全 文 ：第 50 卷 第 12 期
2 0 1 4 年 12 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 50，No. 12
Dec．，2 0 1 4
doi:10．11707 / j．1001-7488．20141207
收稿日期: 2014 － 05 － 20; 修回日期: 2014 － 09 － 01。
基金项目: 西北大学大学生创新创业训练计划项目( 2014003 ) ; 国家基础科学人才培养基金( J1210063 ) ; 国家自然科学基金项目
(31200500，41471038) ; 西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室基金项目( ZS12017) ; 陕西省教育厅科研计划项目(12JK0829) ; 长
江学者和创新团队发展计划资助( IＲT1174) ; 西北大学科研启动金(PＲ11055)。
* 赵鹏为通讯作者。
秦岭地区核桃自然群体和栽培群体的遗传
多样性及其演化关系*
———基于 nrDNA ITS 序列分析
胡昳恒1 党 萌1 张 甜1 罗桂春1 夏海龙1 周惠娟1
呼东峰2 贺 亮3 马振华4 赵 鹏1
(1． 西北大学生命科学学院 西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室 西安 710069;
2． 陕西省环境监测中心站 西安 710054; 3．西安市环境监测站 西安 710054; 4． 国家林业局西北林业调查规划设计院 西安 710048)
摘 要: 基于 19 个自然群体和 10 个栽培群体共 359 个个体的核糖体内转录间隔区(nrDNA ITS)序列分析，研究
秦岭地区核桃的群体遗传多样性、群体遗传结构及单倍型地理分布。359 条 ITS 序列上共有 18 个单倍型，表现出
较低的遗传多样性(H d = 0. 274，π = 0. 005 5)，群体间单倍型遗传多样性差异较大(H d = 0 ～ 0. 679，π = 0 ～ 0. 017)。
Network 单倍型网络分析表明，单倍型 14 和单倍型 7 比较原始，且栽培群体与自然群体之间对古老单倍型 H14 与
H7 有着明显的共享现象，基因流较强(Nm = 48. 62)。综合中性检验及失配分析的结果，可推断在近期历史上秦岭
地区核桃没有发生过群体扩张事件。AMOVA 分析结果显示，秦岭地区自然核桃群体遗传变异主要存在于群体内
(53. 4% )，群体间遗传分化水平较低(GST = 0. 067)。单倍型最大简约树和邻接树均可将 18 个单倍型及所有核桃
群体分成两大支。
关键词: 核桃; 秦岭; 群体遗传结构; ITS 序列; 基因流
中图分类号: S718. 46; S718. 49 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2014)12 － 0047 － 09
Genetic Diversity and Evolutionary Ｒelationship of Juglans regia Wild and
Domesticated Populations in Qinling Mountains Based on nrDNA ITS Sequences
Hu Yiheng1 Dang Meng1 Zhang Tian1 Luo Guichun1 Xia Hailong1 Zhou Huijuan1
Hu Dongfeng2 He Liang3 Ma Zhenhua4 Zhao Peng1
(1 ． Key Laboratory of Ｒesource Biology and Biotechnology in Western China of Ministry of Education
College of Life Sciences，Northwest University Xi’an 710069;
2 ． Shaanxi Environmental Monitoring Station Xi’an 710054; 3 ． Xi’an Environmental Monitoring Station Xi’an 710054;
4 ． Northwest Institute of Forest Inventory，Planning and Design，State Forestry Administration Xi’an 710048)
Abstract: A total of 359 rDNA ITS sequences were used to study the genetic diversity，population genetic structure and
the geographical distribution of haplotype patterns of Juglans regia wild and domesticated populations． The results showed
that: based on ITS sequences，18 haplotypes were found in 29 populations． Nueleotide diversity (π) at species level was
