全 文 ：第 !" 卷 第 # 期
$ % & % 年 # 月
林 业 科 学
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/012 !"，+02 #
3456，$ % & %
橡胶树冷应答转录组 78+-9-:.;分析!
安泽伟&，$ < 陈根辉# < 程< 汉& < 赵彦宏! < 谢黎黎&，$ < 黄华孙&
（&2 中国热带农业科学院橡胶研究所 < 国家橡胶树育种中心 < 儋州 =>&>#>；$2 海南大学农学院 < 海口 =>%$$?；
#2 福建省龙岩市农业科学研究所 < 龙岩 #"!%%%；!2 鲁东大学生命科学学院 < 烟台 $"!%$=）
摘 < 要：< 以橡胶树 && 个抗寒无性系和 &$ 个不抗寒无性系为研究对象，利用 78+-9-:.; 技术对 $# 个橡胶树无性
系低温处理前后的基因表达谱进行差异分析。结果表明：通过 &%% 对引物组合的扩增筛选，共获得 &$ 条在 $ 组材
料中表现一致的差异片段（@ABC4BD 登录号：@E$"F=!# G @E$"F==!）；C.-’,B 和 C.-’,H 比对分析显示，,8:>9?，
,8:=9&=，,8:&"9&% # 条片段分别与植物抗逆相关的 -C( 转运蛋白、# G脱氧 G 8 G阿拉伯庚酮糖 G > G磷酸合成酶
（8-I;’）、!"#$ 基因有较高相似性，其余 F 条片段在 @ABC4BD 未比对到同源序列。
关键词：< 橡胶树；78+-9-:.;；胁迫；抗寒性；分子育种
中图分类号：’>&?2 !"；JF!#2 $< < < 文献标识码：-< < < 文章编号：&%%& G >!??（$%&%）%# G %%"$ G %"
收稿日期：$%%? G &$ G &?。
基金项目：国家科技支撑计划（$%%"C-8%&-%" G #），国家自然科学基金（#%?"%$$&），中央级公益性科研院所基本科研业务费专项基金项
目资助。
!黄华孙为通讯作者。
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< < 橡 胶 树（ @(B(’ /+’42=2(*424 ）属 大 戟 科
（*OYN0UM47A4A）三叶橡胶树属（@(B(’），原产于南美
洲北纬 =_至南纬 &=_、西经 !?_至 >?_之间的亚马逊
河流域的巴西、秘鲁、哥伦比亚、委内瑞拉和圭亚那
等国。橡胶树是典型的热带树种，需要在气温较高、
湿度较大、降水充沛且分布均匀以及微风的气候环
境中生长。现在除亚马逊河流域的国家种植橡胶树
外，泰国、印尼、马来西亚、印度等东南亚国家和中国
也在种植橡胶树，其产量已占到了世界天然橡胶产
量的 F%‘以上。半个世纪以来，通过以植胶区环境
类型划分、对口配置品种和抗逆（抗风和抗寒）栽培
为主要基础的橡胶树北移栽培技术体系的研发与应
用，使我国的天然橡胶生产从无到有，取得了突破性
的发展。目前植胶业已发展成为我国热区农业的支
柱性产业。
虽然橡胶树在我国北移栽培成功，但我国植胶
区位于 &?_—$!_+，处于世界植胶区的最北端，属于
非传统植胶区，因此低温就成为限制我国植胶业发
展的重要因素之一。低温寒害能使橡胶树非正常落
叶、枝条枯死、爆皮流胶，甚至整株死亡，最终导致橡
! 第 " 期 安泽伟等：橡胶树冷应答转录组 #$%&’&()* 分析
+）中国热带农业科学院橡胶研究所产业预警研究室据历年天然橡胶自然增长率统计分析得出。
胶树正常生育期滞后，产量下降。在 +,-. / +,-0 年
的寒害中，广东、云南、广西和福建 1 省区的开割橡
胶树受害率达 0+2 03（严 重 受 害 和 死 亡 率 为
