全 文 ：第 源愿 卷 第 怨 期
圆 园 员 圆 年 怨 月
林 业 科 学
杂悦陨耘晕栽陨粤 杂陨蕴灾粤耘 杂陨晕陨悦粤耘 灾燥造郾 源愿袁晕燥郾 怨杂藻责援 袁圆 园 员 圆
收稿日期院 圆园员圆 原 园圆 原 园怨曰 修回日期院 圆园员圆 原 园猿 原 圆愿遥
基金项目院 林业公益性行业科研专项经费重大项目渊圆园员园园源园园源冤曰 国家高技术研究发展计划野愿远猿冶计划渊圆园员员粤粤员园园圆园员冤遥
鄢杨敏生为通讯作者遥
苑源员杨双 月贼基因的遗传转化及转基因株系的抗虫性鄢
王桂英员袁 圆 摇 杨敏生员 摇 霍雪梅员 摇 王艳平员 摇 李珊珊员
渊员援 河北农业大学林学院林业生物实验室摇 保定 园苑员园园员曰 圆援 廊坊市农林科学院摇 廊坊 园远缘园园园冤
摘摇 要院 摇 以含有 悦则赠猿粤葬基因的重组质粒 责月悦悦猿 为基础袁利用 孕悦砸和 阅晕粤重组技术袁从 责月悦悦猿 中克隆出抗虫基
因 悦则赠猿粤葬袁将其正向插入载体 责悦粤酝月陨粤员猿园缘 的 悦葬酝灾猿缘杂启动子和 晕韵杂终止子之间袁构建成 责悦粤酝月陨粤员猿园缘鄄悦则赠猿粤葬
植物表达载体袁并导入根癌农杆菌 耘匀粤员园缘遥 采用农杆菌介导的遗传转化法袁将 悦则赠猿粤葬基因转入已转 悦则赠员粤糟 垣 粤孕陨
基因的 苑源员 毛白杨无性系 责月圆怨 中袁获得转双 月贼基因的 苑源员 杨遥 在含潮霉素的培养基中进行多次继代筛选袁获得抗
性稳定的无性系 怨 个袁编号为 责悦悦粤员要责悦悦粤怨遥 采用特异引物分别对转基因植株进行 孕悦砸 检测袁结果显示 悦则赠员粤糟
基因稳定存在于 责月圆怨 中袁悦则赠猿粤葬基因已整合到各无性系的基因组 阅晕粤 中遥 耘蕴陨杂粤 毒蛋白检测袁转基因株系都有
悦则赠员粤糟和 悦则赠猿粤葬杀虫蛋白表达遥 用转基因植株叶片进行柳蓝叶甲渊鞘翅目冤和美国白蛾渊鳞翅目冤室内饲虫试验结
果表明袁转基因植株具有双抗性遥 根据对测试昆虫的致死率划分高中低 猿 个抗性水平袁其中 责悦悦粤圆袁责悦悦粤缘袁
责悦悦粤远袁责悦悦粤怨 具有双高抗曰 责悦悦粤猿袁责悦悦粤源 和 责悦悦粤苑 对柳蓝叶甲表现出中尧低抗性袁对美国白蛾则高抗曰 而 责悦悦粤员
表现对美国白蛾的极低抗性袁对柳蓝叶甲则高抗遥
关键词院 摇 载体构建曰 悦则赠员粤糟基因曰 悦则赠猿粤葬基因曰 双 月贼 苑源员 杨曰 抗虫性
中图分类号院 杂苑员愿郾 源远曰 杂苑圆圆郾 猿 垣 远摇 摇 摇 文献标识码院 粤摇 摇 摇 文章编号院 员园园员 原 苑源愿愿渊圆园员圆冤园怨 原 园园源圆 原 园愿
栽则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 燥枣 苑源员 孕燥责造葬则 憎蚤贼澡 阅燥怎遭造藻 月贼 郧藻灶藻泽 葬灶凿 贼澡藻 陨灶泽藻糟贼鄄砸藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 燥枣 贼澡藻
栽则葬灶泽早藻灶蚤糟 孕造葬灶贼
宰葬灶早 郧怎蚤赠蚤灶早员袁 圆 摇 再葬灶早 酝蚤灶泽澡藻灶早员 摇 匀怎燥 载怎藻皂藻蚤员 摇 宰葬灶早 再葬灶责蚤灶早员 摇 蕴蚤 杂澡葬灶泽澡葬灶员
渊员援 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠 燥枣 匀藻遭藻蚤摇 月葬燥凿蚤灶早 园苑员园园员曰
圆援 蕴葬灶早枣葬灶早 粤糟葬凿藻皂赠 燥枣 粤早则蚤糟怎造贼怎则藻 葬灶凿 云燥则藻泽贼则赠 杂糟蚤藻灶糟藻泽摇 蕴葬灶早枣葬灶早 园远缘园园园冤
粤遭泽贼则葬糟贼院 摇 陨灶 贼澡蚤泽 泽贼怎凿赠袁 责造葬泽皂蚤凿 责月悦悦猿 憎蚤贼澡 悦则赠猿粤葬 早藻灶藻 憎葬泽 怎泽藻凿援 粤 悦则赠猿粤葬 早藻灶藻 憎葬泽 糟造燥灶藻凿 葬灶凿 蚤灶泽藻则贼藻凿 蚤灶贼燥 贼澡藻
皂蚤凿凿造藻 燥枣 悦葬酝灾猿缘杂 责则燥皂燥贼藻则 葬灶凿 晕韵杂 贼藻则皂蚤灶葬贼燥则 燥枣 责悦粤酝月陨粤员猿园缘 遭赠 怎泽蚤灶早 孕悦砸 葬灶凿 阅晕粤 则藻糟燥皂遭蚤灶葬贼蚤燥灶 贼藻糟澡灶燥造燥早赠袁
葬灶凿 蚤灶泽藻则贼藻凿 蚤灶贼燥 贼澡藻 责悦粤酝月陨粤员猿园缘鄄悦则赠猿粤葬 责造葬灶贼 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 增藻糟贼燥则援 栽澡蚤泽 增藻糟贼燥则 憎葬泽 蚤灶贼则燥凿怎糟藻凿 蚤灶贼燥 粤早则燥遭葬糟贼藻则蚤怎皂
贼怎皂藻枣葬糟蚤藻灶泽 耘匀粤员园缘援 栽澡则燥怎早澡 粤早则燥遭葬糟贼藻则蚤怎皂鄄皂藻凿蚤葬贼藻凿 贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶袁 贼澡藻 贼葬则早藻贼 悦则赠猿粤葬 早藻灶藻 憎葬泽 贼则葬灶泽枣藻则则藻凿 蚤灶贼燥 贼澡藻
早藻灶燥皂藻 燥枣 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责燥责造葬则 责月圆怨 渊 澡赠遭则蚤凿 苑源员 造蚤灶藻 藻曾责则藻泽泽蚤灶早 悦则赠陨粤糟 垣 粤孕陨 早藻灶藻 冤援 晕蚤灶藻 则藻早藻灶藻则葬贼藻凿 造蚤灶藻泽 憎蚤贼澡
澡赠早则燥皂赠糟蚤灶 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 憎藻则藻 燥遭贼葬蚤灶藻凿 葬灶凿 灶葬皂藻凿 责悦悦粤员 原 责悦悦粤怨援 栽澡藻 责则藻泽藻灶糟藻 葬灶凿 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 悦则赠员粤糟 早藻灶藻 葬灶凿