0. 005 5，and haplotype diversity(Hd)was 0. 274． The haplotype diversity was from 0 to 0. 679 in different populations． The
gene flow (Nm = 48. 62) was fairly strong between wild and domesticated populations． Haplotype of network showed that
haplotype 7 and haplotype 14 were relatively original in this study． Also，haplotype 7 and haplotype 14 were shared among
different populations in wild and domesticated populations． The results of Neutrality test and mismatch distribution analysis
showed that common walnut trees have not been expanded in recent history． The result of AMOVA depended on ITS showed
that genetic variation of J． regia mainly occurred within wild populations，G ST was 0. 067． The maximum likelihood (ML)
tree and neighbor-joining (NJ) tree showed all haplotypes and populations were divided into two clusters．
林 业 科 学 50 卷
Key words: Juglans regia; Qinling Mountains; population genetic structure; ITS sequence; gene flow
核桃( Juglans regia)，也称胡桃，隶属于胡桃科
( Juglandaceae)胡桃属 ( Juglans)，植物体为二倍体
(2n = 32)，雌雄同株异花，雄花序为下垂葇荑花序，
雌花 2 ～ 3 朵簇生，属风媒植物 (Hsu et al．，1994;
Dandekar et al．，2005; 裴东等，2011)。该物种具有
重要的经济价值，被列为世界四大坚果(榛子、核
桃、杏仁、腰果)之一。大量研究表明，核桃果仁具
有很高的抗氧化能力，且 Omega-3 脂肪酸和蛋白质
等营养成分含量高，对人类健康非常有利 ( Ｒos et
al．，2006; Damasceno et al．，2011; Vinson et al．，
2012)。
我国为世界核桃的主产区，总产量居全球前列，
栽培历史悠久(Beer et al．，2008; Joly et al．，2009)。
随着人们对核桃的栽培和人工驯化，品种也越来越
多 ( Pollegioni et al．， 2011; Christopoulos et al．，
2010)，核桃种质资源保护面临着严峻的挑战。同
时由于自然核桃蕴含着丰富的遗传资源，自然群体
与栽培群体之间的基因流如何也需进一步了解。秦
岭地区是我国核桃重要产区之一(裴东等，2011)，
该地区位于我国温带与亚热带之间的过渡地带，作
为我国重要的生物地理分界线(赵桦等，2001; 王
菁兰等，2010)，在生态学、地理学、植物学等相关学
科领域研究中占有重要地位(白红英等，2012)。目
前，秦岭地区自然核桃与栽培核桃种质资源状况还
不清楚，尤其从分子水平的研究未见报道，阻碍了该
地区核桃种质资源的开发和利用。
近年来，国内外研究者采用不同的分子遗传标
记(ＲAPD，ＲFLP，SSＲ，ISSＲ)对胡桃属植物亲缘关
系(Pollegioni et al．，2009; Zhao et al．，2014)、系统发
育和谱系地理 ( Stanford et al．，2000; Bai et al．，
2010)、遗传多样性和遗传结构(Victory et al．，2006;
王滑等，2007; Zhao et al．，2012)、核桃栽培品种鉴
定和基因流估计(Christopoulos et al．，2010; Zhao et
al．，2011)以及个体之间遗传关系等方面(Malvolti et
al．，1994; Ciarmiello et al．，2011; Zhao et al．，2013)
进行了研究。核糖体 DNA 内转录间隔区 ( internal
transcribed spacer，ITS)是核糖体 DNA 上的一个非
编码区域。该区域包括 3 个部分: ITS1 (位于
18SrDNA 和 5. 8SrDNA 之间)、5. 8SrDNA 和 ITS2(位
于 5. 8SrDNA 和 28SrDNA 之间) ( Baldwin，1992 )。
在被子植物中，ITS 序列长度在 500 ～ 700 bp 之间