+43），幼树受害率也达到了 ..3（严重受害率
+"2 13），其中云南全省开割树受害率达到 -52 63，
幼树受害率为 .,2 .3，产量损失为 +,-. 年干胶总
产量的 103（何康等，+,5-）。644- / 6445 年的寒害
中，海南、云南和广东各植胶区又有不同程度的受
害，海南垦区西北部受害较重，西南部和南部受害较
轻，云南垦区减产约 "4 444 78，广东垦区减产约
- 444 78+）。目前橡胶树抗寒机制的研究滞后，所以
抗寒育种进程缓慢，不能满足生产的需要。应用分
子生物学技术研究橡胶树抗寒的分子机制，有助于
丰富橡胶树的抗寒理论，正确解析其抗寒机制，促进
抗寒育种的发展。
#$%&’&()* 技术与经典 &()* 一样，不需要知
道任何序列信息，试验操作简单，具有良好的重复
性，与经典 &()* 的不同之处是基因组 $%& 模板被
由 9:%& 反转录的 #$%& 替代，这样利用 #$%&’
&()* 就能够全面获取转录组的表达信息。#$%&’
&()* 是目前较为常用的基因差异表达分析方法。
);<8 等（ 644.）用 #$%&’&()* 技术对温州蜜桔
（!"#$%& %’&("%）不同低温处理阶段的 :%& 进行了差
异分析，找到了 0 个上调表达的转录衍生片段
（ =>;@A=’BC>@DCB E>;89C<=，F$(），6 个下调表达的
F$(。G?#;HC==C? 等（6440）用 #$%&’&()* 技术对杏
树（)$%’%& *$+,’"*-*）进行了分析，找到了与李痘病
毒抗性相关的差异片段。I;@?;7J 等（6440）在对盐
生植物互花米草（ ./*$#"’* *0#,$’"102$*）的耐盐性分
析中，共分离到 6+5 个差异表达的 F$(，其中有 +1
个 F$( 与耐盐性有关。KLM 等（6440）运用 #$%&’
&()* 和 IN& 法 在 致 病 疫 霉 菌（ )(3#2/(#(2$*
"’1,&#*’&）(+ 群体中找到了 1 个与无毒基因相关的
F$(。O; 等（644-）在陆地棉（ 42&&3/"%+ ("$&%#%+）
中利用 #$%&’&()* 找到了 + 个与玉米（5,* +*3&）F
细胞质雄性不育恢复因子 6 同源的差异片段。
P;Q;>;9;< 等（ 6445）通 过 对 不 同 谷 子（ .,#*$"*
"#*0"-*）品种耐盐性进行 #$%&’&()* 分析，找到了
,4 个差异片段。 F@;< 等（ 644,）对不结球白菜
（6$*&&"-* -*+/,&#$"& ??AR -("’,’&"&）的雄性不育突变
体进行 #$%&’&()* 分析，在野生型中找到了 + 个与
育性相关的差异变段，对其全长序列的生物信息学
分析表明，该基因与小孢子形成过程中的跨膜运输
和信号转导功能有关。 S@;M 等（ 6445）报道了
#$%&’&()* 反应体系在橡胶树中的建立，但有关该
技术在橡胶树中的应用研究还未见报道。本研究从
橡胶树抗寒性入手，选取 ++ 个抗寒品种和 +6 个不
抗寒品种，运用 #$%&’&()* 技术对其在常温和低温
胁迫下的 :%& 表达谱进行差异分析，旨在获取橡胶
树响应低温胁迫的相关分子机制信息，为橡胶树抗
寒分子育种提供理论依据。
+! 材料与方法
!" !# 试验材料
++ 个抗寒无性系（编号 + T ++）和 +6 个不抗寒
无性系（编号 +6 T 6"）的芽条均取自中国热带农业
科学院橡胶研究所国家橡胶树种质资源圃（表 +），
于 6440 年 ++ 月进行芽接，644- 年 6 月装入营养袋