悦则赠猿粤葬 早藻灶藻 澡葬增藻 遭藻藻灶 增藻则蚤枣蚤藻凿 怎泽蚤灶早 孕悦砸 葬灶凿 耘蕴陨杂粤 葬灶葬造赠泽蚤泽援 栽燥曾蚤糟蚤贼赠 藻增葬造怎葬贼蚤燥灶 燥灶 孕造葬早蚤燥凿藻则葬 增藻则泽蚤糟燥造燥则葬
渊悦燥造藻燥责贼藻则葬冤 葬灶凿 匀赠责澡葬灶贼则蚤葬 糟怎灶藻葬 渊 蕴藻责蚤凿燥责贼藻则葬冤 遭赠 枣藻藻凿蚤灶早 枣则藻泽澡 凿藻贼葬糟澡藻凿 造藻葬增藻泽 泽澡燥憎藻凿 凿燥怎遭造藻 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻援 栽澡藻
凿藻造藻贼藻则蚤燥怎泽 葬遭蚤造蚤贼赠 憎葬泽 糟造葬泽泽蚤枣蚤藻凿 蚤灶贼燥 贼澡则藻藻 早则燥怎责泽 憎蚤贼澡 澡蚤早澡袁 皂藻凿蚤怎皂 葬灶凿 造燥憎 造藻增藻造 葬糟糟燥则凿蚤灶早 贼燥 皂燥则贼葬造蚤贼赠援 栽燥曾蚤糟蚤贼赠 燥枣
责悦悦粤圆袁 责悦悦粤缘袁 责悦悦粤远 葬灶凿 责悦悦粤怨 泽澡燥憎藻凿 澡蚤早澡 造藻增藻造 贼燥 遭燥贼澡 孕援 增藻则泽蚤糟燥造燥则葬 葬灶凿 匀援 糟怎灶藻葬曰 责悦悦粤猿袁 责悦悦粤源 葬灶凿 责悦悦粤苑
泽澡燥憎藻凿 皂藻凿蚤怎皂 燥则 造燥憎 贼燥曾蚤糟蚤贼赠 贼燥 孕援 增藻则泽蚤糟燥造燥则葬袁遭怎贼 澡蚤早澡 贼燥 匀援 糟怎灶藻葬曰 憎澡蚤造藻 责悦悦粤员 泽澡燥憎藻凿 藻曾贼则藻皂藻造赠 造燥憎 贼燥曾蚤糟蚤贼赠 贼燥 匀援
糟怎灶藻葬袁 遭怎贼 澡蚤早澡 贼燥 孕援 增藻则泽蚤糟燥造燥则葬援
运藻赠 憎燥则凿泽院 摇 增藻糟贼燥则 糟燥灶泽贼则怎糟贼蚤燥灶曰 悦则赠员粤糟 早藻灶藻曰 悦则赠猿粤葬 早藻灶藻曰 凿燥怎遭造藻 月贼 苑源员 责燥责造葬则曰 蚤灶泽藻糟贼鄄则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻
摇 摇 植物基因工程为通过插入抗虫基因并表达毒蛋
白创造抗虫植物提供了机会渊允燥怎葬灶蚤灶 藻贼 葬造援袁 员怨怨愿冤袁
自 员怨愿苑 年比利时植物遗传公司的 灾葬藻糟噪 等渊员怨愿苑冤
首次将苏云金芽孢杆菌渊月葬糟蚤造造怎泽 贼澡怎则蚤灶早蚤藻灶泽蚤泽袁月贼冤毒
蛋白基因导入烟草渊晕蚤糟燥贼蚤葬灶葬 贼葬遭葬糟怎皂冤中表现出对
一龄烟草天蛾幼虫的抗性之后袁抗虫转基因研究引
发了人们极大的兴趣遥 在众多杀虫蛋白中袁被广泛
接受的是 月贼毒蛋白袁同化学杀虫剂相比其更具有环
摇 第 怨 期 王桂英等院 苑源员 杨双 月贼基因的遗传转化及转基因株系的抗虫性
境安全性渊月藻贼扎 藻贼 葬造援袁 圆园园园冤遥 因此袁尽管目前转基
因生物体对环境的风险仍存争论袁月贼 植物仍然是一
种有前途的化学杀虫剂的替代品并继续得到发展
渊匀葬蚤造泽袁 圆园园园冤遥月贼基因已经被广泛地用于多种植物
的遗传转化袁用来控制鳞翅目渊蕴藻责蚤凿燥责贼藻则葬冤尧双翅目
渊阅蚤责贼藻则葬冤和鞘翅目渊悦燥造藻燥责贼藻则葬冤的害虫遥
近年来人们在 月贼基因的修饰与改造尧表达载体
的构建尧植物组织转化尧抗虫植物的培育等方面做了
大量工作渊郧佴灶蚤泽泽藻造 藻贼 葬造援袁 圆园园猿曰 王继磊等袁 圆园员园冤遥
随着 月贼作物的大面积种植袁有关目标昆虫产生抗性
的报道也引起了人们的重视渊月葬贼藻泽 藻贼 葬造援袁 圆园园缘曰 蕴蚤
藻贼 葬造援袁 圆园园苑曰 蕴蚤怎 藻贼 葬造援袁 圆园园怨冤遥 第 员 代的抗虫植物
只是将单一的 月贼基因转入植物中表达袁昆虫产生抗
性的风险较高渊悦澡则蚤泽贼燥怎 藻贼 葬造援袁 圆园园远冤遥 由于来源不
同的抗虫基因各有其类型尧杀虫机制及抗虫谱袁因此
第 圆 代尧第 猿 代研究则尝试联合使用 圆 种或 圆 种以
上的杀虫机制不同或特异性结合位点不同的抗虫基
因转化植物渊郧葬贼藻澡燥怎泽藻袁 圆园园愿冤袁采用共转化尧二次转
化尧杂交及构建双价或多价表达载体等方法获得双
抗或多抗袁发挥多基因的累加效应遥 如 月贼 基因
渊月贼悦则赠员粤 或 月贼悦则赠猿粤冤与各类蛋白酶抑制剂基因
渊 悦责栽陨袁 孕陨袁 粤孕陨 或 韵悦鄄陨 冤 联 合袁 转 化 棉 花
渊郧燥泽泽赠责蚤怎皂冤尧欧洲黑杨 渊 孕燥责怎造怎泽 灶蚤早则葬 冤尧 苑源员 杨
喳咱孕燥责怎造怎泽 葬造遭葬 伊 渊孕援 凿葬增蚤凿蚤葬灶葬 垣 孕援 泽蚤皂燥灶蚤蚤冤暂 伊
孕援 贼燥皂藻灶贼燥泽葬札尧银腺杨渊孕援 葬造遭葬 伊 孕援 早造葬灶凿怎造燥泽葬冤及
三倍体毛白杨 渊 孕援 贼燥皂藻灶贼燥泽葬冤 渊郭三堆等袁 员怨怨怨曰
郧怎燥 藻贼 葬造援袁 圆园园猿曰李明亮等袁 圆园园园曰田颖川等袁 圆园园园曰
张冰玉等袁 圆园园缘曰 杨敏生等袁 圆园园远冤遥 在同时表达 圆
个 月贼 基因的研究上袁杂葬糟澡泽 等渊员怨怨愿冤将分别含有
悦则赠员粤遭和 悦则赠员粤糟的棉花进行杂交袁 得到了同时含 圆
种 月贼毒蛋白的棉花袁 从而提高了抗虫性遥 还有将
悦则赠员粤遭和 悦则赠员粤糟构建成融合蛋白基因转入杂交水
稻渊韵则赠扎葬 泽葬贼蚤增葬冤的报道渊栽怎 藻贼 葬造援袁 圆园园园冤遥 本实验
室已获得了同时表达 月贼悦则赠员粤糟 基因和慈姑蛋白酶
抑制剂基因 粤孕陨的 苑源员 杨株系渊田颖川等袁 圆园园园曰 郑
钧宝等袁 圆园园园冤袁对鳞翅目害虫表现出了专一毒杀特
性遥 为扩大其抗虫谱袁获得对鳞翅目和鞘翅目害虫
兼具抗性的 苑源员 杨植株袁本研究拟通过构建含
月贼悦则赠猿粤葬基因的植物表达载体袁采用根癌农杆菌
渊粤早则燥遭葬糟贼藻则蚤怎皂 贼怎皂藻枣葬糟蚤藻灶泽冤介导的二次转化法袁再将
月贼悦则赠猿粤葬基因导入袁获得同时表达 悦则赠员粤糟 垣 粤孕陨 和