(Ciarmiello et al．，2011 )。 ITS 序列在系统发育学
(Chen et al．，2001; Potter et al．，2002; Li et al．，
2011)物种鉴定和进化等研究( Zhao et al．，2011;
Ｒeddy et al．，2013; Bartha et al．，2013)中应用广泛。
本研究选取核糖体内转录区 ( ITS)序列，通过
测序获得了秦岭地区核桃的 19 个自然群体和 10 个
栽培群体的序列数据;进行了核苷酸多态性、遗传结
构与核桃自然群体分子方差分析;估算了核桃自然
与栽培群体的基因流，并构建了该地区核桃自然和
栽培群体系统发育树，试图探讨秦岭地区栽培核桃
与自然核桃之间的关系，分析秦岭核桃资源演化与
地理位置间的关系。研究结果有助于了解该物种的
遗传资源分布、预测种源适应性，亦对种质资源开发
与利用以及杂交育种的亲本选配等有重要意义。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
在 2011—2013 年对我国秦岭地区核桃资源全
面考察的基础上，进行群体采样，共采集了 18 个野
生自然群体(涵盖秦岭南北坡包含七十二峪核桃分
布的地理范围)以及 9 个人工栽培群体(位于商洛、
安康、宝鸡、汉中和西安 5 个地区)。另外，采集 1 个
四川省峨眉山中峰寺核桃自然群体与 1 个黑龙江省
核桃栽培群体作对照(图 1，表 1)。每个自然群体
选择 9 ～ 20 个植株进行采样，相邻植株间隔 50 ～
100 m; 栽培群体均选自集中种植的农地，每个群体
选取 5 ～ 23 个植株采样，相邻植株间距为 3 ～ 5 m。
取核桃健康植株，采集当年生鲜嫩叶片 2 ～ 3 片，硅
胶干燥后运回实验室备用。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 DNA 的提取与检测 基因组 DNA 的提取
与分离参照 Doyle 等(1987)提出的 CTAB 法，并在
此基础上进行了改良，具体详见 Zhao 等 (2011)和
赵鹏等(2012)。采用分光光度计和琼脂糖凝胶电
泳检测基因组 DNA 的浓度和纯度。
1. 2. 2 ITS 序列的 PCＲ 扩增、检测与测序 核糖体
内转录间隔区 ITS 的 PCＲ 扩增引物序列参考 Zhao
等(2011 )，由上海生物工程公司 ( Sangon Biotech
Co．，Ltd．，Shanghai)合成(F: 5-TCCTCCGCTTATTG
ATATGC-3; Ｒ: 5-CCTGCGGGCGGGGACCTC -3)，
2 × Taq PCＲ Mix (20 mmol·L － 1 Tris-HCl，pH8. 3，
0. 1 U Taq polymerase，500 μL dNTPs，3 mmol·L － 1
MgCl2，100 mmol·L
－ 1 KCl 以及其他稳定剂和增强
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第 12 期 胡昳恒等: 秦岭地区核桃自然群体和栽培群体的遗传多样性及其演化关系———基于 nrDNA ITS 序列分析
剂)购自润德生物技术有限公司(ＲUNDE，西安)，牛
血清 蛋 白 ( Bovine Serum Albumin， BSA ) 购 自
Promega 公司 ( Madison，Wisconsin，USA )。采用
25 μL的 PCＲ 扩增反应体系，在 Zhao 等(2011)的基
础上做了改进: 模板 DNA 2 μL (50 ng·μL － 1 )，2 ×
Taq PCＲ Mix 12. 5 μL，正 反 向 引 物 各 1. 0 μL
(10 μmol·L － 1)，BSA (0. 5 mg·mL － 1 ) 2. 0 μL，H2O
6. 5 μL。PCＲ 扩增程序为: 94 ℃ 变性 3 min; 94 ℃
变性 15 s，50 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1. 5 min，35 个
循环; 72 ℃后延伸 10 min，置 4 ℃保存。
PCＲ 扩增产物采用 2. 5%的琼脂糖凝胶电泳进
行检测，溴化乙锭染色，凝胶成像仪 ( 75312 Bad
Wildbad，Germany)分析。检测后由上海生工生物工
程有限公司进行测序。
表 1 秦岭地区 29 个核桃群体的地理与样品信息①
Tab． 1 Geographic and sample information of 29 Juglans regia populations at Qinling Mountains
采集地
Collection site
类型
Type
群体代码
Population
code
个体数
Sample size
经度
Longitude(E)
纬度
Latitude(N)
海拔
Elevation /m
陕西铜川市 Tongchuan，Shaanxi C TC-C 10 108°5642″ 34°5350″ 738
陕西西安西郊 The western suburbs，Xi’an，Shaanxi C XJ-C 23 108°8291″ 34°2660″ 690
陕西西安长安区沣裕口
Fengyukou，Chang’an，Xi’an，Shaanxi
