全 文 ：第 !" 卷 第 #$ 期
% $ # # 年 #$ 月
林 业 科 学
&’()*+(, &(-.,) &(*(’,)
./01!"!*/1#$
2345!% $ # #
松材线虫虫体特异表达 3H*,文库的构建与分析!
黄6麟6徐旭凌6李6超6叶建仁6吴小芹
"南京林业大学江苏省有害生物入侵与控制重点实验室6南京 %#$$7"$
摘6要!6松材线虫取食和致病相关基因的鉴定是揭示松材线虫病致病机制的重要研究内容& 以松材线虫混合虫
体为测试方!线虫卵为驱动方!构建二者差减 3H*,文库& 文库测序结果经序列拼接%功能注释!共获得松材线虫
虫体特异表达的有效 )&+序列 79! 个!拼接后获得 7! 个重叠群!其中 #9 个重叠群获得明确的功能注释!其中
fD_’#%%fD_’%9%fD_’77 分别与过氧化物酶%&A#!! 内切葡聚糖酶 %锌指家族蛋白有较高的同源性!这些基因被认
为与植物线虫的取食和致病性密切相关& k+AS’k分析验证了所获得的差减 3H*,的代表性&
关键词’6松材线虫# 混合虫体# 致病相关基因# 抑制差减杂交
中图分类号! &"871#666文献标识码!,666文章编号!#$$# A"!::"%$####$ A$$;: A$8
收稿日期’ %$#$ A#$ A#9# 修回日期’ %$## A$9 A#%&
基金项目’国家自然基金项目"7#$$$7$7$ # 江苏省自然科学基金项目"GB%$#$988$ # 国家重点基础研究发展计划"%$$;’G##;%$$$ &
!叶建仁为通讯作者&
:HK=6%2-#-9 3,’/$-<:$%,’#’(=’#&9/%/,0H%00*-*’$%#&9 MO"-*//*(%’
D%O*(!$#4*K*+#$,(*,01"*)$’,.%.0#,")<&%+’,/%")
TPIFE-DF6LP LP0DFE6-D’?I/6ONJDIFCNF6RP LDI/lDF
"X-12+&0 8%(91:#$1’#$(;#$@$%5%2’-#2 12A I121+%G%2’#;C251&-#2 ,=%.-%&! F12Q-2+ "#$%&’$(42-5%$&-’(6F12Q-2+ %#$$7"$
=2/$-#:$’6(UNF4DXD3I4D/F /XFN@I4/UNXNNUDFEIFU KI4?/ENFD3D4W‘CN0I4NU ENFNV/XD0$&1=/%*%2./0&E(*#=/-*0&MIV3CD4D3I04/
CN[NI04?N@/0N3P0IC@N3?IFDV@/X4?NSDFNR//U HDVNIVN"SRH$5(F 4?DVV4PUW! IVPKKCNVVD/F VPY4CI34D[N?WYCDUD^I4D/F
"&&T$ 3H*,0DYCICWMIV3/FV4CP34NU XC/@4?N@D_NU V4IENFN@I4/UN3H*,/XD!E(*#=/-*0&DV/0I4N,*#;Q#! M?D3? MIV
UCD[NF YW4?NNEE3H*,/X,*#;Q#1,4/4I0/X7! 3/F4DEVENFNCI4NU XC/@79! )&+VIX4NC3H*,VNlPNF3DFEMNCN/Y4IDFNU5
,@/FE4?N@ #9 3/F4DEVMNCNXPF34D/FI0WIFF/4I4NU5’/F4DEV! fD_’#%! fD_’%9 IFU fD_’77 ?IU ?DE? ?/@/0/EWMD4?
SNC/_DUIVN! GN4I‘#! !‘NFU/E0P3IFIVN! D^F3XDFENCXI@D0WKC/4NDF DF 4?NUI4IYIVN! CNVKN34D[N0W5+?NENFNVMNCN3/FVDUNCNU
30/VN0WCN0I4NU 4/4?NXNNUDFEIFU KI4?/ENFD3D4WKC/3NVVNV5k+‘S’kIFI0WVDV3/FXDC@NU 4?NCNVKN34D[N/X4?N&&T3H*,V5
>*9 ?,-(/’ 6 D0$&1=/%*%2./0& E(*#=/-*0&# @D_NU V4IEN FN@I4/UN# KI4?/ENFD3D4W‘CN0I4NU ENFN# VPKKCNVVD/F
VPY4CI34D[N?WYCDUD^I4D/F
66松材线虫病是松树的一种毁灭性病害!由于机
制尚未十分清楚!致使该病的防治技术研究进展缓
慢!疫情在我国呈不断扩散蔓延之势 "张星耀等!
