全 文 ：第 50 卷 第 8 期
2 0 1 4 年 8 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 50，No. 8
Aug．，2 0 1 4
doi:10．11707 / j．1001-7488．20140815
收稿日期: 2013 － 05 － 22; 修回日期: 2014 － 01 － 31。
基金项目: 国家自然科学基金项目(31101676) ; 东北林业大学青年拔尖人才支持计划( PYTT － 1213 － 10) ; 中央高校基本科研业务费专
项基金(DL11BA02)。
* 王志英为通讯作者。
舞毒蛾 LdOA1 基因克隆分析及对 3 种
杀虫剂胁迫的响应*
曹传旺 孙丽丽 问荣荣 豆晓洁 王志英
(东北林业大学林学院 哈尔滨 150040)
摘 要: G 蛋白偶联受体(GPCＲs)是生物体内重要膜受体，通过激活三聚体 G 蛋白参与各种细胞内信号转导，
在药物研发中具有重要的作用。从舞毒蛾无参照全转录本文库中鉴定获得 GPCＲ 家族中眼白化 I 型全长基因(命
名为 LdOA1)，该基因全长 453 bp，编码 150 个氨基酸，分子质量为 17. 54 kDa，理论等电点( pI)为 9. 76。进化树分
析表明 LdOA1 蛋白与帝王蝶的亲缘关系较近。实时荧光定量 PCＲ 分析表明舞毒蛾 3 龄幼虫在溴氰菊酯、甲萘威
和氧化乐果胁迫下 LdOA1 的表达均表现为显著抑制。
关键词: 舞毒蛾; LdOA1 基因; 杀虫剂; 基因表达
中图分类号: S718. 7 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2014)08 － 0102 － 06
Cloning and Analysis of LdOA1 in Lymantria dispar and Its Ｒesponse
to the Stress of Three Kinds of Insecticides
Cao Chuanwang Sun Lili Wen Ｒongrong Dou Xiaojie Wang Zhiying
(College of Forestry，Northeast Forestry University Harbin 150040)
Abstract: The G protein coupled receptors (GPCＲs)，known as transmembrane receptors，play an important role in
drug research and development by activating G protein involved in inside signal transduction pathways． In present study，
the full length cDNA of GPCＲ (namely LdOA1) was isolated from Lymantria dispar transcriptome． The open reading frame
(OＲF) of LdOA1 was 453 bp encoding a protein of 150 amino acid residues with the molecular mass of 17. 54 kDa and
theoretical pI of 9. 76． Phylogenetic analysis of GPCＲ proteins showed LdOA1 of L． dispar clustered into a group with
Danaus plexippus． We further investigated the expression of LdOA1 in 3 rd instar L． dispar larvae under deltamethrin，
carbaryl and omethoate stresses using real-time PCＲ． The results showed that LdOA1 in L． dispar was obviously inhibited