C FY-C 10 108°8138″ 34°0337″ 1 300
陕西宝鸡麟游县 Linyou，Baoji，Shaanxi C LY-C 6 107°6211″ 34°4435″ 1 250
陕西岐山县安乐镇 Anle，Qishan，Shaanxi C AL-C 5 107°7613″ 33°9588″ 1 200
陕西商洛市商州区 Shangzhou，Shangluo，Shaanxi C SZ-C 6 109°9324″ 33°8600″ 1 120
陕西安康宁陕县广货街
Guanghuojie，Ningshan，Ankang，Shaanxi
C NS-C 8 108°4522″ 33°4517″ 1 000
陕西汉中勉县同沟寺镇
Tonggousi，Mianxian，Hanzhong，Shaanxi
C TG-C 10 106°4530″ 33°1002″ 546
陕西宝鸡岐山县蔡家坡
Caijiapo，Qishan，Baoji，Shaanxi
C QS-C 15 107°3611″ 34°1135″ 1 300
黑龙江伊春市 Yichun，Heilongjiang C YC-C 12 128°5048″ 47°5068″ 258
陕西西安临潼区骊山 Lishan，Lintong，Xi’an，Shaanxi W LS-W 10 109°1622″ 34°2156″ 1 200
陕西渭南华县 Huaxian，Weinan，Shaanxi W HX-W 16 109°7722″ 34°5121″ 1 400
陕西商洛洛南县 Luonan，Shangluo，Shaanxi W LN-W 17 110°1412″ 34°0901″ 1 300
陕西西安翠华山 Cuihua Mountain，Xi’an，Shaanxi W CHS-W 16 109°0052″ 33°5828″ 1 500
陕西西安长安区沣峪口
Fengyukou，Chang’an，Xi’an，Shaanxi
W FY-W 16 108°4859″ 34°0204″ 800
陕西西安户县朱雀国家森林公园
Zhuque National Forest Park，Huxian，Xi’an，Shaanxi
W ZQ-W 15 108°3250″ 33°4956″ 1 200
陕西西安户县太平国家森林公园
Taiping National Forest Park，Huxian，Xi’an，Shaanxi
W TP-W 9 108°5732″ 33°7839″ 1 200
陕西安康紫阳县 Ziyang，Ankang，Shaanxi W ZY-W 17 108°5311″ 32°5217″ 458
陕西安康宁陕县广货街
Guanghuojie，Ningshan，Ankang，Shaanxi
W NS-W 10 108°7022″ 33°7612″ 1 200
陕西安康石泉县 Shiquan，Ankang，Shaanxi W SQ-W 20 108°2412″ 33°0512″ 716
陕西商洛镇安县 Zhen’an，Shangluo，Shaanxi W ZA-W 14 109°1522″ 33°2356″ 1 178
陕西商洛柞水县 Zhashui，Shangluo，Shaanxi W ZS-W 10 109°1022″ 33°3511″ 995
陕西汉中勉县茶店镇
Chadian，Mianxian，Hanzhong，Shaanxi
W CD-W 9 106°2805″ 33°0943″ 743
陕西西安周至县黑河国家森林公园
Heihe National Forest Park，Zhouzhi，Xi’an，Shaanxi
W HH-W 13 108°0202″ 33°5303″ 1 003
陕西宝鸡陈仓区 Chenchang，Baoji，Shaanxi W CC-W 16 107°1814″ 34°1227″ 1 094
陕西商洛山阳县 Shanyang，Shangluo，Shaanxi W SY-W 15 109°5309″ 33°2959″ 1 100
甘肃省麦积山 Maiji Mountain，Gansu W MJS-W 12 106°1848″ 34°1912″ 1 450
陕西柞水县营盘镇 Yingpan，Zhashui，Shaanxi W PY-W 6 107°3712″ 34°3022″ 950
四川峨眉山中峰寺
Zhongfengsi，Emei Mountain，Sichuan
W ZFS-W 13 103°2419″ 29°3403″ 829
合计 Sum 359
①W: 自然 Wild; C: 栽培 Cultivated．
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林 业 科 学 50 卷
1. 3 数据分析
对核桃 359 个个体的 PCＲ 扩增片段测序后，使
用软件 BioEdit v． 7. 0. 9 对测序结果进行排列、比对
和校正 ( Hall，1999 )。使用 DnaSP 5. 10. 1 软件
(Librado et al．，2009)分析核苷酸多态性(π)、单倍
型个数 (H)、单倍型多样性(H d )等遗传多样性指
标。群 体 遗 传 分 化 系 数 ( coefficient of gene
