全 文 ：第 50 卷 第 8 期
2 0 1 4 年 8 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 50，No. 8
Aug．，2 0 1 4
doi:10．11707 / j．1001-7488．20140817
收稿日期: 2013 － 06 － 07; 修回日期: 2013 － 11 － 19。
基金项目: 国家自然科学基金项目(31070578)。
* 朱天辉为通讯作者。
梢枯病菌蛋白毒素对杂交竹线粒体
结构和功能的影响*
李姝江 谯天敏 韩 珊 朱天辉 车冠男
(四川农业大学林学院 雅安 625014)
摘 要: 采用不同检测技术(荧光偏振法、中性红法、氧电极法等)测定梢枯病菌蛋白毒素对不同杂交竹品种
嫩枝离体线粒体膜的流动性、表面电位、肿胀度、聚集度及脂质过氧化物 MDA、辅酶 Q10(CoQ10)含量、线粒体呼
吸功能的影响。结果表明:蛋白毒素胁迫使 4 个竹品种的线粒体膜流动性减弱、表面电位减低、肿胀度增大、聚
集度降低; CoQ10 含量下降，MDA 含量增加，细胞色素 C 氧化酶(CCO)、ATPase 活性亦下降，呼吸控制率(ＲCＲ)
和磷氧比( P /O)明显降低。说明蛋白毒素对杂交竹嫩枝线粒体膜造成损伤，线粒体脂质过氧化程度增加，膜完
整性被破坏，呼吸作用受抑制。以上各项指标中，抗病品种 ( 3 #和 6 #)受蛋白毒素的影响均显著低于感病品
种(8#和 30#)。
关键词: 蛋白毒素; 线粒体; 生物物理特性; 呼吸作用
中图分类号: S718. 43; S763. 15 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2014)08 － 0119 － 07
Effects of Protein Toxin from Arthrinium phaeospermum on Biophysical
Characteristic and Ｒespiration of Bambusa pervariabilis ×
Dendrocalamopsis grandis Mitochondria
Li Shujiang Qiao Tianmin Han Shan Zhu Tianhui Che Guannan
(College of Forestry，Sichuan Agricultural University Ya’an 625014)
Abstract: Effects of the protein toxin from Arthrinium phaeospermum on the membrane fluidity，surface electronic
potential，swelling，aggregation and the contents of lipid peroxide MDA，Coenzyme Q 10 ( CoQ10 )，and respiration
function of the mitochondria from shoots of different Bambusa pervariabilis × Dendrocalamopsis grandisvarieties were
determined by the different detection techniques ( fluorescence polarization，neutral red dye，oxygen electrode，etc． ) ．
The results showed that the protein toxin caused the membrane fluidity weakening，surface electronic potential and
aggregation decrease，swelling increase of mitochondria in four bamboo varieties． With the protein toxin treatment，the
CoQ10 content decreased，the MDA content increase，the activities of cytochrome c oxidase (CCO) and ATP decrease，
respiratory control ratio ( ＲCＲ ) and oxidative phosphorylation ratio ( P /O ) significantly reduced． The above results
demonstrated that the protein toxin damaged the mitochondrial membrane， increased the lipid peroxidation of
mitochondrion，destroyed the membrane integrality，and inhibited the respiration． In term of all of the above indices，the