%$$7# 徐华潮等!%$#$# 谈家金等! %$$7# 潘宏阳等!
%$$;$& 松材线虫 "D0$&1=/%*%2./0&E(*#=/-*0&$取食
和致病性相关基因的研究是揭示该病致病机制的关
键& 松材线虫的发育阶段从形态特征上!可以明显
区分为卵%J%%J7%J! 幼虫和雌雄成虫 9 个阶段!从 J%
幼虫开始具备了取食树木细胞和真菌菌丝体的特点
"刘维志! %$$$# 瞿红叶等! %$$; $& 与根结线虫
"I%*#-A#+(2%VKK5$和胞囊线虫"M%’%$#A%$1 VKK5$等
只能从寄主植物活体细胞摄取营养不同!松材线虫
不仅能够取食树木细胞!也能取食部分真菌培养物
"杨宝君等! %$$7# 瞿红叶等! %$$;$!这为松材线虫
的扩繁和线虫样本的收集提供了方便& 为了分离松
材线虫取食和致病相关基因!本试验以松材线虫混
合虫体作为测试方!以松材线虫卵为驱动方!构建二
者的抑制差减 3H*,文库!并对文库测序获得的
)&+进行分析!以期筛选获得部分松材线虫取食和
致病相关基因&
#6材料与方法
@F@A线虫材料
松材线虫 ,*#;Q# 家系虫株由南京林业大学
森林病理学实验室保存& 线虫接种在灰葡萄孢
"D#’$(’-&.-2%$%1$的培养介质上进行扩繁!线虫收集
后经 $1%>的硫酸链霉素消毒 7$ @DF!灭菌生理盐
水洗涤 7 遍& 将经表面消毒后的线虫置于新鲜的灰
6第 #$ 期 黄6麟等’ 松材线虫虫体特异表达 3H*,文库的构建与分析
葡萄孢培养基上%9 d恒温培养!待线虫取食完全
后!采用 GINC@IFF 漏斗法收集线虫& 并按 BDZP3?D
等"%$$!$的方法洗涤线虫!去除残留的灰葡萄孢菌
丝!收集获得线虫混合虫体&
为了收集线虫卵!洗涤后的线虫放入直径为
; 3@的无菌玻璃培养皿中!%9 d恒温放置过夜待线
虫产卵& 线虫卵壁的粘性物质使得卵很容易粘附在
培养皿底部!而线虫则悬浮在水中!此时倒去线虫悬
浮液并用无菌水冲洗 7 次!在显微镜下挑弃培养皿
底部残余的线虫后!加入少量纯水!并用柔软的毛刷
刷下线虫卵!悬浮在水中的卵通过离心收集后保存
于 k*,0I4NC中! A%$ d长期保存备用& 多次收集合
并后的线虫卵用于 k*,提取&
@FCA试剂
k*,CNIENF4购自(F[D4C/ENF 公司# 消减文库试剂
盒"GHS’kA&N0N34+f 3H*, &PY4CI34D/F BD4$购自
’0/F4N3? 公司# Kh)fA+.N34/C购自 SC/@NEI公司#
H*,S/0W@NCIVN和内切酶等购自 +IBIkI公司# H*,
fICZNC.购自+CIFVENF公司# 其余试剂均为分析纯&
@FEAQK=制备
将提取总 k*,所用的研钵和塑料制品用
$1#>的 H)S’水浸泡过夜!高温灭菌处理!$ @DF!
以除去 k*IVN!放置备用& 所用溶液均用 $1#>的
H)S’水配制& 总 k*,的提取按照 +CD^/0试剂使用
说明书进行!获得的提纯 k*,经 H*IVN(处理去除
残留 H*,&
@FGA抑制消减杂交
抑制消减杂交根据 ’0/F4N3? 公司 GHS’kA
&N0N34+f3H*,&PY4CI34D/F BD4说明书进行&
@FNA文库测序与序列分析
抑制消减产物经 % 轮 S’k富集差异表达 3H*,!