differentiation) G ST和 N ST均利用软件 DnaSP 5. 10. 1
和 PEＲMUT(http:∥www． pierroron． inra． fr / genetics /
labo / Software /Permut)计算(Ｒaymond et al．，1995)。
运用软件 MEGA5. 0(Tamura et al．，2011)溯祖理论
推测单倍型间的亲缘关系，构建 ITS 序列单倍型的
邻接(Neighor-joining，NJ)系统发育树与最大似然法
(Maximum Likelihood，ML)系统发育树。同时，利用
软件 MEGA5. 0 计算得出的群体间遗传距离 (Nei，
1972)进行 29 个群体 NJ 与 ML 系统发育树的构建。
采用软件 Network 4. 2. 0. 1 基于最大简约性原则的
中间连接网法分析 (median-joining networks)，构建
不同单倍型间的网络关系图( Bandelt et al．，1999;
http:∥ www． fluxus-engineering． com )。利用软件
Arelequin3. 11 中的 AMOVA ( Analysis of Molecular
Variance)分析方法(Excoffier et al．，2005)分别检测
自然群体间和群体内的遗传变异。利用 DnaSP 5. 1
软件对自然群体和栽培群体之间的基因流(Nm )进
行估算，并对所有群体进行 Tajima’s、Fu and Li’s 的
中性检验，以确定目标 DNA 序列在进化过程中是否
遵循中性学说( Tajima，1989; Fu et al．，1993); 并
利用该软件对所有群体的动态扩张进行失配分布分
析 ( Mismatch Distribution Analysis ) ( Ｒogers et al．，
1992)。应用 IBD 软件 (Wright，1943; Bohonak，
2002; http:∥ ibdws． sdsu． edu / ～ ibdws /)中 IBDWS
方法( Jensen et al．，2005)对群体遗传距离与地理距
离间的相关性及遗传距离与海拔之间的相关性进行
Mantel 检验。
2 结果与分析
2. 1 核苷酸多态性分析
对 19 个核桃自然群体 254 个个体与 10 个核桃
栽培群体 105 个个体进行 ITS 序列测定和比对，得
到长度为 746 bp 碱基的序列，该序列 GC 核苷酸含
量占总核苷酸的 55. 9% ; 总突变位点 32 个，单倍型
多样 性 为 0. 412。平 均 核 苷 酸 多 态 性 ( π ) 为
0. 005 5，单倍型多样性(H d )为 0. 274，群体单倍型
多样性范围为 0 ～ 0. 679。其中，19 个自然群体的
核苷酸多态性(π)为0. 007 4，单倍型多样性(H d)为
0. 389; 10 个栽培群体的核苷酸多态性 ( π ) 为
0. 003 6，单倍型多样性(H d )为 0. 159。核苷酸多态
性较大的群体有宁陕县广货街 (NS-W)、安康市石
泉县(SQ-W)、太平国家森林公园 ( TP-W)、朱雀国
家森林公园(ZQ-W)、西安市西郊(XJ-C)、峨眉山中
峰寺(ZFS-W)。检测核桃 359 个个体的核糖体内转
录间隔区( ITS)的序列变异，共发现了 18 个单倍型。
其中单倍型 H7 出现频率最高，有 26 个群体拥有此
单倍型，仅有 3 个群体(YC-C，CHS-W 及 ZQ-W)未
见分布。单倍型 H14 次之，主要分布于 10 个群体，
分别为栽培群体黑龙江伊春(YC-C)、宝鸡岐山县蔡
家坡(QS-C)、西安市西郊 (XJ-C)以及自然群体渭
南市华县(HX-W)、甘肃省麦积山(MJS-W)、宁陕县
广货街(NS-W)、朱雀国家森林公园 ( ZQ-W)、商洛
市洛南县( LN-W)、商洛市镇安县 ( ZA-W)、商洛市
山阳县(SY-W)。黑龙江伊春(YC-C)仅拥有一种单
倍型 H14，且为古老特有单倍型，而秦岭地区多个群
体共享此单倍型(图 1b，d)。除了 H7 与 H14 单倍
型外，其余一些特有单倍型仅分布在少数或单个群
体中，如单倍型 H2 仅分布于西安翠华山(CHS-W)
群体，H4 与 H6 仅分布于安康市石泉县( SQ-W)群
体，H12 仅分布于太平国家森林公园 ( TP-W)群体
(图 1b)。此外，西安翠华山(CHS-W)、安康市石泉
县(SQ-W)、宁陕县广货街(NS-W)与朱雀国家森林
公园(ZQ-W)4 个核桃自然群体的单倍型多样性最
高，分别为 0. 679，0. 543，0. 343，0. 222，从单倍型地
理分布图可看出上述 4 个群体中多数拥有各自的特
有单倍型(图 1)。
2. 2 群体遗传结构分析
对检测到的 18 个单倍型基于最大简约性原则
的中间连接网法分析进行单倍型网络图构建，结果
显示: 在整个单倍型网络图中，18 个单倍型的拓扑
结构呈双星形分布的基因树，单倍型 H7 和 H14 位
于整个网络图的中心部位，为核心的古老单倍型，且
广泛分布于多数自然群体与栽培群体中。其余单倍
型分别经过一步或多步突变而成为较为年轻的单倍
型分散在网络图的外部节点(图 1e)。H7 单倍型最