悦则赠猿粤葬基因的 苑源员 杨遥 使昆虫难以同时对 圆 种以
上抗虫物质产生抗性袁从而缓和抗性风险袁提高转基
因杨树的抗虫能力遥
员摇 材料与方法
员郾 员摇 材料
员郾 员郾 员 摇 植物材料 摇 普通杂种 苑源员 杨及已转入
月贼悦则赠员粤糟 垣 粤孕陨 基因的 苑源员 株系 责月圆怨遥 以上材料均
为本实验室保存遥 诱导叶片分化培养基为 酝杂 垣
远鄄月粤员郾 园 皂早窑蕴 原员 垣 晕粤粤园郾 员 皂早窑蕴 原员袁生根培养基为
员 辕 圆 酝杂 垣 陨月粤园郾 猿 皂早窑蕴 原员遥 农杆菌为 再耘月 培养基袁
大肠杆菌渊耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤 冤为 蕴月培养基遥
员郾 员郾 圆摇 菌种尧质粒尧酶和生化试剂摇 根癌农杆菌菌
株 蕴月粤源源园源曰 真核表达载体 责悦粤酝月陨粤员猿园缘袁 栽鄄
阅晕粤区携带有 悦葬酝灾猿缘杂启动子尧晕韵杂 终止子及潮
霉素磷酸转移酶基因渊澡责贼冤筛选标记曰 质粒 责月悦悦猿
渊悦则赠猿粤葬 辕 责月悦悦猿 辕 阅匀缘琢冤遥 以上均为本实验室保
存遥 大肠杆菌 阅匀缘琢 空菌株尧克隆载体 责哉悦皂鄄栽 质
粒和 栽源 阅晕粤 连接酶购自上海生物工程公司渊杂葬灶早燥灶冤遥 限制性内切酶 晕糟燥玉辕 月泽贼耘域尧栽葬择 阅晕粤
聚合酶尧砸晕葬泽藻 粤尧阅蕴圆园园园 核酸分子量标样和 阅晕粤
胶回收试剂盒 渊 哉晕陨匝鄄员园 悦燥造怎皂灶 运蚤贼冤等均购于
栽葬运葬砸葬 公司遥 耘蕴陨杂粤 蛋白检测试剂盒购自美国
粤早凿蚤葬公司遥 潮霉素渊匀赠早冤尧卡那霉素渊运葬灶冤尧抑菌
剂头孢噻腭钠渊悦栽载冤等其余常规药品均为进口或
国产分析纯级遥
员郾 员郾 猿摇 孕悦砸检测引物摇 检测 悦则赠员粤糟基因及 悦则赠猿粤葬
基因的引物分别为 云员袁砸员曰 云圆袁砸圆曰 扩增片段长度
分别为 缘怨缘 遭责和 员 苑怨源 遭责遥 均由本实验室保存遥
摇 云员院 缘忆鄄悦粤粤悦悦悦郧粤粤悦粤栽悦粤粤悦郧粤粤栽鄄猿忆袁
摇 砸员院 缘忆鄄郧悦悦粤粤栽粤粤郧悦悦栽粤郧栽栽粤粤粤栽悦粤鄄猿忆曰
摇 云圆院 缘忆鄄悦悦粤栽郧郧悦栽郧悦栽郧粤栽粤粤悦粤粤悦粤悦郧郧粤鄄猿忆袁
摇 砸圆院 缘忆鄄郧郧栽粤粤悦悦栽栽粤粤栽栽悦粤悦栽郧郧粤粤栽郧粤粤悦栽悦鄄猿忆遥
员郾 圆摇 方法
员郾 圆郾 员摇 基本分子生物学操作与引物设计 摇 质粒
阅晕粤的提取尧限制性内切酶酶切反应尧琼脂糖电泳尧
目的片段的扩增尧孕悦砸 产物与酶切产物的连接和转
化尧重组子的筛选等遥 引物设计采用 阅晕粤泽贼葬则 与
孕则蚤皂藻则缘郾 园 软件袁 根据已知 悦则赠猿粤葬 基因的核苷酸序
列袁设计扩增基因全长的特异性引物 云猿 和 砸猿袁并在
引物的 缘忆端和 猿忆端分别加入了限制性内切酶
晕糟燥玉辕 月泽贼耘域酶切位点遥 引物由上海生工生物工程
公司合成遥 序列如下渊下划线处为克隆及鉴定酶切
位点冤院
摇 云猿院缘忆鄄悦悦粤栽郧郧
晕糟燥玉
悦栽郧悦栽郧粤栽粤粤悦粤粤悦粤悦郧郧粤鄄猿忆袁
摇 砸猿院缘忆鄄郧郧栽粤粤悦悦
月泽贼耘域
栽栽粤粤栽栽悦粤悦栽郧郧粤粤栽郧粤粤悦栽悦鄄猿忆遥
猿源
林 业 科 学 源愿 卷摇
员郾 圆郾 圆摇 目的基因的克隆及植物表达载体的构建摇
以 悦则赠猿粤葬 辕 责月悦悦猿 质粒载体为模板袁扩增出 悦则赠猿粤葬
全长基因渊员 苑怨源 遭责冤遥 用 员豫的琼脂糖凝胶电泳鉴
定 孕悦砸产物袁并将 孕悦砸产物连接到质粒 责哉悦皂鄄栽载
体中袁得到中间载体 栽鄄悦则赠猿粤葬遥 将 悦则赠猿粤葬 通过
晕糟燥玉辕 月泽贼耘域位点连接到 责悦粤酝月陨粤员猿园缘 中袁得到含
悦则赠猿粤葬的植物表达载体 责悦粤酝月陨粤员猿园缘鄄悦则赠猿粤葬遥 采
用冻融法将此载体转入农杆菌 耘匀粤员园缘 内袁挑取单
克隆转化子经限制性酶切鉴定无误后袁用于杨树外
植体的遗传转化遥 构建过程见图 员遥
图 员摇 责悦粤酝月陨粤员猿园缘鄄悦则赠猿粤葬植物表达载体构建流程
云蚤早援 员摇 悦燥灶泽贼则怎糟贼蚤燥灶 责则燥糟藻凿怎则藻 燥枣 贼澡藻 责造葬灶贼 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 增藻糟贼燥则 责悦粤酝月陨粤员猿园缘鄄悦则赠猿粤葬
员郾 圆郾 猿摇 农杆菌介导的遗传转化摇 取 责月圆怨 无菌苗充
分展开的幼嫩叶片袁垂直于主脉横切 猿 耀 缘 个深达主
脉的伤口袁用农杆菌菌液浸染 员园 皂蚤灶袁不时轻摇菌
液袁使叶片与菌充分接触遥 取出叶片后用无菌滤纸
吸干袁置于不含选择压的共培养基上袁圆愿 益黑暗条
件 圆 耀 猿 天遥 共培养后无菌水清洗 猿 次袁转接到筛选
培养基上光照培养遥
员郾 圆郾 源摇 转基因植株的 孕悦砸及 耘蕴陨杂粤毒蛋白检测摇
获得 匀赠早抗性的苗生根后移栽大田袁取 员 年生田间
苗叶片袁采用 悦栽粤月 法提取基因组 阅晕粤袁用 悦则赠员粤糟
基因和 悦则赠猿粤葬 基因各自特异性引物进行 孕悦砸 扩
增遥 阳性对照模板为 责悦粤酝月陨粤员猿园缘鄄悦则赠员粤糟鄄悦则赠猿粤葬
质粒 渊在 责悦粤酝月陨粤员猿园缘鄄悦则赠猿粤葬 的 基 础 上 引 入
悦则赠员粤糟而得冤袁阴性对照模板为未经转化的普通
苑源员 杨和 责月圆怨 基因组 阅晕粤曰 蛋白检测阳性对照试
剂盒自带袁阴性对照为 苑源员遥 检测过程参照试剂盒
的说明进行袁用 月蚤燥砸葬凿 缘缘园 型酶标仪测定结果遥
员郾 圆郾 缘摇 转基因植株的抗虫性测验摇 用获得的双 月贼
源源
摇 第 怨 期 王桂英等院 苑源员 杨双 月贼基因的遗传转化及转基因株系的抗虫性