by deltamethrin，carbaryl and omethoate．
Key words: Lymantria dispar; LdOA1; insecticide; gene expression
舞毒蛾( Lymantria dispar)是一种世界性、周期
性发生的危害严重的森林食叶害虫，分布广，食性
杂，国外报道可取食 300 多种植物(Lazarevi et al．，
1998)，国内报道可危害杨(Populus)、柳( Salix)、苹
果 ( Malus pumila )、樟 子 松 ( Pinus sylvestris var．
mongolica)、落叶松(Larix)等 500 多种植物，几乎全
国均有分布，给林业生产造成巨大的经济损失。
目前生产上防控舞毒蛾主要是利用氯氰菊酯、
高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、氧化乐果、吡虫啉、灭幼脲
III 号等农药进行化学防治(倪鸣等，2009; 侯雅芹
等，2009)，但是化学农药容易引起害虫抗药性的形
成，并污染环境。随着分子生物学的快速发展，控制
害虫新的防治策略是运用分子靶标干预开发新杀虫
剂。理想的分子靶标是参与机体至关重要功能的基
因产物，通过调节这种靶标的活性来干扰害虫正常
的生理过程。在众多膜受体中，G 蛋白偶联受体(G
protein coupled receptors，GPCＲs)，也称为 7 跨膜域
受体 ( seven-transmembrane domain receptors，7TM
receptors)，是生物体内重要的膜受体，由一个大的
跨膜受体蛋白家族组成，通过激活三聚体 G 蛋白参
与各种细胞内信号转导 (Hill，2006)。能够链接和
激活 GPCＲs 的配体有光敏感化合物、气味、信息激
第 8 期 曹传旺等: 舞毒蛾 LdOA1 基因克隆分析及对 3 种杀虫剂胁迫的响应
素、激素和神经递质等，这些配体从小分子物质到多
肽再到大的蛋白。GPCＲ 对于一个细胞外刺激产生
胞内反应，这种特性使这类蛋白在药物研发中具有
很高的利用价值。据估计，市场上大约 50%的药物
直接或间接地利用 GPCＲ 信号 ( Klabunde et al．，
2002)。许多昆虫的发育和生理过程都是通过
GPCＲ 信号调控的，已有研究报道了光敏感化合物、
气味、信息激素、激素和神经递质等对昆虫 GPCＲ 功
能的影响 ( Broeck，2001)。眼白化病 1 型 ( ocular
albinism type 1 protein，OA1)蛋白作为一种黑素小
体膜整合性糖蛋白，具有 7 个跨膜结构，N 末端伸向
小体膜腔一侧，C 末端伸向细胞质侧，在两侧各形成
3 个环结构，N 糖基化位点在小体膜腔一侧的第一
个环上 ( d’Addio et al．，2000; 谷学英等，2009 )。
这种结构与通常位于细胞膜的 G 蛋白偶联受体非
常相似，并且在 OA1 蛋白跨膜区和环上都含有许多
GPCＲ 的保守性氨基酸，因此认为 OA1 蛋白是
GPCＲ 超家族中的一员。已有研究表明，人和小鼠
(Mus musculus)OA1 单基因突变导致黑色素生物合
成减少或完全缺乏，引起眼白化病，临床表现为眼、
皮肤、毛发黑色素 缺乏和弱视等 (谷学 英 等，
2009)。黑色素是昆虫的主导色素，在昆虫的体色
决定 过 程 中 发 挥 着 重 要 作 用 ( Wittkopp et al．，
2003)。OA1 蛋白可能也参与昆虫体内黑色素的
代谢通路，该基因的表达或突变可能引起眼和表
皮的白化现象，有关昆虫体内 OA1 基因的克隆、功
能未见报道。本文在分析舞毒蛾转录本文库的基
础上，克隆分析了 1 条舞毒蛾 GPCＲ 家族眼白化 1
型蛋白 cDNA 全长，并采用实时荧光定量 PCＲ 技
术分析了溴氰菊酯、甲萘威和氧化乐果处理对该
基因表达的影响。
1 材料与方法
1. 1 供试昆虫及处理
舞毒蛾卵块采自东北林业大学实验林场，孵化
幼虫于(25 ± 1)℃、光照 14L∶ 10D、相对湿度 75%的
条件下用新鲜的人工饲料(来源于中国林业科学院
研究森环森保研究所)饲养，取健康、大小一致的舞
毒蛾 3 龄幼虫为试虫。分别用 92. 8% 溴氰菊酯、
95. 0%甲萘威和 82. 8% 氧化乐果原药均匀加入到