effect of protein toxin on the resistant varieties (3# and 6#) was significantly weaker than that on the susceptible varieties
(8# and 30#) ．
Key words: protein toxin; mitochondrion; biophysical characteristic; respiration
氧化磷酸化合成的 ATP 能为细胞代谢提供能
量，而线粒体是植物进行氧化磷酸化的场所，其结构
和功能的正常性对细胞、组织甚至整个有机体正常
功能的维持相当重要(钱琼秋等，2006a)。众多研
究(陈靠山等，1995; 王立安等，2004; 李赤等，
2011; 张云霞等，2011)表明:植物病原毒素对线粒
体的作用主要集中在超微结构上，诸如膜结构的破
坏、脊膨胀、空泡化，基质电子密度降低，线粒体基质
林 业 科 学 50 卷
及脊数减少以至消失等，并抑制 NADH 或者琥珀酸
及苹果酸的氧化。而毒素干扰线粒体膜生物物理特
性、导致呼吸作用的氧化磷酸化解偶联等生理代谢
的研究较少，特别在木本植物上尚未涉及。
杂交竹 (Bambusa pervariabilis × Dendrocalamopisis
grandis)梢枯病引起四川栽培区内杂交竹大量枯死
(朱 天 辉 等， 2009 )，其 病 原 暗 孢 节 菱 孢 菌
(Arthrinium phaeospermum)产生的蛋白毒素是引起
该病的主要因素(李姝江等，2012a)。前期试验表
明，该蛋白毒素的作用位点在杂交竹质膜上 (李姝
江等，2012b)，但线粒体作为为细胞各种生理活动
提供能量的细胞器，毒素对其结构和功能的影响尚
缺乏直接证据。本文以四川栽培区内 4 个杂交竹品
种嫩枝为研究对象，采用不同检测技术测定蛋白毒
素对线粒体膜的流动性、表面电位、肿胀度及脂质过
氧化物 MDA、辅酶 Q10( coenzyme Q，CoQ10)含量、
线粒体呼吸功能的影响，为阐明蛋白毒素对杂交竹
线粒体的作用机制以及抗感品种间的差异提供理论
依据。
1 材料与方法
1. 1 材料
杂交竹品种: 3#(中抗)、6#(抗病)、8#(高感)、
30#(感病)，1 年生，由四川省天全县杂交竹栽培区
提供。
供试菌株: 暗孢节菱孢菌，分离于杂交竹梢枯
病竹，由四川农业大学森林保护实验室提供。
1. 2 方法
1. 2. 1 蛋白毒素的制备 以改进 Fries 为基础培养
基(张金林等，2005)，定量接种在 PDA 平板上培养
的直径为 5 mm 的暗孢节菱孢菌丝块，26 ℃，140 r·
min － 1震荡培养 15 天，双层纱布过滤后，取其滤液经
透析 浓 缩、Sephadex G-100 凝 胶 层 析、High Q
Sepharose Fast Flow 强阴离子交换层析、SDS-PAGE
凝胶电泳、浸渍法(Ho et al．，1996)生物检测获得分
子质量约为 27 kDa 的单一活性蛋白毒素 (李姝江
等，2012a)。
蛋白毒素溶液: 将纯化后的蛋白毒素用无菌蒸
馏水稀释成 10，20，30，40，50，60，70，80 μg·mL － 1的
溶液。
1. 2. 2 蛋白毒素的胁迫处理 温室盆栽 1 年生杂
交竹 40 盆(3，6，8，30 号 4 个品种，每品种 10 盆)，
采用浸渍法(Ho et al．，1996)，取当年新抽嫩枝顶端
组织(不同品种)用 75% 酒精消毒 10 s，再用无菌水
清洗 3 次，然后插入保鲜膜封口的无菌 1. 5 mL 离心
管中，分别加入上述蛋白毒素溶液 1 mL，以无菌水
为对照。25 ℃培养箱中培养(每天光照 12 h)，每处
理 6 枝，重复 3 次。于 72 h 后对其进行线粒体的分
离提取。
1. 2. 3 线 粒 体 的 分 离 提 取 参 照 陈 靠 山 等
(1995)、Zhang 等(2012)的方法: 将植物材料切碎，
按 1∶ 1. 2(W /V)加进预冷的匀浆介质［50 mmol·L － 1
Tris-HCl ( pH7. 2)，0. 3 mol·L － 1蔗糖，1 mmol·L － 1
EDTA，0. 1% BSA，0. 1% Cys，1% PVP］，迅速研磨，
经 4 层纱布过滤，滤液于 1 500 r·min － 1离心 10 min，
取上清液于 10 000 r·min － 1离心 30 min，沉淀即为线
粒体，将其用含与不含上述蛋白毒素溶液的相应清
洗介质(除不含 PVP，BSA，Cys 外，其他均与匀浆介
质相同)悬浮到所需浓度，每处理 3 次重复。以上
操作均在 0 ～ 4 ℃条件下进行。
1. 2. 4 线粒体膜流动性的测定 线粒体膜流动性
采用微黏度的倒数表示，微黏度测定参照钱琼秋等
(2006a; 2006b)的方法采用荧光偏振法进行。荧光
分光光度计(日立 850)测量荧光偏振值(P)，以 360
nm 激发进行平行与垂直激发，并以 360 nm 的滤光
片除去激发波的散射光，发射波长为 430 nm，记录
