全 文 ：　　1997—09—05收稿。
尤勇助理研究员,洪菊生(中国林业科学研究院林业研究所　北京　100091)。
* 本研究属国家“八五”攻关课题“杉木多世代遗传改良和建筑材优良无性系选育”专题的部分内容。
杉木 DNA 的简便提取方法*
尤　勇　洪菊生
　　关键词　杉木针叶　DNA　巯基乙醇　次生物质
　　杉木( Cunninghamia lanceolata ( Lamb) Hook. )是我国的特有树种,其分子生物学研究目
前在国内外开展的较少,其近缘种的研究也较少。为了开展杉木分子生物学的研究,首先应解
决杉木 DNA 的提取。本实验对提取 DNA 方法进行了研究,探索到了一种快速提取 DNA 的
方法, 该方法可从不同生长期的杉木针叶中提取 DNA, 也可从水杉( Metasequoia glyp-
tostr oboides Hu et Cheng)、柳杉( Cryp tomeria f or tunei Hoo ibrenk)、秃杉( Taiw ania f lousiana
Gaussen)、侧柏( P laty cladus oriental is ( L . ) Fr anco)针叶中提取 DNA。
1　材料和方法
1. 1　材料
实验用的杉木、柳杉、秃杉、侧柏和水杉的材料均采自江苏句容林场,用液氮罐保存。
主要仪器: 20Pr-52D型日立高速冷冻离心机、恒温水浴锅(北京医疗器械厂)、平板电泳仪
(北京六一仪器厂)等。药品与试剂: ( T ris-Cl、EDT A、SDS、PVP-360等)均购自华美生物工程
有限公司。
1. 2　提取方法
( 1)取 1～2 g 针叶, 在液氮中迅速研磨后转入 50 mL 离心管; ( 2)迅速加入 12 mL 预热
( 65℃)的 DNA 提取液 ( 100 mmo l/ LTri-Cl, 50 mmol / L EDT A, 500 mmol / L NaCl , 2%SDS
(W / V ) , 1%PV P-360, 2%巯基乙醇(使用前加入) )中, 于65℃保温 20～30 min; ( 3)加入 4 mL
的 5 mol / L KAC,然后迅速放置在冰上 5～10 min; ( 4)加入 16 mL 的氯仿∶异戊醇( 24∶1) ,
颠倒混匀后于 800～1000 r / min离心 10 min 分相; ( 5)上清液中加入 2/ 3体积预冷的异丙醇,
室温放置 30 m in后, 用玻棒将漂浮的絮状物捞出,然后放入另一离心管中; ( 6)用 75%乙醇洗
涤 2次絮状物,风干后,溶于 200 mL T E 缓冲液; ( 7)用等体积的氯仿∶异戊醇( 24∶1)抽提 1
次; ( 8)上清液加入1/ 10体积 3 mol/ L NaAC,再加入 2倍体积无水乙醇,冰箱放置 20 min 后,
1 000 r/ m in 离心沉淀 DNA; ( 9)沉淀 DNA 用 75%乙醇洗涤 2次,风干后,溶于适量 TE 溶液
中备用。
1. 3　DNA质量的检测
将得到的杉木 DNA 样品适当稀释后,在 0. 8%的琼脂糖凝胶上电泳检测其质量,同时加
Lamda 总 DNA 做对照。
林业科学研究　1998, 11( 1) : 111～113
Forest Research 　　 　　　
2　结果与分析
　　预备实验中, 先参照大豆DNA 的提取方法 [ 1] ,没有成功。然后又采用了李希臣的方法[ 2]得
到的杉木 DNA 呈红褐色, DNA 溶液非常粘滞, 不容易抽提和纯化,经查明是粗提 DNA 中掺
杂了大量的色素、次生物质和多糖。国外已有相类似的报道[ 3]。这样粗提得到的 DNA 不能进
行 PCR 反应和经限制性酶消化; 而且这些杂质既不能通过酚和氯仿抽提除去,又不能通过沉
淀 DNA 将其去掉。
针对这种情况,参照 B. Heinie[ 4]的 DNA 提取方法进行实验,经过一系列改进建立了适合
提取杉木DNA 的方法,提取过程的要点是: ( 1)材料研磨的粗细、研磨时间的长短都影响最后
DNA 的提取,在研磨细的前提下研磨的时间越短越好( 2)在提取液中加入 2%巯基乙醇和
PVP-360有助于去除杉木针叶中的大量色素及次生物质。每管提取液在预热后马上加入研磨
好的材料和 200
L 巯基乙醇, 新鲜材料温浴后的提取液呈淡绿色为正常,温浴的时间为 20～
30 min; ( 3)由于针叶中含有较多的酚类物质,在提取液中加入 1%的 PVP-360,用于抑制酚类
物质的褐化,然后通过离心将PVP 与多酚物质结合形成的复合物除去。( 4)在用乙醇沉淀杉木
DNA 时另加了不同浓度的 NaAc溶液, 用 3 mol/ L NaAC溶液同乙醇一起沉淀杉木 DNA 粗
提样品能够有效的除掉多糖。经过以上的改进,摸索到了适合提取杉木 DNA的方法。
DNA 样品用 0. 8%的琼脂糖凝胶电泳检测,结果表明这种方法提取的 DNA很少受到
剪切和降解(图 1) ; 杉木 DNA 分子量较大,一
般在50 kb 以上;限制酶切消化检测表明所得
DNA 易被内切酶消化(图2) ,因此用这种改进
图1　杉木总 DNA
1.