S’k产物经纯化后连接 Kh)fA+载体!转化 Jf#$;!
获得差减3H*,文库& 随机挑取阳性克隆送上海英骏
公司进行测序& 对获得的测序结果经 ’Tk2f)软件
去除载体序列!获得)&+序列& 并采用 &Nl@IF (软件
对获得的 )&+进行序列拼接!获得重叠群"’/F4DEV$&
所有’/F4DEV运用 G-,&+_程序在 *’G("?4K’aaMMM5
F3YD5F0@5FD?5E/[a$非冗余蛋白数据库中进行比对分
析!)A[I0PN域值设置为)A!&
@FVA差异表达基因的半定量 Q)c.3Q
根据测序及序列比对结果!选取部分 ’/F4DEV!
设计引物!以看家基因 3.’-2 为参照进行 k+AS’k
分析!每个试验独立重复 7 次& 试验中所用引物及
序列见表 #&
表 @A半定量 Q)c.3Q所用引物
)#2B@A.-%+*-/引物名称 SCD@NCFI@N 正向引物序列"Q$ Q/CMICU KCD@NCV"Q$ 反向引物序列"k$ kN[NCVNKCD@NCV"k$
fD’# ’h,+’’+,,hh’,’,hh’+,, +h’,h’h’,,+’’,’,,h+
fD’#% hh’+h,hh’h,’hh,+,h, ++’’’’,h+hh’’++’’+
fD’%9 ’,h+’’’,,+,+’+’h+hh++++ ++h+h+++’+hh’’h++’+,h,
fD’77 ’,h’,’h,’hhh+,+h,+’, hh’,+h++’,,h,,’hh’,+,+
3.’-2 h’,,’,’hh,h++’h++h+,h, h+,+’h+’,’’,,’+hhh,+h,
66
%6结果与分析
CF@ (/:HK=合成与 :)$#酶切效率分析
总 k*, 在反转录酶的作用下反转录合成
UV3H*,!3H*,片段主要集中在 $19 c%19 ZY 间!经
>&1 %酶切生成平端的 3H*,片断用于后续的接头
连接反应!>&1 %酶切后的 3H*,片段集中在 $1% c
#1$ ZY"图 #$& 经 %>琼脂糖凝胶电泳检测表明获
得了较高的酶切效率&
CFCA接头连接效率分析
UV3H*,经 >&1 %酶切消化后!分别连接不同的
接头 ,UIK4/C# 和 ,UIK4/C%k& 以看家基因 3.’-2 特
异引物 ,’+(*k与接头引物 S’kSCD@NC# 配对进行
S’k!获得的扩增产物与用 3.’-2 基因上%下游引物
获得的扩增产物的比较结果来评价接头的连接效率
图 #6UV3H*,的 >&1 % 酶切
QDE5#6HV3H*,UDENV4NU YW>&1 %
"图 %$& 电泳结果表明接头的连接效率达到了
%9>以上的试验要求&
CFEA.3Q扩增
消减杂交产物经 % 次 S’k扣除背景%富集差异
;;
林 业 科 学 !" 卷6
图 %6看家基因 3.’-2 3H*,片段接头连接效率
QDE5%6)XD3DNF3WIVVNVV@NF4/X3.’-2 3H*,
XCIE@NF40DEI4NU YWIUIK4/CV
#! %’连 接 ,UIK4/C# 的 3H*,为 模 板!S’k SCD@NC#a,’+(*k%
,’+(*Qa,’+(*k为引物的 S’k产物& S’k KC/UP34VI@K0DXDNU YW
KCD@NCVN4SCD@NC#a,’+(*kIFU ,’+(*Qa,’+(*kCNVKN34D[N0WMD4? 4?N
4N@K0I4N/X?/PVN‘ZNNKDFEENFN3.’-2 3H*,0DEI4NU YW,UIK4/C#57! !’