古老，由该单倍型经过一步突变或演化成 4 种单倍
型，分别为 H11，H15，H16 与 H14。其中，H15 单倍
型分布在西安市西郊栽培群体中(XJ-C)，且为该群
体特有单倍型; H16 分布于朱雀国家森林公园自然
群体中(ZQ-W)，也为该群体特有单倍型; H11 单倍
型分布于朱雀国家森林公园 ( ZQ-W)、宁陕县广货
街(NS-W) 与安康市石泉县 ( SQ-W) 3 个自然群体
中，地理位置在秦岭中南部。
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第 12 期 胡昳恒等: 秦岭地区核桃自然群体和栽培群体的遗传多样性及其演化关系———基于 nrDNA ITS 序列分析
图 1 秦岭地区核桃群体 ITS 序列单倍型地理分布与单倍型网络
Fig． 1 Geographical distribution of ITS haplotypes and network of haplotype for 29 populations of Juglans regia
饼图代表各单倍型在该群体中的分布比例，标注框内不同颜色代表不同的 ITS 序列单倍型，圆圈的大小表示群体样品采集数量的多少。
群体代号同表 1，黑色表示核桃栽培群体、蓝色表示核桃自然群体。a 为 29 个核桃群体采样分布图，b 表示秦岭地区采样与单倍型分布
放大图; c 表示对照地区四川省中峰寺核桃采样地点与单倍型分布图; d 表示对照地区黑龙江省伊春核桃采样地点与单倍型分布图; e
表示单倍型网络拓扑结构图。
Different patterns were assigned for each haplotype according to the legend at the right side of the figure． Circumference size indicates that the
number of each population． Population symbols are identified in Tab． 1． The black color of population names indicates that cultivated walnut
population and the blue color of population names indicates that wild walnut population．‘a’indicates geographical distribution of 29 populations
of J． regia; ‘b’indicates that geographical distribution of ITS haplotypes for Qinling mountains; ‘c’indicates that geographical distribution of
ITS haplotypes for population of Sichuan province ( ZFS) ; ‘d’ indicates that geographical distribution of ITS haplotypes for population of
Heilongjiang province (YC) ; ‘e’indicates that network of haplotype based on ITS data．
秦岭地区自然核桃群体的分子差异分析
(AMOVA)结果显示，自然群体的 ITS 遗传变异中，
群体间变异为 46. 6%，群体内的变异 53. 4%，即遗
传变异主要存在于群体内(表 2)。上述结果说明该
地区 ITS 序列在核桃自然群体间的分化比较明显。
DnaSP 5. 1 软件检测结果显示，核桃自然群体和栽
培群体之间的基因流(Nm )非常明显，为 48. 62。软
件 PEＲMUT 分析秦岭地区核桃群体的遗传分化系
数 G ST值为 0. 067，N ST值为 0. 074，N ST值没有明显高
于 G ST值，表明各居群间并无明显的谱系地理学结
构。应用 IBD 软件(Wright，1943; Bohonak，2002)
分析 19 个自然群体遗传距离与地理距离间以及遗
传距离与海拔间的相关性，结果显示，自然群体遗传
距离与地理距离以及海拔间的相关性均不显著( r =
0. 197 5，P ＞ 0. 05; r = 0. 097 8，P ＞ 0. 05)。
2. 3 系统发育树的构建
运用软件 MEGA4. 0 构建了 ITS 序列的最大似
然树(ML)与邻接树(NJ)，分支上的数字表示自展
支持率。由图 2 可以看出，这些单倍型一共被分为
2 支，其中单倍型 H7，H14，H11，H12，H3，H15，H5，
H6，H2，H16，H1，H4 聚为一大支，单倍型 H10，H17，
H8，H9，H13，H18 聚为一大支，自展支持率为 99%。
其中，H7，H14 一支在单倍型网络图中为古老单倍
型，而 H10，H17，H8，H9，H13，H18 一支为新演化而
来的单倍型，且网络进化图表明是由 H14 单倍型经
过突变而在不同群体中形成的。18 个单倍型中，有
古老单倍型经过一步突变形成 4 种不同单倍型，而
单倍型 H14 又经过 1 次至多次突变形成多个其他