人工饲料中，配制成 15 mg·L － 1浓度毒饵饲喂舞毒
蛾 3 龄幼虫，于 6，12，24，48，72 h 时间点挑取活泼
的幼虫，液氮冷冻后保存于 － 80 ℃用于实时荧光定
量 PCＲ 分析，每个处理重复 3 次，每次重复 10 头
幼虫。
1. 2 LdOA1 基因克隆与分析
随机选用活泼、健康、大小一致舞毒蛾 1 ～ 6 龄
幼虫各 10 头，采用 ＲNeasy Mini 动物组织总 ＲNA 提
取试剂盒(Qiagen)提取 ＲNA，然后将各龄幼虫提取
的 ＲNA 等比例混匀，20 μg 总 ＲNA 用于转录组文
库构建，建好的测序文库用 Illumina HiSeqTM 2000 进
行测序(深圳华大基因科技有限公司)。测序结果
经 de novo 组装和 TGICL 软件拼接后共获得23 975
个非冗余单一基因 ( non-redundant unigenes)，对这
些 Unigenes 进行 BLASTX 和 BLASTN 分析。对测序
拼接后的结果用“G Protein Coupled Ｒeceptors”作为
关键词进行查找，对查找后的序列进行比对拼接，最
终获得 LdOA1 基因进行进一步的分析。设计引物
进行 PCＲ，进一步测序确定所获得的 LdOA1 基因序
列。用 OＲF founder ( http:∥ www． ncbi． nlm． nih．
gov / gorf． html)程序确定其开放读码框，用 ProtParam
(http:∥ au． expasy． org / tools / protparam． html)软件
计算推导的蛋白质分子质量及理论等电点，利用
SignlP3. 0 Server (http:∥www． cbs． dtu． dk / services /
SignalP) 检测 其有无 信 号 肽 序 列，用 NCBI 的
Conserved Domains 程序(http:∥www． ncbi． nlm． nih．
gov / Structure / cdd /wrpsb． cgi) 预测蛋白的保守区。
利用 Blast 程序 ( http:∥ www． ncbi． nlm． nih． gov /
BLAST /)进行序列同源性搜索，选择与其相似程度
高的其他不同昆虫的 GPCＲ 蛋白氨基酸序列，用多
序列联配程序 Clustalx(1. 83)进行多序列比对。应
用 Clustalx ( 1. 83 ) 和 MEGA ( 5. 1 )，采用邻接法
(Neighbor-Joining，N-J)构建系统发育树。
1. 3 实时荧光定量 PCＲ
采用 ＲNeasy Mini 动物组织总 ＲNA 提取试剂盒
(Qiagen)提取对照(非杀虫剂处理)、15 mg·L － 1溴氰菊
酯、甲萘威和氧化乐果分别处理 6，12，24，48 和 72 h 后
的舞毒蛾 3 龄幼虫的总 ＲNA，经 DNase I(Promega)消
化 除 去 DNA，采 用 PrimeScriptTM ＲT reagent Kit
(TaKaＲa)合成 cDNA，将合成 cDNA 稀释成 100 μL，用
作实时荧光定量 PCＲ 模板。实时荧光定量 PCＲ 使用
试 剂 盒 SYBＲ Green Ｒealtime PCＲ Master Mix
(Toyobo)。内参基因为 Actin，EF1α 和 TUB，引物序列
见表 1。实时荧光定量 PCＲ 反应体系为: 10 μL 2 ×
SYBＲ premix Ex Taq 酶，正向和反向引物(10 μmol·
L － 1)各 1，2 μL稀释后 cDNA模板，加去离子水补足 20
μL。实时荧光定量 PCＲ 反应条件为: 94 ℃预变性
30 s，94 ℃变性 12 s，60 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 45 s，
81 ℃读板 1 s，45 个循环，每个样品重复 3 次，用 2 －△△Ct
方法进行基因的相对定量分析(Pfaffl et al．，2002)。
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林 业 科 学 50 卷
表 1 实时荧光定量 PCＲ 引物序列