连接 ,UIK4/C%k的 3H*,为模板!S’kSCD@NC#a,’+(*k%,’+(*Qa
,’+(*k为引物的 S’k产物& S’kKC/UP34VI@K0DXDNU YWKCD@NCVN4
SCD@NC#a,’+(*kIFU ,’+(*Qa,’+(*kCNVKN34D[N0WMD4? 4?N4N@K0I4N
3.’-2 3H*,XCIE@NF40DEI4NU YW,UIK4/C%k5
图 76虫体 3H*,的巢式 S’k扩增产物
QDE576*NV4NU S’kKC/UP34/X4?NVPY4CI34NU 3H*,V/XFN@I4/UNV
fPVK#’未消减 3H*,第 # 轮 S’k# fPVK%’未消减 3H*,第 % 轮
S’k# fPVK#!fPVK%1#V4C/PFU IFU %FU C/PFU S’k KC/UP34V/X
PFVPY4CI4NU 3H*,CNVKN34D[N0W5fVS#’消减 3H*,第 # 轮 S’k#
fVK%’消减 3H*,第 % 轮 S’k& fVS#! fVS%1#V4C/PFU IFU %FU
C/PFU S’kKC/UP34V/XVPY4CI4NU 3H*,CNVKN34D[N0W5
表达 3H*,!结果如图 7 所示& 与未消减对照相比!
经过消减后的 3H*,明显富集!获得的差异表达
3H*,片段主要集中在 %9$ c"9$ YK之间&
CFGA差减效率分析
抑制消减过程中的消减效率直接关系到消减产
物的阳性率& 为了分析消减效率!以消减后第 % 轮
S’k产物及未消减对照的第 % 轮 S’k产物为模板!
扩增看家基因 3.’-2 的 3H*,片段& 分别取 #:!%7!
%: 和 77 个循环的 S’k产物进行电泳分析& 结果如
图 ! 所示’消减的模板在 %: 个循环后才隐约出现条
带!而未消减的模板在 %7 个循环就开始出现扩增产
物!表明经过消减杂交后背景被明显降低&
图 !6消减效率的 S’k评价
QDE5!6)[I0PI4D/F /X4?NVPY4CI34D/F NXD3DNF3W
CFNA文库重组子的鉴定
构建好的消减 3H*,文库经蓝白斑筛选!菌液
S’k用 *NV4NU SCD@NC# 和 *NV4NU SCD@NC%k为引物!
所扩增的片段介于 %$$ c"$$ YK 之间"图 9$& 由于
用于构建的消减文库的 3H*,经 ! 个碱基的识别酶
>&1 %切割!理论上每 !! i%98 个碱基就有 # 个酶切
位点!插入片段大小和理论预计结果相符&
图 96消减文库的 S’k鉴定
QDE596(UNF4DXD3I4D/F /XK/VD4D[N30/FNV/X&&T
3H*,0DYCICWYWS’k@N4?/U
f’ 标准分子量 H*,@ICZNC# # A#8’ 随机挑取克隆的 S’k
产物 S’kKC/UP34VXC/@CIFU/@0WVN0N34NU 30/FNV5
CFVA抑制消减 :HK=文库的测序与分析
松材线虫虫体特异表达 3H*,文库测序共获得
79! 个有效 )&+!拼接后获得 7! 个 ’/F4DEV!长度
#$$ c%9$ YK之间的 ’/F4DEV最多!占 8$>以上!平均
长度为 %9; YK& 由于 3H*,克隆的挑选测序是随机
的!因此!# 个 ’/F4DE所包含的 )&+个数往往也反映
同一个 3H*,的表达丰度或表达频率& 从基因的表
达丰度来看!松材线虫虫体特异性表达丰度最高的
% 个 )&+被重复测序了 ": 次和 8% 次!占 )&+总数
的 %%>和 #"18>!而表达丰度较低的单次测序的
)&+有 ## 个!占 )&+总数的 71#>&
G0IV4_结果表明’松材线虫虫体特异表达的 7!
个 )&+’/F4DEV中!#9 个 ’/F4DEV有明确的功能注释!