荧光偏振值。微黏度 η = 2P /(0. 46 － P)。每处理 3
次重复，分别计算在蛋白毒素不同浓度( pH 7. 2)处
理下杂交竹嫩枝线粒体膜的微黏度。
1. 2. 5 线粒体膜表面电位的测定 采用中性红法
进行线粒体膜表面电位的测定，按照张志鸿等
(1991)的方法，测定中性红与 1 mL 线粒体混合后
不同 pH 的滴定曲线(OD520 )，根据不同 pH 时线粒
体结合中性红的量，求出中性红与线粒体结合的表
现滴定曲线中点(25 ℃ )，膜表面电位 ψ = (7. 0 －
pKa) × 60 mV，式中 pKa 为表观滴定曲线的中点。
pH 由等离子强度的缓冲液 (含 0. 4 mol·L － 1甘露
醇)调节。每处理 3 次重复，计算 40 μg·mL － 1蛋白
毒素浓度下膜的表面电位。
1. 2. 6 线粒体肿胀度测定 参照 Halestrap 等
(2002)的方法测定线粒体肿胀度。用紫外 － 可见
分光光度计(岛津 UV-2410PC)测定 520 nm 处的吸
光值，测定过程保持 25 ℃恒温。每处理 3 次重复，
计算经与未经蛋白毒素处理分别在 0，4，6，8，10，
20 min时的肿胀度。
1. 2. 7 线粒体聚集的测定 参照 Stillwell 等
(1987)的方法，将 0. 1 mL 线粒体加入含纯蛋白毒
素的清洗介质中，立即测定 OD350值(分光光度计)，
观察其变化。每处理 3 次重复，分别计算不同蛋白
毒素浓度下的聚集度。
021
第 8 期 李姝江等: 梢枯病菌蛋白毒素对杂交竹线粒体结构和功能的影响
1. 2. 8 与线粒体呼吸相关指标的测定 以下指标
均测定 40 μg·mL － 1蛋白毒素溶液处理的 4 个品种
杂交竹嫩枝线粒体，以未经处理的杂交竹为对照，每
处理设 3 次重复。
呼吸速率的测定采用液相氧电极(Hansatech 公
司 Oxygraph-Lab)法(桑庄特罗，1980)，调节整合半
导体控温装置为 25 ℃。1. 8 mL 反应介质 ( 200
mmol·L － 1蔗糖，10 mmol·L － 1 Tris-Mops，10 mmol·L － 1
EGTA，0. 4 mol·L － 1琥珀酸，5 mmol·L － 1 KH2PO4，
pH7. 4)中加入 200 μL 线粒体悬浮液，以 1 mmol·
L － 1的琥珀酸钠为呼吸底物，加入 200 nmol·L － 1的
ADP 产生呼吸态Ⅲ，以 ADP 耗尽时为呼吸态Ⅳ，氧
电极测定耗氧量的变化。计算呼吸控制率 ＲCＲ 值
( respiratory control ratio，即Ⅲ态与Ⅳ态呼吸率之比)
及磷氧比( oxidative phosphorilation ratio，P /O; 即每
次反应中所加入 ADP 量与加入 ADP 后线粒体氧化
磷酸化所消耗的氧原子之比)。
细胞色素 c 氧化酶( cytochrome c oxidase，CCO)
活性的测定采用 Ｒasmusson 等(1991)的方法，在紫
外一分光光度计上记录 OD550值，计算 CCO 活性。
辅酶 Q10(CoQ10)含量测定按 Takada 等(1984)
的方法进行，用反相高效液相色谱仪系统(ＲP-HPLC)
［KTA avant 25 ( GE Healthcare Life Sciences，
Beijing，China)测定，即用 Zorbax 300SBC － 18 (4. 6
mm × 250 mm，5 μm) ( Agilent Technologies，Santa
Clara，CA，USA)柱，检测波长 269 nm，流动相为 3. 5
g NaClO4 + 50 mL 甲醇 + 450 mL 乙醇 + 0. 5 mL 70%
HClO4，流速 1 mL·min
－ 1。
以脂质过氧化产物的终产物丙二醛(MDA)表
示脂质过氧化水平，参照 Cakmak 等(1992)的方法
测定。ATPase 测定采用钱琼秋等(2006b)的方法，
ATPase 活力单位以每小时分解每毫克蛋白产生的
无机磷(Pi)的量来表示，即 μmol·mg － 1 h － 1。
以上项目蛋白质测定中采用 Bradford(1976)的
方法，以 BSA 为标准蛋白，用紫外 － 分光光度计测
定(岛津 UV-2410PC)。
1. 2. 9 数据分析 试验数据采用 EXCEL 和
SPSS13. 0 软件分析处理，LSD 法进行多重比较(P ＜
0. 05)。
2 结果与分析
2. 1 蛋白毒素对线粒体膜流动性的影响
微黏度测定结果(图 1)表明，随毒素浓度增加，
4 个品种杂交竹嫩枝微黏度有不同程度的升高，因
为微黏度越小，线粒体膜的流动性越大，所以蛋白毒
素可以减弱杂交竹嫩枝线粒体膜的流动性。然而，
不同品种间对毒素敏感性有差异: 对于感病品种
8 号和 30 号，当毒素浓度分别大于 10 和 20 μg·
mL － 1时，膜微黏度不再继续升高; 而抗病品种 3 号
和6 号，毒素浓度分别大于 30 和 40 μg·mL － 1时，膜
微黏度才保持稳定，可见蛋白毒素对线粒体膜流动