转基因株系尧责月圆怨 和对照 苑源员 的 员 年生田间苗叶片
饲喂柳蓝叶甲渊孕造葬早蚤燥凿藻则葬 增藻则泽蚤糟燥造燥则葬冤和美国白蛾
渊匀赠责澡葬灶贼则蚤葬 糟怎灶藻葬冤遥 每个处理选用大小一致的叶
子袁放置于干净带透气盖的组培用三角瓶中遥 柳蓝
叶甲室内人工饲养袁一龄幼虫渊蕴员 冤刚孵化出 缘 澡 左
右袁三龄渊蕴猿冤为刚从二龄渊蕴圆 冤蜕皮进三龄的幼虫曰
布置虫数每瓶 猿园 头袁设 猿 次重复袁每天调查 员 次遥
美国白蛾用一龄幼虫渊蕴员 冤和四龄幼虫渊蕴源 冤遥 一龄
幼虫为从卵刚孵化出 猿 澡左右的幼虫袁体长 员郾 员 皂皂
左右曰 每瓶 猿园 头袁设 猿 次重复袁每天调查 员 次遥 四
龄幼虫为体长 园郾 怨 糟皂袁刚从三龄蜕皮进入四龄的幼
虫曰 每瓶 员缘 头袁远 次重复袁隔天调查 员 次遥 计算多次
重复的平均死亡率和死亡指数及标准差袁死亡率 越
饲养末期的死亡总数 辕初期的饲养总数 伊 员园园豫 遥 死
亡指数 越移渊天数 伊当天死亡数冤 辕 渊总死亡数 伊总
天数冤遥 死亡指数越小袁前期死亡比例越大袁毒力越
大曰 死亡指数越大袁后期死亡比例越大袁毒力越小遥
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 植物表达载体的鉴定
圆郾 员郾 员摇 中间载体 栽鄄悦则赠猿粤葬的构建与检测摇 以含有
悦则赠猿粤葬基因的重组质粒 责月悦悦猿 为模板袁扩增得到
悦则赠猿粤葬 基因袁与 责哉悦皂鄄栽 载体连接得到中间载体
栽鄄悦则赠猿粤葬遥用 晕糟燥玉和 月泽贼耘域酶切此中间载体袁电泳
显示出 员 苑怨源 遭责和 圆 苑苑猿 遭责的 圆 个片段袁与 悦则赠猿粤葬
基因序列渊员 苑怨源 遭责冤和 栽载体大片段渊圆 苑苑猿 遭责冤大
小相符渊图 圆葬冤遥 上述表明 悦则赠猿粤葬 基因已成功构建
于载体 栽鄄悦则赠猿粤葬中遥
图 圆摇 用 晕糟燥玉和 月泽贼耘域酶切中间载体 栽鄄悦则赠猿粤葬和
植物表达载体 责悦粤酝月陨粤员猿园缘鄄悦则赠猿粤葬检测
云蚤早援 圆摇 陨凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 责造葬泽皂蚤凿 栽鄄悦则赠猿粤葬 葬灶凿
责悦粤酝月陨粤员猿园缘鄄悦则赠猿粤葬 凿蚤早藻泽贼藻凿 憎蚤贼澡 则藻泽贼则蚤糟贼蚤燥灶
藻灶凿燥灶怎糟造藻葬泽藻 晕糟燥玉 葬灶凿 月泽贼耘 域
圆郾 员郾 圆摇 植物表达载体 责悦粤酝月陨粤员猿园缘鄄悦则赠猿粤葬 的检
测摇 分别用 晕糟燥玉和 月泽贼耘域双酶切 栽鄄悦则赠猿粤葬 和
责悦粤酝月陨粤员猿园缘袁琼脂糖凝胶电泳回收 悦则赠猿粤葬小片段
和 责悦粤酝月陨粤员猿园缘 大片段袁用 栽源阅晕粤 连接酶将 圆 个
片段连接袁使 悦则赠猿粤葬 插到 猿缘杂 和 晕韵杂 中间袁得到
猿缘杂鄄悦则赠猿粤葬鄄晕韵杂 表达框架袁构建成重组质粒遥 用
晕糟燥玉和 月泽贼耘 域酶切 责悦粤酝月陨粤员猿园缘鄄悦则赠猿粤葬袁电泳结
果显示出大小约 员 苑怨源 遭责 和 怨 苑愿愿 遭责 的条带袁与
悦则赠猿粤葬基因片段渊员 苑怨源 遭责冤和 责员猿园缘 载体大片段
渊怨 苑愿愿 遭责冤相符合渊图 圆遭冤遥 上述表明 悦则赠猿粤葬 基因
已成功构建于载体 责悦粤酝月陨粤员猿园缘 中遥
圆郾 圆摇 转基因植株的获得
叶片在筛选培养基渊分化培养基 垣 匀赠早员园 皂早窑
蕴 原员 垣 悦栽载源园园 皂早窑蕴 原员 冤培养 员园 天左右时袁愈伤或
绿色芽点出现袁抗性芽因其体内含有潮霉素磷酸转
移酶渊澡责贼冤基因袁能在含有一定浓度 匀赠早的培养基上
生长袁而未转化的细胞则死亡遥 经多次筛选共获得
怨 个转基因株系渊霍雪梅袁 圆园园怨冤袁编号为 责悦悦粤员要
责悦悦粤怨遥 获得的抗性芽生根诱导后经炼苗移栽至大
田定植遥 通过农杆菌介导的遗传转化获得转基因植
株的过程如图 猿遥
图 猿摇 转双 月贼基因 苑源员 杨无性系的再生过程
云蚤早援 猿摇 砸藻早藻灶藻则葬贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 苑源员 造蚤灶藻泽 憎蚤贼澡 凿燥怎遭造藻 月贼 早藻灶藻
葬院共培养 圆 天后叶片的状况曰 遭院 转化叶片在筛选培养基上产生抗性
愈伤组织曰 糟院 愈伤组织分化出抗性芽曰 凿院 抗性芽增殖曰 藻院 转基因植
株生根曰 枣院 转基因植株移栽至花盆中遥
葬院蕴藻葬增藻泽 葬枣贼藻则 圆 凿葬赠泽爷 糟燥鄄糟怎造贼怎则藻曰 遭院栽则葬灶泽早藻灶蚤糟 造藻葬枣 糟葬造造怎泽曰 糟院杂澡燥燥贼泽
则藻早藻灶藻则葬贼藻凿 枣则燥皂 糟葬造造怎泽曰 凿院杂澡燥燥贼泽 皂怎造贼蚤责造蚤糟葬贼蚤燥灶曰 藻院栽澡藻 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽
则燥燥贼泽曰 枣院栽则葬灶泽责造葬灶贼葬贼蚤燥灶 贼燥 枣造燥憎藻则 责燥贼援
圆郾 猿摇 转基因植株的 孕悦砸检测
转基因植株经特异引物 孕悦砸 扩增 悦则赠员粤糟 基
因袁电泳检测如图 源葬袁各转基因株系均扩增得到 员
条与阳性质粒作模板 孕悦砸 扩增条带大小相同的约
远园园 遭责的特异条带渊引物扩增长度为 缘怨缘 遭责冤遥 说
明各转基因株系中 悦则赠员粤糟 基因稳定存在遥 各转基
因植株经特异引物 孕悦砸 扩增检测 悦则赠猿粤葬 基因
渊图 源遭冤袁均得到 员 条与质粒作模板条带大小一致的
约员 愿园园 遭责的特异条带 渊引物扩增长度为 员 苑怨源
遭责冤袁而 责月圆怨 基因组未出现 孕悦砸扩增条带遥 证明外
源 悦则赠猿粤葬基因已整合到各无性系基因组中遥