后在大棚中正常生长，644- 年 . 月第 6 蓬叶稳定后
进行试验。
表 !# 供试品种名称
$%&’ !# $() *%+), -. /0&&)/ 1/)) 2%/3)13), 0,)4 3* 1(3, ,1045
序号
%MR
品种
U;>@C=Q
序号
%MR
品种
U;>@C=Q
+ VL6 VL" XLY@<8 W " +. ::WO 0+6
1 ,"’++1 +0 :C?J@ +-
. F@;<>C< "+’1. +- *I 50
0 KF+ +5 *I . / .+
- ZC7ML "’++ +, :C?J@ 60
5 O@, %;+4 W&% 5-" 66 :C?J@ 65
++ %;<[@;<8 +’,- 6" :C?J@ +
+6 ::WO 044
!" 6# 试验方法
+2 62 +! 材料处理 ! 每个品种选取长势一致的 0 株
苗，分 &，I 6 组，每组 " 株。& 组在常温下大棚中生
长。I 组放入人工气候箱（\]%UW:]% G5），经 61 J
从 "4 ^降到 1 ^，然后 1 ^处理 15 J。人工气候箱
的处理程序：温度 1 ^，湿度 -.3，光照强度：.：44—
5： 44， +,6 !9MH · 96? T +； 5： 44—++：44，
"51 !9MH·9 T6? T +；++：44—+.：44，.-. !9MH·9 T6 ? T +；
+.：44—+5：44，"51 !9MH·9 T6? T +；+5：44—64：44，+,6
!9MH·9 T6? T +；64：44—.：44，4 !9MH·9 T6? T +。
+2 62 6! 总 :%& 的提取 ! 橡胶树总 :%& 的提取参
照 _@CEC> 等（6444）的方法，经紫外分光光度计和琼
脂糖凝胶电泳检测所提 :%& 的纯度和质量。
"0
林 业 科 学 !" 卷 #
$% &% ’# ()*+ 双链的合成 # 参照 ,-(./0 等（$112）
的方法进行 ()*+ 双链的合成，分别取 ()*+ 的第 $
链和第 & 链的合成产物 3 !4，进行琼脂糖凝胶电泳
检测。
$% &% !# 预扩增与选择性扩增 # 预扩增反应体系为
&5 !4，其中包括加有接头的样品 $5 !4，!"#6"引
物 ’% 73 89·!4 : $，$%&" 引物 ’% 73 89·!4 : $，$5 ;
<=6 ,>??/@ & !4，A9=B& & 00CB·4
: $，’() 酶 5% 3 D，
E*F为：7& J 3 0K8；1! J &5 G，3" J ’5 G，7& J &
0K8，共循环 &5 次；7& J & 0K8；"5 J 保温 ’5 0K8。
选择性扩增的反应体系为 $5 !4，其中包括稀
释 &5 倍的预扩增混合液 & !4，!"#6 "引物 &% 3
89·!4 : $，$%& " 引物 &% 35 89·!4 : $，E*F00CB·4 : $，’() 酶 $ D，$5 ; <=6 ,>??/@ $ !4，A9=B&
& 00CB·4 : $，H&I ! !4。<=6 扩增程序为：1! J
& 0K8，1! J &5 G，"" J ’5 G（每 次 循 环 下 降
5% 7 J），7& J & 0K8，共 $& 次循环；1! J ’5 G，
3! J ’5 G，7& J ’ 0K8，共循环 &2 次；"5 J 保
温’5 0K8。
扩增产物用 "L 变性聚丙烯酰胺测序凝胶分
离，银 染 检 测，最 后 用 MN255 扫 描 仪 记 录 银
染结果。 # #
图 $# F)O3P$3 片段电泳结果
OK9Q $# F./ R-SS/@8 C? ?@-90/8S F)O3P$3