性的影响有一个饱和效应。结合前期研究中“蛋白
毒素 40 μg·mL － 1 时致病力最强”(李姝江等，
2012a)的结论，以下测定指标均设定毒素浓度为
40 μg·mL － 1。感病品种 8#和 30#在蛋白毒素浓度为
20 μg·mL － 1后微黏度差异不显著，但显著高于抗病
品种3#和6#，其中6#的微黏度最低。以上结果说明
6#杂交竹嫩枝受蛋白毒素侵染后线粒体膜的流动性
较其他 3 个品种大，所受的伤害最小。
图 1 蛋白毒素浓度对不同杂交竹品种
嫩枝线粒体膜微黏度的影响
Fig． 1 Effect of protein toxin of different concentrations on the
membrane micro-viscosity of mitochondria purified from the
shoots of different B． pervaiabilis × D． grandis varieties
小写字母表示同一品种在不同毒蛋白浓度下在 P ＜ 0. 05 水
平上差异显著( LSD 测验)，大写字母表示同一浓度不同品
种在 P ＜ 0. 05 水 平 上 差 异 显 著 ( LSD 测 验 )。 Different
lowercase letters indicate significant differences among different
protein toxin concentration in one variety by the LSD test ( P ＜
0. 05) ; different capital letters indicate significant differences
among different varieties in the same concentration by the LSD
test (P ＜ 0. 05) ．
2. 2 蛋白毒素对线粒体膜表面电位的影响
从图 2 可以看出，4 个品种的线粒体与中性红
结合的表观滴定中点不同，毒素处理与未经毒素处
理的线粒体与中性红结合的滴定中点也不同，毒素
处理使滴定中点明显向高 pH 偏移。具体来看，未
处理的 3 号线粒体与中性红结合的滴定中点为 pH
7. 4，处理后升高为 pH 7. 6; 未处理的 6#、8#、30#分
别为 pH 7. 2，7. 9，7. 7，处理后分别为 pH 7. 4，8. 25，
8. 0。经公式换算膜表面电位，结果见表 1。可以看
出，蛋白毒素处理后显著降低各品种嫩枝线粒体膜
121
林 业 科 学 50 卷
的表面电位，但品种不同其作用也有差异。感病品
种 8#和 30#无论毒素处理还是未处理的条件下，其
膜表面电位均显著低于抗病品种，大小顺序为 6# ＞
3# ＞ 30# ＞ 8#。分析原因可能是，8#和 30#杂交竹线
粒体膜自身的保护功能就较 3#和 6#差，因此膜表面
电位低，从而影响质子泵功能，阻碍 ATP 生成。
图 2 不同杂交竹品种嫩枝线粒体中性红表观滴定曲线
Fig． 2 Effect of protein toxin on the apparent titer curve of mitochondrion-bound neutral red in the
shoots of different B． pervaiabilis × D． grandis varieties
A，B，C，D:杂交竹(B． pervaiabilis × D． grandis varieties)3#，6#，8#，30#; CK-3，CK-6，CK-8，CK-30 未经蛋白
毒素处理的线粒体 Mitochondria treated without protein toxin．
表 1 不同杂交竹品种嫩枝线粒体膜表面电位①
Tab. 1 Surface electrostatic potential of
mitochondrial membrane of the shoot of different
B． pervaiabilis × D． grandis varieties mV
品种 Variety CK 蛋白毒素 Protein toxin (40 μg·mL － 1 )
3# － 24 ± 0. 5Bc － 36 ± 0. 5Ac
6# － 12 ± 0. 5Bd － 24 ± 0. 5Ad
8# － 54 ± 1. 0Ba － 75 ± 1. 0Aa
30# － 42 ± 0. 5Bb － 60 ± 1. 0Ab
①CK: 无蛋白毒素处理 Treatment without protein toxin。同列数
据后不同小写字母表示同一处理不同品种在 P ＜ 0. 05 水平上差异
显著(LSD 测验); 同行数据后不同大写字母表示同一品种不同处理
在 P ＜ 0. 05 水平上差异显著 ( LSD 测验)。Data in the same column
followed by different lowercase letters indicate significant differences
