全 文 ：第 49 卷 第 10 期
2 0 1 3 年 10 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 49，No. 10
Oct．，2 0 1 3
doi:10．11707 / j．1001-7488．20131027
收稿日期: 2013 － 01 － 07; 修回日期: 2013 － 05 － 11。
基金项目: 浙江省重点科技创新团队 ( 2009R50035 ) ; 国家 863 项目 ( 2011AA100203 ) ; 浙江省科学技术厅优先主题重点农业项目
(2011C12014)。
* 童再康为通讯作者。
杉木与台湾杉 EST-SSR标记的开发与应用*
张 圣 黄华宏 林二培 童再康
(浙江农林大学 亚热带森林培育国家重点实验室培育基地 临安 311300)
关键词: 杉木; 台湾杉; EST; SSR; 遗传多样性
中图分类号: S718. 46 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2013)10 － 0173 － 08
Development and Application of EST-SSR Markers for
Cunninghamia lanceolata and Taiwania cryptomerioides
Zhang Sheng Huang Huahong Lin Erpei Tong Zaikang
(Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture Zhejiang A＆F University Lin’an 311300 )
Abstract: Cunninghamia lanceolata is one of the most important fast-growing timber tree species in southern China． In
order to develop an effective molecular maker，which is important for genetic diversity analysis and marker-assisted
selection in C． lanceolata，all the EST sequences of C． lanceolata and Taiwania cryptomerioides were obtained from NCBI
for the development of EST-SSR markers． As a result，311 non redundant EST sequences were assembled from 408 EST
sequences of C． lanceolata． Among these sequences，a total of 28 SSRs were identified from 26 non redundant EST
sequences，and the trinucleotide and tetranucleotide repeats were the dominant types with the frequency of 60. 71% and
25%，respectively． A total of 384 non redundant EST sequences were found after assembly of 2 643 EST sequences of T．
cryptomerioides and 32 SSRs were identified from 27 non redundant EST sequences． The trinucleotide and tetranucleotide
repeats were also the dominant types with the frequency of 53. 13% and 25%，respectively． According to these sequences，
50 pairs of EST-SSR primers were designed． Through PCR and sequencing，10 pairs of primers with polymorphism were
isolated，among which，9 pairs of primers were from C． lanceolata and 1 pair of primers was from T． cryptomerioides． These
polymorphic primers were further used to assess the genetic diversity of 30 different clones of C． lanceolata． The results
showed that 30 clones were divided into 6 groups at coefficient rate 0. 80． All the results indicated that the developed SSR