占 ’/F4DEV总数的 !!>!分别与数据库中马来丝虫
"D$0+-1 G1*1(-$%猪蛔虫"3&.1$-&&00G$%秀丽隐杆线
$$#
6第 #$ 期 黄6麟等’ 松材线虫虫体特异表达 3H*,文库的构建与分析
虫")1%2#$/1:A-’-&%*%+12&$等动物寄生线虫和自由生
活线虫蛋白有显著的同源性"表 %$& 其中!Ck*,基
因启动子结合蛋白"Ck*,KC/@/4NCYDFUDFEKC/4NDF$%
细胞色素 S!9$"’W4/3?C/@NS!9$$%过氧化物酶家族
同源蛋白"SNC/_DUIVN?/@/0/EXI@D0W@N@YNC$%衰老相
关蛋白"&NFNV3NF3N‘IVV/3DI4NU KC/4NDF$%3,fS依赖性
蛋白激酶"3,fS‘UNKNFUNF4KC/4NDF ZDFIVN$等基因为
高丰度表达基因& fD_’#%%fD_’%9%fD_’77 分别与过
氧化物酶"SNC/_DUIVN$%&A#!! 内切葡聚糖酶"GN4IA
#!! ANFU/E0P3IFIVN$%锌指家族蛋白 "nDF3XDFENC
XI@D0WKC/4NDF$有较高的同源性!这些基因被认为与植
物线虫的取食和致病性密切相关&
表 CA松材线虫虫体特异表达的 M!)3,’$%4/功能注释结果
)#2BCA);*-*/<&$/,0M!):,’$%4/;,+,&,49 :,+"#-%/,’,0$;*+%O*(/$#4*1-<&%+’,/%")
重叠群编号
’/F4DE*/5
长度
-NFE4?aYK
拷贝数
’/KDNV
功能注释结果
HNV3CDK4D/F
物种
&KN3DNV
登录号
,33NVVD/F */5
)值
)[I0PN
分值
&3/CN
与预测功能蛋白匹配数目 fI43? MD4? KCNUD34NU XPF34D/F "#9$
fD_’# "77 ":
Ck*,基因启动子结合蛋白
Ck*,KC/@/4NCYDFUDFEKC/4NDF
马来丝虫
D$0+-1 G1*1(-
LSu$$#:;#;$% :1$)A#9 :91#
fD_’! %$9 7 线虫精子细胞的运动蛋白
*N@I4/UNVKNC@3N0@/4D0D4WKC/4NDF
猪蛔虫
3&.1$-&&00G
,,S;!::; #1$)A%$ #$%
fD_’9 %$: %
+/0‘KI0系统相关酰基辅酶 ,硫酯酶
+/0‘KI0VWV4N@‘IVV/3DI4NU I3W0‘’/,4?D/NV4NCIVN
短波单胞菌属
D$%502A-G#21&VK5
nSu$9$77%8" %1$)A$: 8%1:
fD_’; !8! %# 细胞色素
S!9$
’W4/3?C/@NS!9$ 0DZNu+GS
西瓜
)-’$0*0&*121’0&
G,H%89"; 81$)A#9 "817
fD_’#% 7#$ #% 过氧化物酶家族同源蛋白
SNC/_DUIVN?/@/0/EXI@D0W@N@YNC" K_F A#$ 猪蛔虫
3!&00G ,HO!$!99 %1$)A#8 :;1!
fD_’#8 #$! 9 衰老相关蛋白
&NFNV3NF3N‘IVV/3DI4NU KC/4NDF
马来丝虫
D!G1*1(-
LSu$$#:;#"9" 71$)A$" 9:19
fD_’#" !%9 !
3,fS依赖蛋白激酶
3,fS‘UNKNFUNF4KC/4NDF ZDFIVN
盘尾丝虫
Y2./#.%$.1 5#*50*0&
,,*":#7# !1$)A97 %##
fD_’%$ #78 7
H*,聚合酶()亚基
H*,K/0W@NCIVN(! I0K?IVPYPFD4
隐藏嗜酸菌
3.-A-=/-*-0G$(=’0G
OSu$$#%%$$!" #1$)A#: ;817
fD_’%# #"; % 富含亮氨酸重复家族蛋白
-NP3DFNCD3? CNKNI4XI@D0WKC/4NDF
马来丝虫
D!G1*1(-
LSu$$#;$$"7" 91$)A#$ 8"1:
fD_’%9 %!8 # &
A#!! A内切葡聚糖酶
GN4I‘#!!‘NFU/E0P3IFIVN
松材线虫
D!E(*#=/-*0&
,’H#%#78 "1$) A%# #$7
fD_’%8 %8" # 衰老相关蛋白质
&NFNV3NF3N‘IVV/3DI4NU KC/4NDF
地中海柏木
)0=$%&&0&&%G=%$5-$%2&
,’,7$7$# #1$)A79 #9%
fD_’7$ #99 # 转录调节因子
+CIFV3CDK4D/FI0CNEP0I4/C
绿脓杆菌
@&%0A#G#21&1%$0+-2#&1
OSu$$#7!"#:% "1$)A$! !818
fD_’%: ;8 # 肌钙结合蛋白 ’I0K/FDF 猪蛔虫 3!&00G ,HO!9#;! "1$)A#$ 8"1!