DNA 分子量标记;
2～8.不同含量的杉木总DNA
图2　HindⅡ酶切的杉木总 DNA
1.
DNA 分子量标记(Hin dⅢ+ EcoRI) ;
2～11. HindⅡ酶切后的杉木总 DNA
方法得到的 DNA 适合于 PCR 及 RFLP 指纹图谱分析。用此方法也提取了高质量的柳杉、水
杉、秃杉及侧柏的 DNA。
3　讨　论
　　在杉木针叶 DNA 的提取过程中遇到了许多困难。如从树上采下针叶到运进实验室,中间
的许多环节都会影响 DNA 的提取质量。同时针叶比较坚硬,研磨时比较费力且不易磨碎。针
叶又含有大量的色素、多糖及其它次生物质, 且在提取过程中很难去除。以 B. Heinie的 DNA
112 林 业 科 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　11卷
方法为基础作了重要的改进, 使之适合于杉木针叶 DNA 的提取, 又避免了国外常用的 CT AB
方法造成的材料损失。所得杉木 DNA 分子量在50 kb 以上, DNA 没有剪切和降解的现象, 不
仅适合于RAPD 分析,也适合于 RFLP 作图及其它 DNA 标记技术。
该 DNA 提取方法的主要特点是: ( 1)在提取液中加较高浓度的巯基乙醇有助于去除针叶
中的色素及其它次生物质; ( 2)采用高盐的方法结合乙醇沉淀除去样品的多糖; ( 3)用 PVP-
360部分去除针叶中的多酚物质和色素; ( 4)可以从不同生长期的杉木针叶中提取 DNA。
从杉木针叶中提取 DNA 可以直接在杉木种源基因库中取样,这可避免从各产地采种提
取 DNA 所带来的许多困难。因此, 所改进的方法可以推广到许多采种困难的针叶树种上去。
参　考　文　献
　　1　T ai T H , Tanks ley S D. A rapid and inex pens ive meth od for total DNA from dehydrated plant t iss ue. Plant Mol.
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　　2　李希臣,雷勃钧.高效的植物 DNA 提取方法.生物技术, 1991, 4( 3) : 39～41.
　　3　Vignir S, Kesara A. DNA fin gerprit in g of P op ulus tri chocarp a clones us ing RAPD markers. New Fores t s, 1995, 10
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　　4　Hein ie B, Wes tcot t R. Appl icat ion of random am plif ied polymorph ic DNA to detect genetic variation in Norw ay
spru ce. New Fores t s, 1996, 11( 2) : 173～184.
A Simple Procedure for Extraction and
Purification DNA in Chinese fir
You Yong　 H ong Jusheng
　　Abstract　A simple, quick and reliable pro cedure w as developed for the ex t ract ion and
purif icat ion of DNA from the leaves o f Chinese f ir . Specifical ly designed to over come the
t rouble caused by the very high concentrat ion o f pigments, polysaccharides and o ther contam-
inants in the leaves. In this procedure, the applicat ion of ex tr act ion buf fer w ith high concen-
tr ation of mercapto ethano l ( 2% ) w as proved to be successful in r emoving pigments, ethanol
pr ecipitation of resuspended nucleic acids fr om 3 mol / L N aAC and r evealed to be powerful in
remov ing polysaccharides, and PVP-360 was used to remove polypheno ls. The resulted DNA
w ith this method was of high molecular w eight ( more than 50 kb) and w as completely di-
gest ible w ith restr ict ion endonucleases and amplifiable in PCR, they are well suited to
RAPD, RFLP analy sis and other molecular marker systems. T his procedur e can also be used
to ex t ract DNA from other g ymnosperms, for example: T aiw ania f iousiana, Metasequoia
glyp tost roboides, Cryp tomeria f or tunei etc.
　　Key words　Chinese f ir needle　DNA　mercapto ethano l　secondary metabol ite
　　You Yong, Ass istant Profes sor, Hong Jusheng ( T he Research Inst itute of Forest ry, CAF　 Beijing　 100091) .
1131期　　　　　　　　　　　　尤　勇等: 杉木 DNA 的简便提取方法