among different varieties with the same treatment by the LSD test ( P ＜
0. 05) ; data in the same row followed by different capital letters indicate
significant differences for one variety between different treatments by the
LSD test (P ＜ 0. 05) ．
2. 3 蛋白毒素对线粒体肿胀度的影响
线粒体肿胀度增加导致浑浊，吸光度就会下降。
因此，从图 3 可以看出，蛋白毒素使不同杂交竹品种
嫩枝线粒体肿胀度均增加，由此可以认为杂交竹受
蛋白毒素胁迫后，线粒体完整性下降。但 4 个品种
线粒体肿胀度增加幅度差异显著，8#杂交竹线粒体
肿胀度最大，完整性破坏最为严重; 6#杂交竹线粒
体完整性相比其余 3 个品种更好，这可能与品种间
的抗感差异有关。
图 3 蛋白毒素对不同杂交竹品种
嫩枝线粒体肿胀度的影响
Fig． 3 Effect of protein toxin on the mitochondrial
swelling from the shoots of different
B． pervaiabilis × D． grandis varieties
2. 4 蛋白毒素对线粒体聚集度的影响
从图 4 可以看出，感病品种(8#和 30#)在蛋白
221
第 8 期 李姝江等: 梢枯病菌蛋白毒素对杂交竹线粒体结构和功能的影响
毒素浓度大于 20 μg·mL － 1时，可显著降低吸光值，
说明蛋白毒素可能使得线粒体表面电荷密度增加，
线粒体间排斥力增强到了足以使线粒体不能相互聚
集的程度，因此，感病品种线粒体更分散。但表 1 中
的结果显示 40μg·mL － 1毒素处理可显著改变抗病
品种(3#和 6#)杂交竹线粒体膜表面电位，而图 4 结
果显示毒素处理对 3，6#线粒体的聚集程度几乎无
影响，表明除线粒体膜表面电位外，可能还有其他不
受毒素影响的因素(如抗性品种线粒体表面电荷更
稳定)可影响线粒体的聚集程度。
图 4 蛋白毒素对不同杂交竹品种
嫩枝线粒体聚集度的影响
Fig． 4 Effect of protein toxin of different concentrations on the
mitochondrial aggregation from the shoots of different
B． pervaiabilis × D． grandis varieties
2. 5 蛋白毒素对线粒体呼吸的影响
2. 5. 1 蛋白毒素对线粒体呼吸速率及 CCO 活性的
影响 在毒素胁迫下，4 个品种杂交竹线粒体呼吸
作用均受到一定影响(表 2)。在呼吸态Ⅲ中，4 个
品种与各自对照相比显著降低，抗病品种 3#和 6#显
著高于感病品种 8#和 30#; 而呼吸态Ⅳ呼吸速率与
各自对照相比则相对增加，4 个品种间差异不显著。
另外，呼吸控制率 ＲCＲ 明显降低，抗病品种显著高
于感病品种; 呼吸作用的 P /O 下降，因为 ＲCＲ 和
P /O 可以反映线粒体氧化磷酸化机能，也表明线粒
体结构的完整性程度，所以该蛋白毒素可严重干扰
线粒体膜的氧化磷酸化偶联作用，降低氧化磷酸化
并破坏完整性，且这种干扰和降低程度与杂交竹抗
性有关。
细胞色素 c 氧化酶(CCO)是线粒体内膜呼吸酶
系的关键酶，其活性改变直接影响氧化磷酸化能力。
表 2 显示毒素能使 4 个品种中该酶活性显著降低，
从而使线粒体呼吸速率下降，氧化磷酸化机能减弱。
但这种趋势因杂交竹抗感性不同而有差异，抗病品
种 3#和 6#线粒体呼吸能力受蛋白毒素影响相对较
小，其呼吸功能能维持在一定水平。
表 2 蛋白毒素对杂交竹嫩枝线粒体呼吸作用的影响①
Tab. 2 Effect of protein toxin on the respiration of mitochondria purified from the
shoots of different B． pervaiabilis × D． grandis varieties
项目 Item
品种 Variety
3# CK-3 6# CK-6 8# CK-8 30# CK-30
呼吸Ⅲ态
StateⅢ /(nmol
O2·min
－ 1mg － 1 protein)
36. 88 ±1. 78c 47. 38 ±2. 48a 40. 11 ±2. 05b 47. 45 ±1. 77a 30. 33 ±2. 14d 46. 25 ±2. 02a 31. 15 ±1. 43d 46. 26 ±1. 98a
呼吸Ⅳ态
State Ⅳ /(nmol
O2·min
－ 1mgI － 1 protein)
27. 11 ±1. 32a 19. 26 ±1. 12b 27. 47 ±1. 15a 19. 33 ±1. 02b 26. 45 ±1. 32a 19. 34 ±1. 14b 26. 98 ±1. 24a 19. 58 ±1. 36b
呼吸控制率
ＲCＲ