fD_’%" 7#% # 转录调节因子
+CIFV3CDK4D/FI0CNEP0I4/C
创伤弧菌
W-:$-#50*2-;-.0&
*Su;777!7 #1$)A$: 8%1:
fD_’77 %#! # 锌指蛋白家族
nDF3XDFENCXI@D0WKC/4NDF
马来丝虫
D!G1*1(-
LSu$$#:;;77! #1$)A$; 891;
与假定蛋白匹配数目 fI43? MD4? ?WK/4?N4D3I0KC/4NDF ""$
fD_’8 #!! 8% 假定蛋白
G@# u %:%8$ TWK/4?N4D3I0KC/4NDF
G@#u%:%8$ 马来丝虫
D!G1*1(- LSu$$#:;"#$# ;1$)A$" 981%
fD_’" #7% 78 假定蛋白 TWK/4?N4D3I0KC/4NDF
莱茵衣藻 )/*1G(A#G#21&$%-2/1$A’-
LSu$$#8;:;9$ #1$)A$9 9%1!
fD_’: !;7 %9 假定蛋白
G@# u #":"$ TWK/4?N4D3I0KC/4NDF
G@#u#":"$ 马来丝虫
D!G1*1(- LSu$$#:;9$7# 71$)A#9 :!17
fD_’#$ 7!9 #9 假定蛋白
G@# u $!;!$ TWK/4?N4D3I0KC/4NDF
G@#u$!;!$ 马来丝虫
D!G1*1(- LSu$$#:;%!88 #1$)A$9 9%1!
fD_’#7 !;; 8 假定蛋白
G@# u ##$%9 TWK/4?N4D3I0KC/4NDF
G@#u##$%9 马来丝虫
D!G1*1(- LSu$$#:;78"8 ;1$)A%7 ##$
fD_’#! !#7 8 保守假定蛋白 ’/FVNC[NU ?WK/4?N4D3I0KC/4NDF
人体虱 @%A-.0*0&
/0G120&.#$=#$-&
LSu$$%!%99#; 71$)A#7 9;17
fD_’#9 ";8 9 假定蛋白 TWK/4?N4D3I0KC/4NDF
青杨叶锈病 I%*1G=&#$1
*1$-.-\=#=0*-21
)hh##$"# 71$)A%! ##8
未知功能蛋白数目 qFZF/MF KC/4NDF "#%$!
66! fD_’%"#89 YK!77$ !fD_’7"##9 YK!#$ !fD_’##"%8! YK!#7$ !fD_’#:"#9" YK!!$ !fD_’#;"#89 YK!7$ !fD_’%%"#%% YK!%$ !fD_’%7"#7"
YK!%$ !fD_’%!"#:# YK!#$ !fD_’%;"#7! YK!#$ !fD_’7#"#88 YK!#$ !fD_’7%"#77 YK!#$ !fD_’7!"#99 YK!#$ & 括号中数值为重叠群长度和 )&+
拷贝数& .I0PNDF 4?NYCI3ZN4ICN4?N3/F4DE0NFE4? IFU 3/KDNV5
#$#
林 业 科 学 !" 卷6
CFWA差异表达基因的 Q)c.3Q结果
以看家基因 3.’-2 为对照对获得的差异表达的
’/F4DEV设计引物进行 k+AS’k分析!如图 8 所示&
结果表明’通过抑制差减杂交获得的差异表达的
’/F4DEV具有较高的代表性!其中 fD’#% 过氧化物酶
同源基因%fD’%9 纤维素酶同源基因和 fD’77 锌指
蛋白在混合阶段的虫体中都高量表达!而在卵中的
表达量微弱!表明差减文库具有较好的代表性&
图 86部分差异表达基因的 k+AS’k分析
QDE586&N@D‘lPIF4D4I4D[Nk+AS’kIFI0WVDV/XUDXNCNF40W
N_KCNVVNU ENFNV
,34DF’ 看家基因对照 S/VD4D[N3/F4C/03.’-2 ENFN# +ICEN4V’ 目标基因
+ICEN4ENFNV5每幅图左边条带为虫体表达水平!右侧为虫卵表达
水平& +?N0NX4YIFU @NIFV4?NFN@I4/UNN_KCNVVD/F! IFU 4?NCDE?4DV
4?NNEEN_KCNVVD/F5
76讨论
抑制消减杂交技术是 HDI43?NFZ/等 "#;;8 $建
立在基于抑制 S’k基础上的一种分离差异表达基
因技术!是目前快速鉴定差异表达基因的最有效方
法之一& 与以往种种差减杂交技术相比!&&T技术
的优势主要表现在以下几个方面’#$不同丰度的转
录子趋于一致!克服了因拷贝数目不同对试验结果
的影响!提高了差减的灵敏度# %$仅需 # 轮差减杂
交即可对差异表达的 3H*,分子达到 # $$$ 多倍的
富集# 7$假阳性率低# % 步杂交和 % 次 S’k可保证
其克隆有 ;!>为真阳性" &DNYNC4%’1*!#;;9$# !$速
度快!效率高& 一次 &&T可以同时分离到几十甚至
几百个差异表达的基因 "[/F &4NDF %’1*!#;;" $&
&&T技术也存在以下缺点’#$该技术需要几微克的
@k*,# %$由于差减库中的 3H*,已经限制酶消化!