缘源
林 业 科 学 源愿 卷摇
圆郾 源摇 转基因植株 月贼毒蛋白的 耘蕴陨杂粤检测
检测 悦则赠员粤糟 蛋 白 用 美 国 粤早凿蚤葬 公 司 的
月贼鄄悦则赠员粤遭 辕 员粤糟 耘蕴陨杂粤 蛋白检测试剂盒袁检测结果
责悦悦粤员要怨 和 责月圆怨 呈现蓝色阳性反应袁对照 苑源员 无
显色反应袁所测得毒蛋白含量如图 缘葬遥 检测 悦则赠猿粤葬
蛋白用美国 粤早凿蚤葬公司的 月贼鄄悦则赠猿粤 耘蕴陨杂粤蛋白检测
试剂盒袁检测结果 责悦悦粤员要怨 呈现黄色阳性反应袁
责月圆怨 及对照 苑源员 无显色反应遥 所测得毒蛋白含量
如图 缘遭遥 蛋白浓度以每克渊早冤新鲜叶片所含毒蛋白
纳克数渊 灶早冤计算遥 横坐标 责员要苑 代表 责悦悦粤员要苑袁
责怨 代表 责悦悦粤怨袁责圆怨 代表 责月圆怨曰 无 责悦悦粤愿袁责悦悦粤愿
移栽大田苗太少叶片不够布置试验用袁未参与虫试
及毒蛋白检测遥
图 源摇 转双 月贼基因 苑源员 杨植株的 孕悦砸检测
云蚤早援 源摇 孕悦砸 葬皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责燥责造葬则 责造葬灶贼泽 憎蚤贼澡 悦则赠员粤糟 葬灶凿 悦则赠猿粤葬 早藻灶藻泽
葬院 孕悦砸分析转双 月贼基因 苑源员 杨植株中 悦则赠员粤糟渊缘怨缘 遭责冤基因摇 员援 阳性对照曰 圆 原 员园援 责悦悦粤员要怨曰 员员援 责月圆怨曰
员圆援 阴性对照 苑源员 杨遥 遭院 孕悦砸分析转双 月贼基因 苑源员 杨植株中的 悦则赠猿粤葬渊员 苑怨源 遭责冤基因摇 员 原 怨援 责悦悦粤员要怨曰
员园援 阳性对照曰 员员援 阴性对照 责月圆怨遥 酝院阅蕴 圆 园园园 酝葬则噪藻则援
葬院悦则赠员粤糟 早藻灶藻 渊缘怨缘 遭责冤 孕悦砸 葬皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 苑源员 责燥责造葬则摇 员援 孕燥泽蚤贼蚤增藻 糟燥灶贼则燥造曰 圆 原 员园援 责悦悦粤员要怨曰
员员援 责月圆怨曰 员圆援 晕藻早葬贼蚤增藻 糟燥灶贼则燥造 苑源员 责燥责造葬则援 遭院孕悦砸 葬皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 悦则赠猿粤葬 早藻灶藻渊员 苑怨源 遭责冤 枣则燥皂 贼澡藻 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 苑源员 责燥责造葬则
员 原 怨援 责悦悦粤员要怨曰 员园援 孕燥泽蚤贼蚤增藻 糟燥灶贼则燥造曰 员员援 晕藻早葬贼蚤增藻 糟燥灶贼则燥造 责月圆怨援 酝院阅蕴 圆 园园园 酝葬则噪藻则援
图 缘摇 责悦系列 悦则赠员粤糟 和 悦则赠猿粤葬毒蛋白含量
云蚤早援 缘摇 悦则赠员粤糟 葬灶凿 悦则赠猿粤葬 贼燥曾蚤糟 责则燥贼藻蚤灶 糟燥灶贼藻灶贼
责员要苑援 责悦悦粤员要苑曰 责怨援 责悦悦粤怨曰 责圆怨援 责月圆怨援
圆郾 缘摇 转基因植株的抗虫性
圆郾 缘郾 员摇 转基因株系对柳蓝叶甲的致死效应摇 转基
因叶片对柳蓝叶甲一龄虫渊蕴员 冤和三龄虫渊蕴猿 冤均具
有毒杀效果遥 取食 责悦系列叶片后袁三龄虫 源 天渊图
远冤内尧一龄虫 圆 天内渊表 员冤全部死亡遥 而 责月圆怨渊单
抗鳞翅目冤和对照 苑源员 的死亡率只有 员豫 耀 猿豫 遥 一
龄虫取食 员 天时死亡率相对低的是 责悦悦粤猿 和
责悦悦粤苑袁分别为 苑怨豫和 愿怨豫 曰 三龄虫取食 员 天时死
亡率相对低的是 责悦悦粤猿袁责悦悦粤源 和 责悦悦粤苑袁分别为
源愿豫 袁远远豫和 源苑豫 遥 虽然三龄虫随虫龄增大虫体抗
性相对增强袁但 责悦悦粤鄄员袁圆袁远袁怨 四个系号第 圆 天致
死率就达到了 员园园豫 袁责悦悦粤缘 为 怨远豫 袁第 猿 天也达到
员园园豫 曰 而 责悦悦粤鄄猿袁源袁苑 上的幼虫取食 源 天后才全部
死亡遥 根据转基因叶片对柳蓝叶甲的致死率和死亡
指数袁在对鞘翅目的抗性上将 责悦 系列划分为 猿 类院
高抗株系渊责悦悦粤鄄员袁圆袁缘袁远袁怨冤曰 中抗株系渊责悦悦粤鄄源袁
苑冤曰 低抗株系渊责悦悦粤猿冤遥 一龄虫取食 员 天后拍照如
图 苑渊幼虫仍分散在叶片上冤袁图中只选取了高尧中尧
远源
摇 第 怨 期 王桂英等院 苑源员 杨双 月贼基因的遗传转化及转基因株系的抗虫性
图 远摇 柳蓝叶甲三龄虫死亡率
云蚤早援 远摇 酝燥则贼葬造蚤贼赠 燥枣 蕴猿 孕援 增藻则泽蚤糟燥造燥则葬
每一组柱形图从左到右依次为院
责悦悦粤员要苑袁 责悦悦粤怨袁 责月圆怨 和 苑源员渊悦运冤遥
耘葬糟澡 早则燥怎责 燥枣 澡蚤泽贼燥早则葬皂 蚤灶 责则燥责藻则 燥则凿藻则 枣则燥皂
造藻枣贼 贼燥 则蚤早澡贼院 责悦悦粤员要苑袁 责悦悦粤怨袁 责月圆怨 葬灶凿 苑源员渊悦运冤援
低抗的部分系号袁在 责悦系列中袁可以看出 责悦悦粤猿 的
取食面积最大遥 责悦悦粤圆 和 责悦悦粤怨 叶片只有分散的
取食斑痕袁多数取食斑在放大镜下才明显看到遥 而
责月圆怨 和对照 苑源员 取食面积相当袁猿园 头一龄虫 员 天的
取食就对叶片造成了明显的危害遥
圆郾 缘郾 圆摇 转基因株系对美国白蛾的致死效应摇 用转
摇 摇 摇
基因叶片饲喂美国白蛾一龄幼虫袁取食第 员 天死亡
率在 远豫 耀 猿缘豫 袁与柳蓝叶甲一龄虫不同的是死亡
高峰出现在第 圆 天袁猿 天后全部死亡渊表 员冤遥 说明
转基因植株对于刚从卵孵化出的美国白蛾幼虫也具
有很好的毒杀性遥 但从死亡率和死亡指数 圆 项指标
综合分析袁 责悦悦粤员 对美国白蛾的抗性是偏低的遥
图 苑摇 柳蓝叶甲一龄虫取食 员 天后的叶片