1. 36 ±0. 05c 2. 46 ±0. 09a 1. 46 ±0. 03b 2. 46 ±0. 05a 1. 14 ±0. 01d 1. 83 ±0. 04b 1. 15 ±0. 02d 1. 81 ±0. 03b
磷氧比 P /O 1. 49 ±0. 03c 2. 35 ±0. 08a 1. 75 ±0. 04b 2. 39 ±0. 04a 1. 02 ±0. 02d 2. 33 ±0. 07a 1. 13 ±0. 02d 2. 35 ±0. 08a
CCO活性
CCO activity /
(nmol·min － 1mg － 1 protein)
92. 46 ±3. 32c 151. 60 ±6. 12a 115. 32 ±4. 13b 152. 56 ±2. 75a 67. 56 ±3. 16d 150. 79 ±3. 08a 69. 78 ±3. 11d 151. 17 ±3. 35a
①同行不同数据后的小写字母表示在 P ＜ 0. 05 水平上差异显著(LSD 测验)，下同。Data in the same row followed by different lowercase letters
indicate significant differences by the LSD test (P ＜ 0. 05)，the same below．
2. 5. 2 蛋白毒素对线粒体 CoQ10 的影响 对比各
自的对照，毒素处理使 4 个品种嫩枝线粒体内
CoQ10 含量显著下降(图 5)。抗感品种间下降程度
有明显差异，以 8 #和 30#下降幅度最大，二者差异
不显著; 6#降幅最小，与其余 3 个品种差异显著。
因为 CoQ10 在高等植物中作为线粒体呼吸链的主
要组成成分，并在电子传递过程中起着重要作用，
因此，蛋白毒素使 CoQ10 含量下降说明杂交竹受
侵染后电子传递能力降低，但抗病品种受影响相
比感病品种小，自我保护和恢复生物膜结构功能
321
林 业 科 学 50 卷
相对要强。
图 5 蛋白毒素对杂交竹嫩枝线粒体 CoQ10 含量的影响
Fig． 5 Effect of protein toxin on the CoQ10 content in
mitochondria from shoots of different
B． pervaiabilis × D． grandis varieties
2. 5. 3 蛋白毒素对线粒体脂质过氧化水平的影响
毒素处理杂交竹嫩枝线粒体后，4 个品种的 MDA 含
量显著高于各自对照(图 6)。MDA 是脂质过氧化
作用的产物，其含量可反映脂质过氧化的强弱。从
图 6 可以看出，感病品种 8#和 30#MDA 含量分别为
对照的 2. 3 和 2. 2 倍，说明在毒素胁迫下线粒体膜
脂过氧过氧化程度增加，但抗病品种 2 种指标增长
程度相对较小。
图 6 蛋白毒素对杂交竹嫩枝线粒体 MDA 含量的影响
Fig． 6 Effect of protein toxin on the MDA content in mitochondria
from the shoots of different B． pervaiabilis × D． grandis varieties
2. 5. 4 蛋白毒素对线粒体 ATPase 活性的影响 蛋
白毒素处理杂交竹嫩枝线粒体后，4 个品种线粒体
内的 Ca2 + － ATPase 和 Mg2 + － ATPase 活性均显著
下降(表 3)。感病品种 8 #只有对照的 60. 71% 和
58. 66%，而抗病品种这两种酶的活性下降程度相对
较低; 6 # 2 种酶活性分别为对照的 85. 89% 和
87. 85%，且活性显著高于其余 3 个品种。因为
ATPase 与植物体内能量代谢相偶联，因此与呼吸作
用密切相关。6#杂交竹嫩枝线粒体被蛋白毒素侵染
后 ATPase 活性降幅最小，说明该品种体内能量代谢
功能相对较强，呼吸作用亦较强。
表 3 蛋白毒素对杂交竹嫩枝线粒体 ATPase 活性的影响
Tab. 3 Effect of protein toxin on ATPase activity of the
mitochondria of B． pervaiabilis × D． grandis varieties shoots
处理
Treatment
Ca2 + － ATPase Mg2 + － ATPase
活性 Activity /
(μmol·
mg － 1 h － 1
百分比
Percent
(% )
活性 Activity /
(μmol·
mg － 1 h － 1
百分比
Percent
(% )
CK － 3 52. 28 ± 0. 98a 100 40. 32 ± 1. 21a 100
3# 41. 32 ± 2. 45c 79. 04 32. 26 ± 1. 46c 80. 01
CK － 6 52. 67 ± 0. 79a 100 40. 75 ± 1. 07a 100
6# 45. 24 ± 2. 56b 85. 89 35. 80 ± 1. 27b 87. 85