A：35 TR )*+ B-EE/@ 0-@U/@Q $ : &’ 号材料名称见表 $。A-S/@K-BG ?@C0 *CQ $ SC *CQ &’ BKGS/E K8 F-TQ $% 下同。F./ G-0/ T/BCVQ
&# 结果与分析
!" #$ 橡胶树冷应答的转录组分析
用 W>8X-8 77P!，66YA "55 & 个模板对 &3" 个选
择扩增引物组合进行筛选，从中选出 $55 个选择扩
增效果好的引物组合。用选出的 $55 个引物组合分
别对全部 !" 个模板进行扩增，筛选差异性片段。
$55 个选择扩增引物组合的扩增产物均分布在
$55 Z 255 TR，共获得 $& 条在不同处理中表现一致
的 ’ 种类型的差异片段：$）常温条件下表达较弱而
低温胁迫处理后表达增强（图 $，&）；&）常温条件下
不表达而低温胁迫处理后得到表达（图 ’）；’）常温
条件下表达强而低温胁迫处理后表达受到抑制（图
!）。所获得的 $& 条差异片段均经过重复扩增得到
验证，并提交 M/8,-8U [NF 数据库注册，注册号为
MI&"13!’ : MI&"133!。 $& 条 差 异 片 段 特 点
见表 &。 # #
表 !$ 回收得到的 #! 条特异性片段
%&’( !$ %)*+,* -.*/010/ 12&34*56- 2*/7,*2*8 1274 9:;<
片段 \登录号
O@-90/8S \ M/8,-8U *CQ
扩增引物
<@K0/@
长度
4/89S. \ TR
类型
FXR/
F)O$’P2 \ MI&"13!1 [PF= \ AP=FF ’"1 ’
F)O$"P$5 \ MI&"1335 [PFF \ AP== &"’ &
F)O$’P’ \ MI&"13!2 [PF= \ AP=+M &"! &
F)O7P2 \ MI&"133’ [P+M= \ AP=FF &!! &
F)O2P$! \ MI&"133! [P+MM \ APF= ’$5 &
F)O$&P’ \ MI&"13!7 [P+F \ AP=+M &!7 &
F)O$&P$& \ MI&"13!" [P+F \ AP=F &15 $
F)O$5P$$ \ MI&"13!! [P+M \ AP=M &5’ $
F)O$P$ \ MI&"13!’ [P++= \ AP=++ ’5! $
F)O$"P& \ MI&"133$ [PFF \ AP=+= $2& $
F)O3P$3 \ MI&"133& [P+== \ APFM ’&’ $
F)O$$P! \ MI&"13!3 [P+= \ AP=+F &"5 $
!" !$ 抗寒相关的 %=> 片段分析
将 $& 条 差 异 片 段 进 行 克 隆、测 序 后，在
M/8,-8U 中利用 ,4+NF8 和 ,4+NF] 进行序列比对
分析，$& 条片段中只有片段 F)O3P$3，F)O7P2，
F)O$"P$5 与抗逆相关基因同源，其余 1 条片段，未
比对到同源序列。
片段 F)O3P$3 在橡胶树受低温胁迫后呈上调表
达（图 $）。,4+NF8 和 ,4+NF] 比对结果表明：该片
段与多种植物的 ’ :脱氧 : ) :阿拉伯庚酮糖 : 7 :
磷酸合成酶（)+H编码橡胶树 )+H径的第 $ 个关键酶，它在控制分支酸合成中起着重
要的作用，它的活性大小直接决定着莽草酸途径中
其他低谢过程的进行，是影响芳香族氨基酸及其次
生代谢物合成的一个非常关键的因素。莽草酸途径
在植物中除了合成芳香族氨基酸外，还要合成芳香
族氨基酸的次生代谢物如木质素、维生素 [、紫草
素、黄酮类等物质，这些物质与植物的抗性和育性
相关。
!"