云蚤早援 苑摇 韵灶藻鄄凿葬赠鄄藻葬贼蚤灶早 造藻葬增藻泽 遭赠 蕴员 孕援 增藻则泽蚤糟燥造燥则葬
表 员摇 柳蓝叶甲和美国白蛾一龄幼虫的死亡率和死亡指数淤
栽葬遭援 员摇 栽澡藻 皂燥则贼葬造蚤贼赠 葬灶凿 凿藻葬贼澡 蚤灶凿藻曾 燥枣 蕴员 孕援 增藻则泽蚤糟燥造燥则葬 葬灶凿 匀援 糟怎灶藻葬
虫龄陨灶泽藻糟贼 蚤灶泽贼葬则 死亡率酝燥则贼葬造蚤贼赠
株系 蕴蚤灶藻泽
责员 责圆 责猿 责源 责缘 责远 责苑 责怨 责圆怨 苑源员渊悦运冤
柳蓝叶甲一龄虫蕴员 孕援 增藻则泽蚤糟燥造燥则葬
第 员 天 栽澡藻 员泽贼 凿葬赠渊豫 冤 怨愿 怨苑 苑怨 怨源 怨愿 员园园 愿怨 员园园 圆 猿
第 圆 天 栽澡藻 圆灶凿 凿葬赠渊豫 冤 员园园 员园园 员园园 员园园 员园园 员园园 员园园 员园园 圆 猿
死亡指数 阅藻葬贼澡 蚤灶凿藻曾 园郾 缘员 园郾 缘圆 园郾 远远 园郾 缘猿 园郾 缘员 园郾 缘 园郾 缘远 园郾 缘 园郾 怨怨 园郾 怨愿
美国白蛾一龄虫蕴员 匀援 糟怎灶藻葬
第 员 天 栽澡藻 员泽贼 凿葬赠渊豫 冤 远 圆缘 愿 员园 员园 猿缘 猿园 圆苑 员源 员
第 圆 天 栽澡藻 圆灶凿 凿葬赠渊豫 冤 怨源 怨远 怨怨 怨猿 怨圆 怨愿 怨苑 怨怨 怨源 员
第 猿 天 栽澡藻 猿则凿 凿葬赠渊豫 冤 员园园 员园园 员园园 员园园 员园园 员园园 员园园 员园园 员园园 员
死亡指数 阅藻葬贼澡 蚤灶凿藻曾 园郾 愿愿 园郾 苑怨 园郾 愿远 园郾 愿远 园郾 愿远 园郾 苑猿 园郾 苑苑 园郾 苑苑 园郾 苑怨 园郾 怨怨
摇 摇 淤 责员要苑援 责悦悦粤员要苑曰 责怨援 责悦悦粤怨曰 责圆怨援 责月圆怨援
摇 摇 美国白蛾幼虫共有 苑 个龄期袁一至三龄幼虫吐
丝结网袁营群居生活袁四龄以后开始分散遥 为研究转
基因植株对于飘移来的四龄以上美国白蛾的抗虫
性袁取中间的四龄虫做饲喂试验遥 结果表明幼虫的
抗性明显提高袁死亡时间延长至 苑 耀 怨 天遥 从四龄虫
累积死亡率折线图渊图 愿冤看出袁责悦悦粤圆要苑袁责悦悦粤怨
和 责月圆怨 在第 苑 耀 怨 天时死亡率达 员园园豫 袁而 责悦悦粤员
在第 苑 天和第 怨 天时的死亡率分别只有 苑豫 和
圆猿豫 遥 从四龄虫可以明显看出 责悦悦粤员 对美国白蛾
的毒杀效果不佳袁这与一龄虫的结果相吻合遥 所以
按死亡率确定 责悦系列的 责悦悦粤圆要苑 和 责悦悦粤怨 为高
抗美国白蛾株系袁责悦悦粤员 为低抗株系遥 图 愿摇 美国白蛾四龄虫累计死亡率
云蚤早援 愿摇 栽澡藻 皂燥则贼葬造蚤贼赠 燥枣 蕴源 匀援 糟怎灶藻葬
苑源
林 业 科 学 源愿 卷摇
猿摇 结论与讨论
猿郾 员摇 抗虫基因的修饰改造及启动子类型
转抗虫基因植物要想获得到较好的抗虫效果袁
月贼基因在植物中必须能得以高效表达渊耘泽贼则怎糟澡 藻贼
葬造援袁 员怨怨苑冤袁许多研究表明转 月贼 基因植物中的毒蛋
白的高效表达需要对 月贼 基因进行修饰改造渊孕藻则造葬噪
藻贼 葬造援袁 员怨怨员冤遥 这一结论首先在许多转基因作物中
被发现袁后来在一些多年生植物中更加得以证实遥
苑源员 杨无性系 责月圆怨 中的 悦则赠员粤糟 基因是经过部分改
造的渊田颖川等袁 圆园园园冤遥 本试验所用 悦则赠猿粤葬 基因
也经修饰改造袁由组成型强表达启动子 悦葬酝灾猿缘杂 启
动子和 晕韵杂终止子调控袁并以 澡责贼 基因作为筛选标
记基因遥 值得关注的是本研究中 悦则赠猿粤葬 蛋白表达
量远远高于 悦则赠员粤糟蛋白表达袁本实验室的其他转抗
虫基因研究也证实了二者表达量的差别渊田颖川
等袁 圆园园园曰 杨敏生等袁 圆园园远曰 牛小云等袁圆园员员冤袁这种
表达差别的原因有待进一步研究遥 另外组成型启动
子能在所有细胞尧任何时候进行转录袁对转基因植株
本身以及环境存在一定的影响袁特异性启动子渊组
织特异型和诱导型启动子冤平时不启动转录或转录
活性很低袁 但在某些特定逆境信号的刺激下袁 转录
活性能够显著地提高渊朱丽萍等袁圆园员园冤袁因此利用
特异性启动子的研究也有待进行遥
猿郾 圆摇 转基因植株中外源基因的表达与沉默
本研究得到的 责悦系列 苑源员 杨具有了双抗特性袁
在对鞘翅目柳蓝叶甲的抗性上袁不同系号表现出了
高尧中尧低抗的差异遥 所测 悦则赠猿粤葬 毒蛋白表达量与
抗虫性表现一致袁责悦悦粤猿袁责悦悦粤源 和 责悦悦粤苑 抗虫性
偏差袁悦则赠猿粤葬毒蛋白含量也偏低遥 在对鳞翅目的抗
性上袁责悦悦粤圆要苑袁责悦悦粤怨 与 责月圆怨 表现一致袁责悦悦粤员
理论上也应与 责月圆怨 表现出一致抗性袁因为原 责月圆怨
本身是抗鳞翅目渊含有 月贼悦则赠员粤糟基因和慈菇蛋白酶
抑制剂 粤孕陨基因冤的 苑源员 杨转基因株系遥 但在美国
白蛾的虫试中袁责悦悦粤员 同 责月圆怨 差别明显袁责悦悦粤员 对
四龄虫表现了极低的抗性遥 从 悦则赠员粤糟 毒蛋白表达
量来看袁各系号差异较大遥 由此看来袁月贼悦则赠猿粤葬 基
因的插入对原基因组及蛋白表达产生了不同程度的
影响遥 许多研究表明外源基因整合进植物的基因组
后袁 其表达和稳定性与转基因的失活和沉默有关
渊 杂贼葬皂 藻贼 葬造援袁 员怨怨苑曰 运蚤造遭赠 藻贼 葬造援袁 员怨怨圆曰 宰怎 藻贼 葬造援袁
圆园园圆冤遥 转基因失活的机制有多种袁如 阅晕粤甲基化尧
共抑制等渊宰葬灶早 藻贼 葬造援袁 圆园园愿曰 酝藻赠藻则 藻贼 葬造援袁 员怨怨源冤遥
转基因沉默则指外源基因存在于生物体内袁并未丢
失或损伤袁但该基因不表达或表达量极低的现象遥
转基因沉默可以发生在染色体 阅晕粤尧转录和转录后
