paulow nia tr ess
w ith witches′broom had one pr otein band, of w hich molecular w eight w as 12 KD, w hich did
not appear in the healthy leaves fr ee o f phytoplasmas. Mo reover, the pr otein quantity in the
affected leaves w as more than that in the heal thy leaves f ree of phy toplasmas. Mo reover, the
pr otein quant ity in the affected leaves w as more than that in the healthy leaves f ree of phyto-
plasmas. At the same t ime, there w as signif icant dif ference on the am ino acids betw een the
healthy and diseased leaves of P. catalp if olia and P. kawakamii . The amount o f cy st ine in
the affected leaves w as higher than that in the heal thy leaves, but the change of amount o f
pheny lalanine in the af fected and healthy leaves w as contr ar y. T hese changes of pro teins and
amino acids in the leaves might be related to the witches′br oom of the Paulow nia t rees.
　　Key words　Paulow nia　w itches′broom　protein　am ino acid
　　 Fan Guoqiang , Profes sor, Jiang Jianping ( Inst itute of Paulow nia, Henan Agricu ltural U nivers ity 　 Zhen gzhou　
450002) .
5736 期　　　　　　　范国强等: 泡桐丛枝病发生与叶片蛋白质和氨基酸变化关系的研究