单倍型(图 2a)。秦岭地区核桃自然群体和栽培群
体分成两大支: 自然群体宁陕(NS-W)、朱雀国家森
林公园(ZQ-W)以及栽培群体黑龙江伊春(YC-C)、
宝鸡岐山县蔡家坡(QS-C)4 个群体为一支，剩余群
体分为一支。结果表明，秦岭地区核桃栽培群体和
自然群体在核糖体内转录间隔区( nrDNA ITS)序列
上没有明显的差异。从地理分布上看，秦岭南北核
桃群体无明显的谱系地理结构，但东北地区栽培核
桃(YC-C)及四川中峰寺核桃自然群体( ZFS-W)却
分布到分子系统发育树的 2 个分支上。
15
林 业 科 学 50 卷
表 2 基于 ITS 序列的秦岭核桃自然群体 AMOVA 分析
Tab． 2 Analysis of molecular variance (AMOVA) for the natural populations of Juglans regia
at Qinling Mountains based on ITS sequences
变异来源
Source of
variation
自由度
DF
离差平方和
Sum of squares
均方
Mean square
变异组成
Variance of
components
变异比例
Percentage of
variation (% )
P
群体间 Among populations 18 1 428. 35 79. 35 6. 35 46. 60 ＜ 0. 001
群体内 Within populations 236 1 454. 28 6. 16 7. 28 53. 40 ＜ 0. 001
总体 Total 254 2 880. 63
图 2 基于 ITS 单倍型构建的最大似然树与邻接树
Fig． 2 Neighor-joining(NJ) and Maximum Likelihood(ML) trees for 29 Juglans regia populations or
18 haplotypes based on nrDNA ITS sequence
a． 18 个单倍型最大似然树与邻接树; b． 29 个核桃群体最大似然树与邻接树。
a． Neighor-joining(NJ) and Maximum Likelihood(ML) trees of 18 haplotypes;
b． Neighor-joining(NJ) and Maximum Likelihood(ML) trees of 29 Juglans regia populations．
2. 4 中性检验与失配分析
利用 DnaSP 5. 1 软件对所有群体进行中性检验
(Tajima，1989; Fu et al．，1993)，检验结果表明:所
有群体的 Tajima’s D 为不显著负值 ( Tajima’s D:
－ 0. 599 18，P ＞ 0. 10)，Fu and Li’s均为正值，统计
检验也不存在显著性( Fu and Li’s D 为0. 881 8，
P ＞ 0. 10; Fu and Li’s F 为0. 304 3，P ＞ 0. 10)，表明
秦岭核桃群体均未经过扩张事件。利用 DnaSP 5. 1
对单倍型进行失配分析，若群体经历了扩张或瓶颈
效应，将导致失配分布曲线呈现单峰; 若群体处于
动态平衡或缓慢衰退状态，没有经历扩张，则失配分
布曲线为双峰或多峰 ( Tajima，1989; Fu et al．，
25
第 12 期 胡昳恒等: 秦岭地区核桃自然群体和栽培群体的遗传多样性及其演化关系———基于 nrDNA ITS 序列分析
1993)。结果显示，失配分布曲线呈双峰曲线 (图
3)，也表明秦岭地区核桃群体均没有经历扩张。
图 3 ITS 片段单倍型的失配分析
Fig． 3 Mismatch distribution analysis for ITS segment haplotype
3 讨论
3. 1 遗传多样性与遗传结构分析
秦岭地区 29 个核桃群体 359 个个体的核苷酸
多态性 π 值为 0. 005 5，单倍型多样性 H d为 0. 274。
与其他物种群 体比较相对 偏低，如 中 国 樱 桃
(Cerasus pseudocerasus)单倍型多样性为 0. 559(何文
等，2014)，绵参 ( Eriophyton wallichii) 为 0. 908 (王
晓雄等，2011)。研究者普遍认为，多年生、分布广、
异交且风媒的木本植物的遗传多样性水平高
(Hamrick et al．，1992; Nybom，2004)。本研究核桃
遗传多样性较低的原因可能为: 核桃雌雄同株异
花，属风媒植物，自然群体间及其与栽培群体间基因
交换频繁，而栽培核桃个体通常为扦插或嫁接的无
性繁殖，不同地区核桃的遗传基础趋于相似，繁育系
统是核桃群体遗传多样性的主要影响因素(Hamrick
et al．， 1992; Nybom， 2004; Christopoulos et al．，
2010; Ciarmiello et al．，2011)。自然核桃群体单倍
型多样性(H d = 0. 389)为栽培群体(H d = 0. 159)的
2. 4 倍，进一步证明了这种假设。
秦岭地区核桃自然群体遗传变异主要发生在群
体内(表 2)，自然群体与栽培群体基因交流非常明