CK － 8 51. 97 ± 1. 01a 100 39. 94 ± 0. 99a 100
8# 31. 55 ± 1. 27d 60. 71 23. 43 ± 1. 34d 58. 66
CK － 30 52. 11 ± 1. 12a 100 40. 15 ± 1. 01a 100
30# 32. 79 ± 1. 33d 62. 92 24. 11 ± 1. 10d 60. 05
①同列不同数据后的小写字母表示在 P ＜ 0. 05 水平上差异显著
(LSD 测验)。Data in the same column followed by different lowercase
letters indicate significant differences by the LSD test (P ＜0. 05) ．
3 结论与讨论
线粒体是植物体内重要的细胞器，是进行三羧
酸循环( tricarboxylic acid cycle，TCA)、脂肪酸氧化、
电子传递、氧化磷酸化的重要部位 (钱琼秋等，
2006b); 同时，线粒体也是氧自由基产生的主要部
位，但其本身又极易受氧自由基的损伤。众所周知，
毒素对寄主植物细胞可造成明显的损伤，且膜系统
最易受伤害(张云霞等，2011)。在诸如水分、盐以
及金属的胁迫等逆境下，寄主植物线粒体呼吸作用
会产生过剩自由基，会使线粒体膜流动性下降、选择
性丧失，由此可见线粒体是极易受膜脂过氧化伤害
的重要部位之一(钱琼秋等，2006a; 2006b)。本试
验首先从杂交竹嫩枝线粒体膜生物物理特性角度来
研究梢枯病菌蛋白毒素的作用机制，从结果看，蛋白
毒素胁迫使线粒体膜流动性减弱、表面电位减小、肿
胀度增大、聚集度降低，说明膜结构遭到显著影响，
质子泵功能被减弱，脂质体颗粒不能聚集。结合陈
靠山等(1995)和钱琼秋等(2006b)的报道，该蛋白
毒素可能引起了线粒体脂双层膜系统完整性的破坏
以及结构的受损，从而进一步影响膜上孔道的开放
程度，氧化磷酸化解偶联，一系列膜功能发生障碍。
另一方面，本试验还从线粒体呼吸作用及膜脂
质过氧化角度来进一步诠释蛋白毒素对线粒体的作
用机制。呼吸控制率 (ＲCＲ)和磷氧比 ( P /O)既能
反映线粒体氧化磷酸化机能，也能表明线粒体结构
的完整性程度(钱琼秋等，2006b); 细胞色素 c 氧
化酶(CCO)作为线粒体的标志酶，其活力的发挥是
维持线粒体功能、进行细胞能量代谢的关键 (王苏
华等，2010); 辅酶 Q10(CoQ10)是线粒体呼吸链的
主要组成成分，具有保护和恢复膜完整性的重要作
421
第 8 期 李姝江等: 梢枯病菌蛋白毒素对杂交竹线粒体结构和功能的影响
用(Franke et al．，2013); MDA 含量可以反映脂质过
氧化的强弱; ATP 酶(ATPase)被称作是能量转化的
分子马达(郑燕等，2007)。本研究结果表明，蛋白
毒素使线粒体的 CoQ10 含量下降，脂质过氧化产物
MDA 含量的增加，CCO、ATPase 活性亦下降，呼吸控
制率(ＲCＲ)和磷氧比(P /O)明显降低，说明蛋白毒
素使线粒体的氧化功能发生了障碍，供磷酸化以生
成 ATP 的能量产生受到了影响，以致 ATP 生成减
少，导致了线粒体呼吸作用功能的降低。结合上述
线粒体膜生物物理特性结果，可能是由于蛋白毒素
胁迫使线粒体内的脂质过氧化产物 MDA 含量的增
加，引起线粒体膜流动性下降，膜表面电位、膜完整
性破坏，致使 ATP 酶活性下降。蛋白毒素对杂交竹
线粒体一系列特性及功能的影响与其对杂交竹生理
代谢影响之间的相关性需进一步研究。研究还发
现，杂交竹抗病品种各项指标均比感病品种受蛋白
毒素的影响小，线粒体完整性及功能维持相对较好，
是否符合 Miller 等(1986)的“第三类抗性”假说，即
抗病品种具有降解毒素的能力还有待更全面准确的
验证。
参 考 文 献
陈靠山，刘世名，周 燮 ． 1995． 脱落酸对植物线粒体膜生物物理特
性的影响 ． 生物物理学报，11(3) : 314 － 318．
李 赤，黎永坚，于 莉 ． 2011． 香蕉枯萎病菌毒素对香蕉叶片超微
结构的影响 ． 吉林农业大学学报，33(2) : 158 － 164．
李姝江，朱天辉 ． 2012a． 杂交竹梢枯病菌毒素蛋白纯化及致病力 ．
林业科学，48(11) : 144 － 149．
李姝江，朱天辉 ． 2012b． 杂交竹梢枯病菌毒素蛋白的质膜结合位
点 ． 浙江大学学报:农业与生命科学版，38(4) : 355 － 361．
钱琼秋，宰文姗，何 勇，等 ． 2006a． 外源硅和辅酶 Q10 对盐胁迫下
黄瓜根系线粒体的保护作用 ． 中国农业科学，39 (6 ) : 1208 －
1214．
钱琼秋，朱祝军，何 勇 ． 2006b． 硅对盐胁迫下黄瓜根系线粒体呼
吸作用及脂质过氧化的影响 ． 植物营养与肥料学报，12 ( 6 ) :
875 － 880．
桑庄特罗 A． 1980． 植物生理学研究法 ． 北京农业大学植物生物教
研组 ．北京: 科学出版社，191 － 204．
王立安，郝丽梅，马春红，等 ． 2004． HMC 毒素对雄性不育玉米线粒