不再是全长 3H*,!对后期基因的克隆等带来困难#
7$不能同时进行数个组织a细胞间或不同处理间的
比较# !$接头与 3H*,连接效率也会影响到获得的
消减序列的代表性& &&T自 #;;8 年报道以来!由于
其试验方法具有优越性!被迅速应用医学%生物学的
各个领域!并与其他的分子生物学技术!如 H*,芯
片技术相结合!克隆了许多相关的差异表达基因
"张轶文等! %$$9$&
在植物线虫致病性相关基因的克隆方面!&&T
技术也已经被广泛应用& hI/等"%$$#$构建了大豆
孢囊线虫"M%’%$#A%$1 +*(.-2%&$食道腺和肠的消减杂
交文库!获得了 %7 个食道腺特异表达的独立基因!
其中 #$ 个基因是含有信号肽的分泌蛋白基因!这些
基因被推测在大豆孢囊线虫的致病过程中发挥重要
作用& 与根结线虫 "I%*#-A#+(2%VKK5$和胞囊线虫
"M%’%$#A%$1 VKK5$等植物学线虫取食特性不同!松材
线虫具有能在人工培养基上取食%繁殖的特性!因
此!给获取文库构建材料提供了方便& 但松材线虫
具有世代重叠的特征!因此!在人工条件下很难获得
生长发育完全一致的虫体又给研究材料带来了较大
的背景干扰& 松材线虫的 # 龄幼虫是在虫卵内发育
完成的!从卵孵化出的 % 龄幼虫开始取食!直到完成
整个生活史& 因此!线虫卵被认为是松材线虫不具
有取食能力的虫态& 松材线虫卵与混合虫体消减文
库的构建为探讨松材线虫发育与致病性的可能分子
机制打下了基础&
氧化物酶是植物线虫破坏寄主植物防卫反应的
重要 活 性 蛋 白& 有 研 究 表 明’ 马 铃 薯 金 线 虫
"R*#:#A%$1 $#&’#./-%2&-&$真皮层能够分泌一种过氧
化物 酶 家 族 之 一 的 硫 氧 还 蛋 白 过 氧 化 物 酶
"+?D/CNU/_DF KNC/_DUIVN$来破坏寄主植物的抵御反
应!生物学活性分析表明该蛋白特异性代谢过氧化
氢!因此推测该蛋白可能具有保护线虫抵御植物防
卫的作用"k/YNC4V/F %’1*!%$$$$& 谷胱甘肽氧化物
酶是另一类生物消除过氧化氢%抵御氧胁迫的主要
方式& 有研究表明’谷胱甘肽氧化物酶其作用方式
可能有别于硫氧还蛋白过氧化物酶作用于过氧化
氢!而是作用于植物体内另一个重要的植物防卫信
号(((脂肪酸过氧化物"+IFE%’1*!#;;9# +CDKK %’
1*!#;;:$& fD’#% 片段由于经过 &&T杂交前的酶
切!片段较短!没有能够注释到具体那一类蛋白!因
此关于该基因的功能研究将依赖于该基因的全长克
隆& 在纤维素酶在植物线虫中普遍存在!是一类与
植物线虫侵染%寄生密切相关的一类基因!是植物线
虫侵染寄主植物发挥重要作用的一类活性蛋白
"BDZP3?D%’1*!%$$9# &@IF4%’1*!#;;:# k/VV/%’
1*!#;;;# h/N0FNC%’1*!%$$$# hI/%’1*!%$$% $&
纤维素酶在松材线虫致病过程中发挥重要作用!目
前已有研究对松材线虫分泌的纤维素酶进行了纯化
和性质分析 "马海宾等! %$$;# 张锴等!%$#$$& 有
研究表明’松材线虫中至少存在有 7 个基因构成的
纤维素酶基因家族"BDZP3?D%’1*!%$$9$!但 fD’%9
是否属于它们中的一类或是其他的新家族还有待于
该基因的全长 3H*,克隆与分析& 锌指蛋白在泛素
代谢中的 &’Q"&ZK#a’P0#aQAY/_$复合物中发挥重