! 第 " 期 安泽伟等：橡胶树冷应答转录组 #$%&’&()* 分析
片段 +$(,’- 在橡胶树受低温胁迫后呈上调表
达（图 .）。/)&0+1 比对结果表明：该片段与拟南
芥（ !"#$%&’()%) *+#,%#-#）!*./0" 有 ,23相似性，与
!*./0- 有 ,43相似性，与 !*./0, 有 ,.3相似性，
与海岛棉（1’))2(%34 $#"$#&5-)5）56*’789: &/; 转运
蛋白有 ,,3的相似性；/)&0+< 比对结果表明：该
片段与拟南芥 !*./0" 有 ,,3 相似性，与 !*./0-
有 ==3相似性，与 !*./0, 有 ,"3 相似性，与海岛
棉 56*’789: &/; 转运蛋白有 ->3 的相似性，可见
该片段编码橡胶树 56*’789: &/; 转运蛋白。&/;
转运蛋白是生物体中最大的蛋白家族，大部分 &/;
转运蛋白结合在质膜上负责物质选择和跨膜运输，
其主要功能与体内脱毒有关，包括外源物质和自身
代谢毒素的排出。
图 .! +$(,’- 片段电泳结果
(8?@ .! +A: BCDD:E1 FG GEC?H:1D +$(,’-
! ! 片段 +$(4=’4> 在橡胶树受低温胁迫后呈上调表
达（图 "）。/)&0+1 比 对 表 明：该 片 段 与 大 豆
（1,26%-5 4#7）148/9:"I ，148/9:=. ，148/9:4I
的相 似 性 分 别 达 到 -.3，,I3，,I3，与 烟 草
（;%6’*%#-# *#$#634）;*8/9:. 的相似性达到 -=3，与
辣椒（<#()%634 #--334）<#8/9:. 相似性达到 -=3；
/)&0+< 比对结果表明：该片段与大豆 148/9:"I ，
148/9:=. ，148/9:4I 的相似性分别达到 --3，
-43，-=3，与烟草 ;*8/9:. 的相似性达到 -.3，与
辣椒 <#8/9:. 的相似性达到 -.3，可见该片段编码
橡胶树 J6KL’789: 转录因子。J6KL 转录因子家族
在植物受伤害、干旱、冷害及高温等非生物逆境的胁
迫中起着十分重要的调节作用，其表达受伤害、干旱、
冷害及高温等逆境因子诱导。
图 "! +$(4=’4> 片段电泳结果
(8?@ "! +A: BCDD:E1 FG GEC?H:1D +$(4=’4>
图 2! +$(4"’- 片段电泳结果
(8?@ 2! +A: BCDD:E1 FG GEC?H:1D +$(4"’-
"! 讨论
!" #$ 模拟低温寒害的可靠性
当寒潮、冷空气侵袭或空气温度骤然下降，气温
降低到或低温累积达到橡胶树能忍受的温度以下
时，就会发生橡胶树寒害。从寒潮特征、橡胶树的自
身习性及当地环境特点 " 方面进行综合分析，可将
橡胶树寒害类型分为平流型寒害和辐射型寒害（何
康等，4I-,）。平流型寒害是在冷锋或静止锋长期
控制下，由持久的阴冷天气、日照不足和风寒交加造
成的，气温降低较缓慢；辐射型寒害则多为急发性
寒害，白天气温较高，夜间气温降得很低（植胶林地
气温在 M N甚至 > N以下），日温差一般可达 4M N，
甚至 .> N以上。本研究中虽然人工气候箱的降温
M=
林 业 科 学 !" 卷 #
速率不可调，但仪器在默认的降温速率下经过 $! %
从 &’ (降到了 ! (，温差达到了 $" (，应该属于快
速降温，因此本研究所模拟的寒害属于辐射型寒害，
可以真实反映出参试材料抗辐射型寒害的能力。$&
份参试材料在 ! (低温胁迫下，体内与低温相关的
基因被诱导并得以表达（图 )，$，&，!），但所有材料
还是全部被冻死。这也说明橡胶树的抗寒性只是表
现在能耐受较高的低温，! (超过了橡胶树的极限