Tab． 1 Primer sequences of real-time PCＲ
基因 Gene 正向引物序列 Forward primer sequences(5 － 3) 反向引物序列 Ｒeverse primer sequences(5 － 3)
LdOA1 GTTCTATCTTTGCTGGTTGCCG ATTGTAGCCTCGTGGGTTCTGA
Actin AGAAGCACTTGCGGTGGACAAT ACCTGTACGCCAACACTGTCAT
EF1α TTTGCCTTCCTTGCGCTCAACA TGTAAAGCAGCTGATCGTGGGT
TUB AATGCAAGAAAGCCTTGCGCCT ATGAAGGAGGTCGACGAGCAAA
2 结果与分析
2. 1 LdOA1 基因 cDNA 全长获得及序列分析
通过对舞毒蛾幼虫转录组数据的分析，获得了
OA1 基因的全长 cDNA 序列，该基因阅读框(OＲF)
长 453 bp，编码 150 个氨基酸(图 1)。ProtParam 预
测编码蛋白的分子质量为 17. 54 kDa，理论等电点
(pI)为 9. 76，此蛋白为一碱性蛋白。该蛋白中相对
含量最多的氨基酸是亮氨酸 Leu(19 个，占总氨基
酸数 12. 7% )，其次是丝氨酸 Ser(12 个，占总氨基
酸数 8. 0% )。信号肽预测结果表明，该基因不含信
号肽序列。BlASTP 对 LdOA1 蛋白保守区的预测结
果表明，该蛋白属于 GPCＲ 家族中眼白化病 1 型蛋
白(图 2)。
图 1 舞毒蛾 LdOA1 基因的 cDNA 及由此推导的氨基酸序列
Fig． 1 The cDNA and deduced amino acid sequence of LdOA1 in L． dispar
图 2 LdOA1 蛋白氨基酸序列保守区预测
Fig． 2 Conserved region predication of amino acid sequences of LdOA1 protein in L． dispar
401
第 8 期 曹传旺等: 舞毒蛾 LdOA1 基因克隆分析及对 3 种杀虫剂胁迫的响应
图 3 9 种昆虫 GPCＲ 蛋白多序列比对
Fig． 3 Multiple sequence alignment of GPCＲ proteins from 9 insects
印度跳蚁 Harpegnathos saltator(EFN82229. 1)，切叶蚁 Acromyrmex echinatior (EGI67170. 1)，熊蜂 Bombus impatiens(XP_003489203. 1)，欧洲熊
蜂 Bombus terrestris(XP_003395851. 1 )，苜蓿切叶蜂 Megachile rotundata ( XP_003707340. 1 )，蜜蜂 Apis mellifera ( XP_394576. 3 )，金小蜂
Nasonia vitripennis (XP_003428050. 1)，舞毒蛾 Lymantria dispar，帝王蝶 Danaus plexippus(EHJ67128. 1) ．
通过 BLASTP 多序列比对，选择与舞毒蛾 LdOA1
蛋白序列相似程度高的 8 种其他昆虫的 GPCＲ 蛋白进
行多序列比对，结果表明: LdOA1 蛋白与其他昆虫
GPCＲ蛋白的氨基酸序列同源性为 37. 33% ～ 69. 33%
(图 3)。从构建的 9 种昆虫的 GPCＲ 基因的系统进化
树表明，9 种昆虫 GPCＲ 蛋白分为 2 类，其中舞毒蛾
501
林 业 科 学 50 卷
LdOA1蛋白与帝王蝶 GPCＲ 亲缘关系近而聚为一类， 其他 7 种昆虫的亲缘关系较近而聚为另一类(图 4)。
图 4 9 种昆虫 GPCＲ 蛋白系统进化树
Fig． 4 Phylogenetic analysis of GPCＲ proteins from 9 insects
2. 2 农药胁迫对 LdOA1 基因表达量的影响
为了研究杀虫剂对 LdOA1 基因表达的影响，采
用实时荧光定量 PCＲ 技术分析了溴氰菊酯、甲萘威
和氧化乐果不同处理时间舞毒蛾 3 龄幼虫 LdOA1
基因表达量的变化情况(图 5)。结果表明，3 种杀