猿 种不同的层次上渊万小荣等袁圆园员员冤遥 责悦 系列在抗
虫性及毒蛋白表达上差异的具体原因尚需要进一步
研究遥
猿郾 猿摇 结论
本研究在构建 责悦粤酝月陨粤员猿园缘鄄悦则赠猿粤葬 植物表达
载体的基础上袁采用农杆菌介导法袁将 悦则赠猿粤葬 基因
转入已转 悦则赠员粤糟 垣 粤孕陨基因的杂种 苑源员 毛白杨无性
系 责月圆怨 中袁获得了含双 月贼 及 粤孕陨 基因的 责悦 系列遥
孕悦砸及 耘蕴陨杂粤均检测到了双 月贼基因的存在与表达遥
用转基因株系叶片进行柳蓝叶甲和美国白蛾饲虫试
验结果表明袁 转基因植株对鳞翅目和鞘翅目具有双
抗虫性遥 其中 责悦悦粤圆袁责悦悦粤缘袁责悦悦粤远 和 责悦悦粤怨 具
有双高抗曰 责悦悦粤猿袁责悦悦粤源 和 责悦悦粤苑 对柳蓝叶甲表
现出中低抗性袁对美国白蛾则高抗曰 而 责悦悦粤员 表现
对美国白蛾的极低抗性袁对柳蓝叶甲则高抗遥 本研
究首次获得既抗鳞翅目又抗鞘翅目的转双 月贼 苑源员
杨袁使得本品种对 圆 类主要的林业害虫兼具抗性袁为
开展后续研究及在林业生产上的应用打下了基础遥
对转基因株系的荧光定量 孕悦砸 检测及 杂燥怎贼澡藻则灶袁
晕燥则贼澡藻则灶袁宰藻泽贼藻则灶分析将于下一步深入进行遥
参 考 文 献
郭三堆袁 崔洪志袁 夏兰芹袁 等援 员怨怨怨援 双价抗虫转基因棉花研究援中
国农业科学袁 猿圆渊猿冤院 员 原 苑援
霍雪梅援 圆园园怨援 抗虫基因植物表达载体构建尧遗传转化及表达研究援
保定院 河北农业大学硕士学位论文援
李明亮袁 张摇 辉袁 胡建军袁 等援 圆园园园援 转 月贼 基因和蛋白酶抑制剂基
因杨树抗虫性的研究援 林业科学袁 猿远渊圆冤院 怨猿 原 怨苑援
牛小云袁 黄大庄袁 杨敏生袁 等援 圆园员员援 转 月贼糟则赠猿粤 抗虫基因杨树中毒
蛋白的时空表达援 林业科学袁 源苑渊员圆冤院 员缘源 原 员缘苑援
田颖川袁 郑均宝袁 虞红梅袁 等援 圆园园园援 转双抗虫基因杂种 苑源员 毛白杨
的研究援 植物学报袁 源圆渊猿冤院圆远猿 原 圆远愿援
万小荣袁 莫爱琼袁 杨妙贤袁 等援 圆园员员援 植物基因沉默机制研究进展援
安徽农业科学袁 猿怨渊员苑冤院 员园员愿愿 原 员园员愿怨袁 员园猿源苑援
王继磊袁 刘迪秋袁丁元明袁 等援 圆园员园援 月贼 转基因抗虫植物研究进展援
生物学杂志袁 圆苑渊源冤院 苑缘 原 苑愿援
杨敏生袁 李志兰袁 王摇 颖袁等援 圆园园远援 双抗虫基因对三倍体毛白杨的
转化和抗虫性表达援 林业科学袁 源圆渊怨冤院 远员 原 远愿援
张冰玉袁 苏晓华袁 李义良袁 等援 圆园园缘援 转双价抗蛀干害虫基因杨树的
获得及其抗虫性鉴定援 林业科学研究袁 员愿渊猿冤院 猿远源 原 猿远愿援
郑均宝袁 梁海永袁 高宝嘉袁 等援 圆园园园援 转双抗虫基因 苑源员 毛白杨的选
择及抗虫性援 林业科学袁 猿远渊圆冤院 员猿 原 员怨援
朱丽萍袁 于摇 壮袁 邹翠霞袁 等援 圆园员园援 植物逆境相关启动子及功能援
遗传袁 猿圆渊猿冤院 圆圆怨 原 圆猿源援
月葬贼藻泽 杂袁 在澡葬燥 允蚤葬灶扎澡燥怎袁 砸燥怎泽澡 砸袁 藻贼 葬造援 圆园园缘援 陨灶泽藻糟贼 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻
皂葬灶葬早藻皂藻灶贼 蚤灶 郧酝 糟则燥责泽院 责葬泽贼袁 责则藻泽藻灶贼 葬灶凿 枣怎贼怎则藻援 晕葬贼怎则藻
月蚤燥贼藻糟澡灶燥造燥早赠袁 圆猿渊员冤院 缘苑 原 远圆援
月藻贼扎 云 杂袁 匀葬皂皂燥灶凿 月 郧袁 云怎糟澡泽 砸 蕴援 圆园园园援 杂葬枣藻贼赠 葬灶凿 葬凿增葬灶贼葬早藻泽 燥枣
愿源
摇 第 怨 期 王桂英等院 苑源员 杨双 月贼基因的遗传转化及转基因株系的抗虫性
月葬糟蚤造造怎泽 贼澡怎则蚤灶早蚤藻灶泽蚤泽 责则燥贼藻糟贼藻凿 责造葬灶贼泽 贼燥 糟燥灶贼则燥造 蚤灶泽藻糟贼 责藻泽贼泽援 砸藻早怎造
栽燥曾蚤糟燥造 孕澡葬则皂葬糟燥造袁 猿圆渊圆冤院 员缘远 – 员苑猿援
悦澡则蚤泽贼燥怎 孕袁 悦葬责藻造造 栽袁 运燥澡造蚤 粤袁 藻贼 葬造援 圆园园远援 砸藻糟藻灶贼 凿藻增藻造燥责皂藻灶贼泽 葬灶凿
枣怎贼怎则藻 责则燥泽责藻糟贼泽 蚤灶 蚤灶泽藻糟贼 责藻泽贼 糟燥灶贼则燥造 蚤灶 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 糟则燥责泽援 栽则藻灶凿泽 蚤灶
孕造葬灶贼 杂糟蚤藻灶糟藻袁 员员渊远冤院 猿园圆 原 猿园愿援
耘泽贼则怎糟澡 允 允袁 悦葬则燥扎扎蚤 晕 月袁 阅藻泽葬蚤 晕袁藻贼 葬造援 员怨怨苑援 栽则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽院葬灶
藻皂藻则早蚤灶早 葬责责则燥葬糟澡 贼燥 责藻泽贼 糟燥灶贼则燥造援 晕葬贼怎则藻 月蚤燥贼藻糟澡灶燥造燥早赠袁 员缘 渊圆冤院
员猿苑 – 员源员援
郧葬贼藻澡燥怎泽藻 允援 圆园园愿援 月蚤燥贼藻糟澡灶燥造燥早蚤糟葬造 责则燥泽责藻糟贼泽 枣燥则 藻灶早蚤灶藻藻则蚤灶早 蚤灶泽藻糟贼
则藻泽蚤泽贼葬灶贼 责造葬灶贼泽援 孕造葬灶贼 孕澡赠泽蚤燥造燥早赠袁 员源远渊猿冤院 愿愿员 原 愿愿苑援
郧佴灶蚤泽泽藻造 粤袁 蕴藻责造佴 允 悦袁 酝蚤造造藻贼 晕袁 藻贼 葬造援 圆园园猿援 匀蚤早澡 贼燥造藻则葬灶糟藻 葬早葬蚤灶泽贼
悦澡则赠泽燥皂藻造葬 贼则藻皂怎造葬藻 燥枣 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责燥责造葬则 责造葬灶贼泽 藻曾责则藻泽泽蚤灶早 葬