温度，所以抗寒品种和不抗寒品种在本试验中全部
表现为不抗寒。
!" #$ 差异片段与橡胶树的抗寒性
植物在受到逆境胁迫时，磷酸戊糖代谢途径
（*+,）会有不同程度加强。拟南芥在低温处理后，
*+, 途径代谢水平几小时内迅速增加，并持续保持
（-./0.1 !" #$%，$’’!；23.4 !" #$%，$’’5）。而 *+, 代
谢产生的中间产物如 6 7磷酸景天酮糖能进入莽草
酸途径，合成芳香族氨基酸及其衍生物来提高植物
的抗逆性。89*,: 是莽草酸途径中第 ) 个关键酶，
它控制分支酸合成，其活性大小直接影响到此途径
的后续代谢过程，对芳香族氨基酸及其衍生物的合
成有重要的作用。王永（$’’"）的研究结果表明，植
物在受伤或经紫外处理后，89*,: 活性有不同程度
的增加，其中受伤处理对 89*,: 活性影响较大。在
本研究中，;8<5=)5 片段与 89*,: 基因同源，在寒
害胁迫下该基因表达量显著增加，呈上调表达，可能
是由于在低温胁迫下，苯丙氨酸代谢途径增强（2>4
!" #$%，$’’?），产生木质素等与抗逆相关的代谢物质
（@.A.BC !" #$%，$’’)；D.C3 !" #$%，$’’!），从而提高橡
胶树对寒害的抵抗能力。
9EF 转运蛋白是生物体中最大的蛋白家族。
真核细胞中，大部分 9EF 转运蛋白结合于质膜上负
责细胞物质的外排。+G,H 蛋白属于 9EF 转运蛋白
中 +G,H 亚家族，与植物在逆境下的自身解毒作用
有关（ ;%IJKJ>0J>，$’’’）。拟南芥 &"’()& 与体内
叶绿素代谢物和谷胱甘肽的接合物转运有关
（:L%>0A !" #$%，$’’"），&"’()6 和 &"’()? 的功能还
不明确。本研究中得到的差异片段 ;8<6=? 与拟南
芥 &"’()& ，&"’()6 和 &"’()? 同源，在低温诱导
下表达量增加，可能是由于低温胁迫下橡胶树光合
作用降低，细胞内叶绿素含量也下降，而且低温能使
细胞对 M$ 的利用能力降低，多余的 M$ 在细胞内转
变成了有毒的活性氧，需要大量的活性氧清除剂如
谷胱甘肽来维持细胞正常的生理功能，因此 ;8<6=?
编码的橡胶树 ’() 基因的大量表达，有助于维持细
胞的光合作用和清除活性氧，从而减少低温对橡胶
树的伤害，使橡胶树在低温下能正常生长。
转录调控因子 *(+, 基因家族是植物特有的
超级基因家族。*(+, 基因受干旱、伤害、冷害及高
温等非生物逆境因子诱导表达。大麦（ -./0!12
31$4#/!）*(+,&? 基因在冷害和干旱胁迫中表达，表
明其在冷害和干旱胁迫的信号转导中起调控功能
（+.3I !" #$%，$’’!）；*>.1N 等（ $’’$）从欧白英
（ 5.$#612 01$7#2#/#）基因组中分离到 ) 个编码
"6 B>抗冻蛋白的 *(+, 基因。OC> 等（$’’!）从水
稻（8/9:# ;#"<3#）基因组中克隆到 )& 个 *(+, 基因，
其中有 )’ 个 *(+, 基因受盐害、,P2、冷害及高温 !
种逆境因子诱导表达。本研究得到的 ;8<)"=)’ 片
段与大豆、烟草等植物的 *(+, 基因高度同源，在常
温下未见表达，在低温胁迫下则表达，说明该橡胶树
*(+, 基因受低温诱导，可能在橡胶树响应低温胁
迫时起调控作用。
参 考 文 献
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重庆：西南大学硕士学位论文 Q
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（责任编辑 ! 徐 ! 红）
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