体结构和功能的影响 ． 植物病理学报，34(3) : 221 － 224．
王苏华，张 薇，邢光伟，等 ． 2010． 细胞色素 C 氧化酶活力测定方
法概况 ． 毒理学杂志，24(5) : 412 － 414．
张金林，庞民好，刘颖超，等 ． 2005． 坪草腐霉病菌毒素产生除草活
性物质的条件优化 ． 河北农业大学学报，28(4) : 84 － 88．
张云霞，范兰兰，施祖荣，等 ． 2011． 莲子草假隔链格孢毒素对空心
莲子草叶片和根尖组织超微结构的影响 ． 华中农业大学学报，
30(1) : 84 － 88．
张志鸿，刘文龙 ． 1991． 生物物理学实验 ． 上海: 复旦大学出版社，
140 － 145．
郑 燕，展 永，韩英荣，等 ． 2007． ATPase 旋转催化运动的随机跃
迁动力学研究 ． 生物学杂志，24(3) : 20 － 24．
朱天辉，黄宗超，高强章，等 ． 2009． 撑 × 绿杂交竹梢枯病病原及发
生规律研究 ． 中国森林病虫，28(2) : 10 － 12，31．
Bradford M M． 1976． A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye
binding． Analytical Biology，72(1) : 248 － 254．
Cakmak I，Marschner H． 1992． Magnesium deficiency and high light
intensity enhance activities of superoxide dismutase， ascrobate
peroxidase， and glutathione reductase in bean leaves． Plant
Physiology，98(4) : 1222 － 1227．
Franke A A，Lai J F，Morrison C M，et al． 2013． Coenzyme Q10，
carotenoid， tocopherol， and retinol levels in cord plasma from
multiethnic subjects in Hawaii． Free Ｒadical Ｒesearch，47 ( 9 ) :
757 － 768．
Halestrap A P，McStay G P， Clarke S J． 2002． The permeability
transition pore complex: another view． Biochimie， 84 ( 2 /3 ) :
153 － 166．
Ho S H，Koh L，Ma Y，et al． 1996． The oil of garlic，Allium sativum L．
(Amaryllidaceae)，as a potential grain protectant against Tribolium
castaneum ( Herbst ) and Sitophilus zeamais Motsch． Postharvest
Biology and Technology，9(1) : 41 － 48．
Miller J D， Arnison P G． 1986． Degradation of deoxynivalenol by
suspension cultures of the fusarium head blight resistant wheat
cultivar Frontana． Canadian Journal of Plant Pathology，8 ( 2 ) :
147 － 150．
Ｒasmusson A G，Mφller I M． 1991． NADP-utilizing enzymes in the
matrix of plant mitochondria． Plant Physiology，94: 1012 － 1018．
Stillwell W，Brengle B，Belcher D，et al． 1987． Comparison of effects of
ABA and IAA on phospholipid bilayers． Phytochemistry，26(12) :
3145 － 3150．
Takada M， Ikenoya S， Yuzuriha T， et al． 1984． Simultaneous
determination of reduced and oxidized ubiquinones． Methods in
Enzymology，105(2) : 147 － 155．
Zhang L T，Zhang Z S，Gao H Y，et al． 2012． The mitochondrial
alternative oxidase pathway protects the photosynthetic apparatus
against photodamage in Ｒumex K-1 leaves． BMC Plant Biology，12:
40．
(责任编辑 朱乾坤)
521