泽赠灶贼澡藻贼蚤糟 糟则赠猿粤葬 早藻灶藻 枣则燥皂 月葬糟蚤造造怎泽 贼澡怎则蚤灶早蚤藻灶泽蚤泽 泽泽责 贼藻灶藻遭则蚤燥灶蚤泽援 酝燥造
月则藻藻凿蚤灶早袁 员员渊圆冤院 员园猿 原 员员园援
郧怎燥 匀燥灶早灶蚤葬灶袁 宰怎 允蚤葬澡藻袁 悦澡藻灶 载蚤葬燥赠蚤灶早袁 藻贼 葬造援 圆园园猿援 悦燥贼贼燥灶 孕造葬灶贼泽
贼则葬灶泽枣燥则皂藻凿 憎蚤贼澡 贼澡藻 葬糟贼蚤增葬贼藻凿 糟澡蚤皂藻则蚤糟 悦则赠员粤糟 葬灶凿 粤孕陨鄄月 早藻灶藻泽援
粤糟贼葬 月燥贼葬灶蚤糟葬 杂蚤灶蚤糟葬袁 源缘渊员冤院 员园愿 原 员员猿援
匀葬蚤造泽 砸 杂援 圆园园园援 郧藻灶藻贼蚤糟葬造造赠 皂燥凿蚤枣蚤藻凿 责造葬灶贼泽要贼澡藻 凿藻遭葬贼藻 糟燥灶贼蚤灶怎藻泽援
栽则藻灶凿泽 蚤灶 耘糟燥造燥早赠 葬灶凿 耘增燥造怎贼蚤燥灶袁 员缘渊员冤院 员源 原 员愿援
允燥怎葬灶蚤灶 蕴袁月燥灶葬凿藻鄄月燥贼贼蚤灶燥 酝袁 郧蚤则葬则凿 悦袁 藻贼 葬造援 员怨怨愿援 栽则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽
枣燥则 蚤灶泽藻糟贼 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻援 孕造葬灶贼 杂糟蚤藻灶糟藻袁 员猿员渊员冤院 员 原 员员援
运蚤造遭赠 晕 允 晕蚤早藻造袁 蕴藻赠泽藻则 匀 酝 韵袁 云怎则灶藻则 陨 允援 员怨怨圆援 孕则燥皂燥贼藻则 皂藻贼澡赠造葬贼蚤燥灶
葬灶凿 责则燥早则藻泽泽蚤增藻 贼则葬灶泽早藻灶藻 蚤灶葬糟贼蚤增葬贼蚤燥灶 蚤灶 粤则葬遭蚤凿燥责泽蚤泽援 孕造葬灶贼
酝燥造藻糟怎造葬则 月蚤燥造燥早赠袁 圆园渊员冤院 员园猿 原 员员圆援
蕴蚤 郧怎燥责蚤灶早袁 宰怎 运燥灶早皂蚤灶早袁 郧燥怎造凿 云袁藻贼 葬造援 圆园园苑援 陨灶糟则藻葬泽蚤灶早 贼燥造藻则葬灶糟藻
贼燥 悦则赠员粤糟 糟燥贼贼燥灶 枣则燥皂 糟燥贼贼燥灶 遭燥造造憎燥则皂袁 匀藻造蚤糟燥增藻则责葬 葬则皂蚤早藻则葬袁 憎葬泽
糟燥灶枣蚤则皂藻凿 蚤灶 月贼 糟燥贼贼燥灶 枣葬则皂蚤灶早 葬则藻葬 燥枣 悦澡蚤灶葬援 耘糟燥造燥早蚤糟葬造
耘灶贼燥皂燥造燥早赠袁 猿圆渊源冤院 猿远远 – 猿苑缘援
蕴蚤怎 月蚤葬燥袁 宰葬灶早 蕴蚤葬灶早袁 在藻灶早 匝蚤灶早袁 藻贼 葬造援 圆园园怨援 粤泽泽藻泽泽蚤灶早 藻枣枣藻糟贼泽 燥枣
贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 悦则赠员粤糟 糟燥贼贼燥灶 燥灶 贼澡藻 藻葬则贼澡憎燥则皂 耘蚤泽藻灶蚤葬 枣藻贼蚤凿葬援 杂燥蚤造
月蚤燥造燥早赠 驭 月蚤燥糟澡藻皂蚤泽贼则赠袁 源员渊怨冤院 员愿源员 原 员愿源远援
酝藻赠藻则 孕袁 匀藻蚤凿皂葬灶灶 蕴援 员怨怨源援 耘责蚤早藻灶藻贼蚤糟 增葬则蚤葬灶贼泽 燥枣 葬 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责藻贼怎灶蚤葬
造蚤灶藻 泽澡燥憎 澡赠责藻则鄄皂藻贼澡赠造葬贼蚤燥灶 蚤灶 贼则葬灶泽早藻灶藻鄄阅晕粤院 粤灶 蚤灶凿蚤糟葬贼蚤燥灶 枣燥则
泽责藻糟蚤枣蚤糟 则藻糟燥早灶蚤贼蚤燥灶 燥枣 枣燥则藻蚤早灶 阅晕粤 蚤灶 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽援 酝燥造 郧藻灶
郧藻灶藻贼袁 圆源猿渊源冤院 猿怨园 原 猿怨怨援
孕藻则造葬噪 云 允袁 云怎糟澡泽 砸 蕴袁 阅藻葬灶 阅 粤袁 藻贼 葬造援 员怨怨员援 酝燥凿蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻
糟燥凿蚤灶早 泽藻择怎藻灶糟藻 藻灶澡葬灶糟藻泽 责造葬灶贼 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 蚤灶泽藻糟贼 糟燥灶贼则燥造 责则燥贼藻蚤灶
早藻灶藻泽援 孕则燥糟 晕葬贼造 粤糟葬凿 杂糟蚤 哉杂粤袁 愿愿渊愿冤院 猿猿圆源 – 猿猿圆愿援
杂葬糟澡泽 耘 杂袁 月藻灶藻凿蚤糟贼 允 匀袁 杂贼藻造造赠 阅 酝袁 藻贼 葬造援 员怨怨愿援 耘曾责则藻泽泽蚤燥灶 葬灶凿
泽藻早则藻早葬贼蚤燥灶 燥枣 早藻灶藻 藻灶糟燥凿蚤灶早 糟则赠员粤 蚤灶泽藻糟贼蚤糟蚤凿葬造 责则燥贼藻蚤灶 蚤灶 糟燥贼贼燥灶援
悦则燥责 杂糟蚤藻灶糟藻泽袁 猿愿渊员冤院员 原 员员援
杂贼葬皂 酝袁 酝燥造 允 晕 酝袁 运燥燥贼藻则 允 酝援 员怨怨苑援 栽澡藻 泽蚤造藻灶糟藻 燥枣 早藻灶藻泽 蚤灶
贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽援 粤灶灶葬造泽 燥枣 月燥贼袁 苑怨渊员冤院 猿 原 员圆援
栽怎 允怎皂蚤灶袁 在澡葬灶早 郧怎燥葬灶袁 阅葬贼贼葬 运袁 藻贼 葬造援 圆园园园援 云蚤藻造凿 责藻则枣燥则皂葬灶糟藻 燥枣
贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 藻造蚤贼藻 糟燥皂皂藻则糟蚤葬造 澡赠遭则蚤凿 则蚤糟藻 藻曾责则藻泽泽蚤灶早 月葬糟蚤造造怎泽
贼澡怎则蚤灶早蚤藻灶泽蚤泽 啄鄄藻灶凿燥贼燥曾蚤灶援 晕葬贼怎则藻 月蚤燥贼藻糟澡灶燥造燥早赠袁 员愿 渊 员园 冤院
员员园员 原 员员园源援
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