markers from EST sequences would have important application value in genetic analysis and molecular breeding of C．
lanceolata．
Key words: Cunninghamia lanceolata; Taiwania cryptomerioides; EST; SSR; genetic diversity
简单序列重复( Simple Sequence Repeats，SSR)
标记是基于 SSR 中核苷酸单位串联重复次数不同
而开发的一种分子标记技术，具有多态性丰富、呈共
显性遗传、易于 PCR 检测，在基因组上分布均匀等
特点( Powell et al．，1996)。直接利用现有的 EST
(Expressed Sequence Tag)序列开发 SSR 标记就是目
前采用较多的一种策略。
EST-SSR 标记反映的是基因编码部分，可以直
接获得基因表达的信息，为功能基因提供“绝对”的
标记，这有可能对决定重要表型性状的等位基因进
行直接鉴定(Chen et al．，2001)。EST-SSR 标记应用
广泛，目前已在多种植物上得到应用，如甘蔗
(Saccharum officinarum)(Cordeiro et al．，2001)、小麦
(Triticum aestivum)(Eujayl et al．，2001; 2002)、大麦
(Hordeum vulgare) ( Kota et al．，2001; Thiel et al．，
2003)、玉米 ( Zea mays)、高粱属 ( Sorghum)、水稻
(Oryza sativa ) ( Kantety et al．，2002 )、葡萄 ( Vitis
vinifera) ( Scott et al．，2000 )、大豆 ( Glycine max )
( Song et al．， 2004 )、火 炬 松 ( Pinus taeda )
( Liewlaksaneeyanawin et al．， 2004 )、云 杉 ( Picea
asperata) ( Rungis et al．， 2004 )、白 桦 ( Betula
platyphylla) (王艳敏等，2008 )、核桃属 ( Juglans)
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(朱艳等，2009; 齐建勋等，2011)、茶树 ( Camellia
sinensis) (周炎花等，2011)、荔枝 ( Litchi chinensis)
(孙清明等，2011)、棉花属 ( Gossypium) (王为等，
2012 ) 和 木 油 桐 ( Vernicia montana ) ( Xu et al．，
2012)等。
杉木 ( Cunninghamia lanceolata)为我国重要针
叶用材树种，也是我国林木育种研究最为系统的树
种之一，研究者围绕杉木育种资源遗传多样性的评
价开展了许多卓有成效的工作。施季森等 (1993)
利用生化标记研究了杉木遗传多态性与多基因位点
遗传结构，得出大多数群体中明显存在高阶配子不
平衡现象，配子不平衡与地理、气候因子之间相关呈
随机分布，奠基者效应、群体的再分化、分布区内环
境多样性以及 2 000 多年人工栽培历史，均是产生
和保持杉木群体遗传多样性及结构的重要因素。尤
勇等(1998)利用 RAPD 标记研究了杉木 7 个种源
的遗传变异，结果表明 7 个种源彼此间的遗传多态
性水平较高，多态性位点所占比例为 79. 8%，遗传
距离在 0. 225 ～ 0. 440 7 之间。李梅等 ( 2001a;
2001b)利用 RAPD 标记分别进行了杉木优树分子
遗传变异的研究和杉木杂交亲本分子遗传变异与子
代生长相关的研究，得出 30 株优树的多态性谱带比
例达 66. 90%，具较高水平的遗传变异，杉木亲本的
分子遗传变异与子代生长的相关关系较为复杂，它
对亲本选配有一定的参考价值。然而，这些研究多
采用同功酶，以及 RAPD、ISSR、AFLP 等标记技术，
尚未涉及 EST-SSR 标记。近年来 GenBank 中积累
的杉木及其同科的台湾杉 EST 序列日益增多，可为
EST-SSR 标记的开发提供重要资源。为此，本文拟
对公 共 数 据 库 中 的 杉 木 及 台 湾 杉 ( Taiwania
cryptomerioides)EST 序列开展 SSR 特征分析，开发相
关 SSR 引物，并应用于 30 个杉木无性系的遗传多
样性分析，以期为杉木育种资源系统评价和分子辅
助育种提供重要依据。
1 材料与方法
1. 1 植物材料 参试材料为 30 个杉木无性系，皆
采自浙江省开化县林场，具体来源见表 1。
1. 2 基因组 DNA 提取 基因组 DNA 的提取采用
改良的 CTAB 法，具体步骤参照 Doyle 等(1990)的
报道。
1. 3 EST 序列的获得及 EST-SSR 引物的设计 从