显(Nm = 48. 62 )。该研究的群体遗传分化系数
(G ST = 0. 067)低于利用等位酶(G ST = 0. 105)与 SSＲ
标记(F ST = 0. 135)对核桃群体研究的结果( Fornari
et al．，2001; 王滑等，2007)，也低于用 SSＲ 标记对
美国黑核桃( J． nigra) (F ST = 0. 017)群体的研究结
果(Victory et al．，2006)。Hamrick(1987)报道的 4
种针叶树的 Nm值为 5. 3 ～ 37. 8，本文核桃栽培群体
与自然群体之间基因流明显高于王滑等 (2007)对
我国核桃 ( Nm = 1. 028 ) 和铁核桃 ( J． sigillata )
(Nm = 3. 18)的研究。可能原因: 一是，核桃栽培历
史悠久，不同区域出现相互间的种质交流，导致栽培
群体与自然群体之间存在较强的基因流 (王滑等，
2007; Liu et al．，2014 );同时，核桃果仁营养价值
高，由于人类活动及商业活动引起核桃果实的传播，
不同地区之间可能存在长距离的交换现象(Gunn et
al．，2010; Pollegioni et al．，2011)。二是，核桃为风
媒植物，由于季风气候的影响，不同群体之间存在花
粉交流现象，自然群体和栽培群体之间有明显的单
倍型共享现象(图 1)(Gugger et al．，2013)。
3. 2 ITS 单倍型地理分布、物种的历史动态与谱系
地理格局
从 18 个单倍型多样性地理分布来看，西安翠华
山(CHS-W)、朱雀国家森林公园(ZQ-W)、安康市石
泉县(SQ-W)及宁陕县广货街(NS-W)4 个核桃自然
群体的单倍型不同于其他核桃群体，具有明显的独
特单倍型(图 1)。可能原因为: 核桃可能与该地方
其他胡桃属植物发生基因渐渗，形成新的单倍型
(Du et al．，2009)，或者经过长期环境选择压力与人
工选择演化出了部分特有基因单倍型( Liu et al．，
2014)。从单倍型网络图中不难看出，单倍型 H7 与
H14 为古老单倍型(Crandall et al．，1993)，其他地区
特有单倍型可能是从上述 2 种单倍型经过基因突变
演化而来，例如翠华山 ( CHS-W)具有特有单倍型
H1，H2，H5，H6，乃经过 1 步或 2 步突变形成的。上
述 4 个核桃自然群体(CHS-W，ZQ-W，SQ-W，NS-W)
单倍型多样性高，也包含有古老单倍型 H7 与 H14，
且位于秦岭地区中心位置，故推断其可能为秦岭地
区核桃遗传多样性中心，也可能为冰期避难所(Bai
et al．，2010)。此外，四川峨眉山中峰寺(ZFS-W)与
黑龙江伊春(YC-C)的核桃群体，与秦岭地区相距甚
远(与秦岭核桃群体的平均地理距离分别为 2 175
km 与 690 km)，有趣的是，峨眉山中峰寺 ( ZFS-W)
自然群体仅拥有古老单倍型 H7，黑龙江伊春(YC-
C)栽培群体仅拥有古老单倍型 H14，秦岭地区所有
群体均共享古老单倍型 H7 与 H14，且秦岭北坡群
体共享单倍型 H14 较多，秦岭南坡共享单倍型 H7
较多(图 1)，证明秦岭地区也可能为核桃的冰期避
难所(Bai et al．，2010)，气候变暖后向南北方向迁移
并演化出其他单倍型(Crandall et al．，1993)，也可能
由于偶然的长距离扩散或基因交流形成(王晓雄
等，2011)。
经过 3 种不同的检验方法: Fu and Li’s 检验、
Tajima’s D 分析和失配分布分析，结果均表明秦岭
地区核桃自然群体在近期历史上没有经历群体的扩
张(Tajima，1989; Fu et al．，1993)。由群体遗传分
35
林 业 科 学 50 卷
化系数分析知，N ST值没有明显高于 G ST值，因此推断
秦岭地区核桃自然群体没有明显的谱系地理结构
(Pons et al．，1996)。本文研究的结果与先前研究过
的胡桃属植物基本相同(Bai et al．，2010; Stanford et
al．，2000)，这可能是由于第四纪冰期气候波动与秦
岭地区地形以及人类驯化历史的组合效应。是否存
在其他胡桃属植物基因杂交渐渗及人为活动对核桃
遗传结构的影响有待进一步研究。经过 Mantel 检
验表明 19 个核桃群体的地理距离和遗传距离间不
存在相关性( r = 0. 197 5，P ＞ 0. 05)，也说明地理隔
离对群体分化的影响不大。这与一些学者的研究结
果相一致，如水杉 (Metasequoia glyptostroboides)、紫
椴 ( Tilia amurensis )、秀 雅 杜 鹃 ( Ｒhododendron
concinnum)、红锥(Castanopsis hystrix)的研究结果均
显示遗传距离与地理距离间不存在显著相关性(李
晓东等，2003; 穆立蔷等，2007; 赵冰等，2012; 徐
斌等，2013)。如果对该地区物种的历史动态与谱
系地理格局进行深入研究，仍需结合更多的遗传标
记与数据 ( Hamrick et al．，1992; Aradhya et al．，
2007; Delplancke et al．，2011)。
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