要作用!转基因寄主植物介导的 k*,D表明该基因
%$#
6第 #$ 期 黄6麟等’ 松材线虫虫体特异表达 3H*,文库的构建与分析
在植物线虫的致病过程中发挥重要作用" &DFU?P %’
1*!%$$;$& 这些基因在松材线虫致病过程中的作
用还有待于基因全长 3H*,克隆与功能分析& 此
外!本研究获得的松材线虫虫体特异表达的 7! 个
’/F4DE中!仅有 #9 个有明确的功能注释!除了松材
线虫致病相关基因外!也包含了线虫精子细胞的运
动蛋白"FN@I4/UNVKNC@3N0@/4D0D4WKC/4NDF$%衰老相
关蛋白"VNFNV3NF3N‘IVV/3DI4NU KC/4NDF$%肌钙结合蛋
白"3I0K/FDF$等线虫繁殖和发育相关基因" &4NMIC4%’
1*!%$$9# O//F %’1*!%$$!$!其他 #% 个基因未获得
明确的功能注释!其中也包括部分表达丰度较高的
)&+!这些基因的功能及其与松材线虫取食和致病
性之间的关系还有待于进一步研究&
参 考 文 献
刘维志5%$$$1植物病原线虫学5北京’ 中国农业出版社5
马海宾! 梁6军! 吕6全! 等5%$$;1松材线虫与拟松材线虫分泌的
纤维素酶系研究5林业科学研究! %%"7$ ’7;" A!$$5
潘宏阳! 叶建仁! 吴小芹5%$$;1中国松材线虫病空间分布格局5生
态学报! %;":$ ’!7%9 A!77#5
瞿红叶! 谈家金! 叶建仁! 等5%$$;1不同真菌对松材线虫繁殖及致
病力的影响5南京林业大学学报’自然科学版! 77"8$ ’9" A9;5
谈家金! 叶建仁5%$$71松材线虫致病机理的研究进展5华中农业
大学学报! %%"8$ ’8#7 A8#"5
徐华潮! 骆有庆5%$#$1松材线虫入侵对森林生态系统的影响5浙
江林学院学报! %""7$ ’!!9 A!9$5
杨宝君! 潘宏阳! 汤6坚! 等5%$$71松材线虫病5北京’ 中国林业
出版社5
张6锴! 梁6军! 张星耀5%$#$1松材线虫纤维素酶的分离纯化及
性质研究5林业科技! 79"7$ ’%% A%85
张星耀! 骆有庆5%$$71中国森林重大生物灾害5北京’ 中国林业出
版社5
张轶文! 王少元5%$$91抑制性消减杂交筛选疾病相关基因的研究
进展5中华内科杂志! !! "8$ ’!"" A!":5
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-2.#+2-’1 IFU N_KCNVVD/F IFI0WVDVUPCDFEK0IF4KICIVD4DV@5f/0N3P0IC
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*P30ND3,3DUVkNVNIC3?! %9’ %9;: A%8$%5
O//F (B! BD@TB! BD@OB! %’1*5%$$!1)_K0/CI4D/F /XCNK0D3I4D[N
VNFNV3NF3N‘IVV/3DI4NU ENFNVDF ?P@IF UNC@I0XDYC/Y0IV4VYW3H*,
@D3C/ICCIW 4N3?F/0/EW5 )_KNCD@NF4I0 hNC/F4/0/EW!
7;";$’#78; A#7":1
!责任编辑6朱乾坤"
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