虫剂处理下舞毒蛾 LdOA1 基因主要表现为下调表
达，尤其是氧化乐果处理后所有研究的时间点基因
表达均表现为抑制。但 3 种杀虫剂处理后，舞毒蛾
LdOA1 基因表达受抑制程度不同。溴氰菊酯处理早
期( 6 h) LdOA1 基因表达达到最低，仅为对照的
0. 45% ; 甲萘威处理 24 h LdOA1 基因表达达到最
低，为对照的 3. 54% ; 氧化乐果处理 48 h LdOA1 基
因表达达到最低，为对照的 6. 74%。
图 5 3 种杀虫剂胁迫对舞毒蛾 LdOA1 基因表达量的影响
Fig． 5 Analysis of LdOA1 gene expression in L． dispar under the stress of three kinds of insecticides
表达量进行了 log2 转化。The relative expression levels were log2 transformed．
3 结论与讨论
昆虫果蝇(Drosophila melanogaster)和冈比亚按
蚊 ( Anopheles gambiae ) 基因组中 ( Adams et al．，
2000; Holt et al．，2002)，GPCＲs 参与了大约 1% 果
蝇和 1. 6%冈比亚按蚊蛋白质的重要功能(如视力、
化学感受途径和激素系统) (Brody et al．，2000; Hill
et al，2002)。在昆虫 GPCＲs 中，神经肽受体、生物
胺受体和化学感受受体因参与了昆虫广泛的生理过
程而受到关注。胺类在神经系统中起到重要的作
用，参与感受信息的传递和组装，控制肌肉的和腺体
的活性和一些诸如学习、记忆和行为等的复杂过程。
目前，胺类受体是昆虫 GPCＲs 中研究最全面的家族
(Zhou et al．，2008)。研究发现，沙漠蝗( Schistocerca
601
第 8 期 曹传旺等: 舞毒蛾 LdOA1 基因克隆分析及对 3 种杀虫剂胁迫的响应
gregaria ) 存在 2 个章鱼胺受体基因 ( SgOctαＲ，
SgOctβＲ)，且 SgOctαＲ 在中央神经系统中转录水平
最高，而 SgOctβＲ 在飞行肌中具有最高转录水平
(Verlinden et al．，2010 )。Mitri 等 ( 2009 ) 研究发
现，果蝇孤儿 GPCＲs DmX 受体能够通过味觉感知
到植物有毒次生物质 L-canavanine，使果蝇产生驱避
作用从而免受毒害。这些研究主要集中于 GPCＲs
基因参与昆虫神经生理的作用，而有关对化学杀虫
剂响应的研究甚少，仅有 Hu 等(2007)研究报道，来
源于淡色库蚊(Culex pipiens pallens)的 GPCＲs 家族
中 opsin 基因 NYD-OP7 在溴氰菊酯抗性和敏感品系
各发育阶段均有表达，且在蛹和成虫期抗性品系
NYD-OP7 表达高于敏感，昆虫 C6 /36 细胞系表达
NYD-OP7 证实该基因参与溴氰菊酯抗性形成。
为了探讨昆虫 GPCＲs 成为杀虫剂新作用靶标
的可能性，本文从林果重要害虫舞毒蛾转录组中克
隆到 GPCＲ 家族中眼白化 1 型蛋白，进化树分析与
帝王蝶 GPCＲ 蛋白关系较近，这可能与该昆虫同属
鳞翅目有关。OA1 蛋白作为一种 GPCＲ 蛋白可与 G
蛋白之间发生特殊的反应，而其突变基因的产物，这
种反应能力则降低甚至消失。Schiaffino 等(1999)
研究表明 OA1 蛋白可能是黑素小体内某种未知配
体的感受器，通过激活位于小体膜细胞质侧的异源
三聚体 G 蛋白，进行信息的传导，从而调节黑素小
体的生长与成熟。本项研究中发现舞毒蛾 LdOA1
基因能够对拟除虫菊酯类溴氰菊酯、氨基甲酸酯类
甲萘威和有机磷类氧化乐果杀虫剂作出响应，均被
3 种杀虫剂抑制，这可能是由于杀虫剂作为配体与
膜蛋白舞毒蛾 OA1 结合，引起 OA1 结构的改变影
响舞毒蛾黑素小体内 G 蛋白激活而信息传导受阻。
但有关农药胁迫是否导致 OA1 基因突变有待进一
步的研究。
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(责任编辑 朱乾坤)
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