NCBI( http: / /www． ncbi． nlm． nih． gov)数据库中获
取杉木及台湾杉的 EST 序列，数据截止 2011 年 12
月 17 日。用软件 CAP3( http: / / seq． cs． iastate． edu /
download． html)将 EST 序列组装成单基因后，利用
在线软件 Batchprimer3(http: / / probes． pw． usda． gov /
batchprimer3 /)搜寻 EST 序列中的 SSR 位点并设计
对应引物。SSR 位点搜寻标准: 二核苷酸至少重复
6 次，三核苷酸至少重复 4 次，四、五、六核苷酸至少
重复 3 次。引物设计参数标准为: PCR 产物大小为
100 ～ 350 bp，最佳选择为 150 bp; 引物长度 18 ～
23 bp，最佳选择为 20 bp; 退火温度为 50 ～ 70 ℃，最
佳温度为 59 ℃ ; 引物(G + C)含量为 40% ～ 60%，
最佳为 50% ; 其他为系统默认值。设计的 EST-SSR
引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
表 1 30 个杉木无性系的来源
Tab． 1 Origin of 30 Chinese Fir clones
编号
No．
来源
Origin
编号
No．
来源
Origin
1 广西融水 Rongshui，Guangxi
2 广西融水 Rongshui，Guangxi
3 广西融水 Rongshui，Guangxi
4 广西三江 Sanjiang，Guangxi
5 广西三江 Sanjiang，Guangxi
6 广西三江 Sanjiang，Guangxi
7 广西三江 Sanjiang，Guangxi
8 广西那坡 Napo，Guangxi
9 广西那坡 Napo，Guangxi
10 广西河池 Hechi，Guangxi
11 广西河池 Hechi，Guangxi
12 广西河池 Hechi，Guangxi
13 广西河池 Hechi，Guangxi
14 广西河池 Hechi，Guangxi
15 湖南会同 Huitong，Hunan
16 湖南会同 Huitong，Hunan
17 湖南会同 Huitong，Hunan
18 湖南会同 Huitong，Hunan
19 湖南靖县 Jingxian，Hunan
20 湖南靖县 Jingxian，Hunan
21 湖南靖县 Jingxian，Hunan
22 湖南靖县 Jingxian，Hunan
23 贵州锦屏 Jinping，Guizhou
24 贵州锦屏 Jinping，Guizhou
25 贵州锦屏 Jinping，Guizhou
26 贵州锦屏 Jinping，Guizhou
27 贵州天柱 Tianzhu，Guizhou
28 贵州天柱 Tianzhu，Guizhou
29 贵州天柱 Tianzhu，Guizhou
30 贵州天柱 Tianzhu，Guizhou
1. 4 引物的筛选 用 8 个不同来源的杉木无性系
DNA 为模板进行引物筛选。PCR 反应采用 10 μL
反应体系，其中 2 × ComTaq PCR SuperMix (购自杭
州西格玛生物技术有限公司) 5 μL，上下游引物各
0. 25 μL，50 ng DNA 模板 1 μL，用水补足 10 μL。
PCR 反应程序: 94 ℃预变性 3 min; 94 ℃变性 30 s，
退火温度 54 ℃ 30 s，72 ℃延伸 40 s，共 32 个循环;
最后 72 ℃延伸 5 min。扩增产物经 8%非变性聚丙
烯酰胺凝胶电泳后进行银染检测。
1. 5 SSR 位点验证 为了验证扩增片段中含有
SSR 位点，对扩增获得的片段进行克隆测序。具体
操作如下: 从 PAGE 胶中割取目的片段，放入
1. 5 mL离心管中，加 20. 0 μL TE 缓冲液，4 ℃下浸
提过夜。离心后，取 2. 0 μL 上清作为模板，进行
PCR 扩增。扩增产物用 3% 的琼脂糖凝胶电泳检
测，并从胶上割取目的片段，利用 AxyPrep DNA 凝
胶回收试剂盒(Axygen 公司)进行回收。回收后进
行连接转化，交由南京金斯瑞公司测序。
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第 10 期 张 圣等: 杉木与台湾杉 EST － SSR 标记的开发与应用
1. 6 EST-SSR 多态性检测及数据统计 记录电泳
图目的片段范围内重复性好且清晰的条带，根据分
子量大小，从大到小依次记作 A，B，C，D，……，1 条
为纯合，2 条为杂合，分别记录为 aa，ab，bb，ac，ad，
cd 等，根据等位基因的位置获得原始数据，采用
POPGENE version 1. 31 软件计算群体的等位基因数
( observed number of alleles，n a )、有效等位基因数
( effective number of alleles，n e ) 和 Shannon 指数
(Shannon’s information index，I)。利用多态信息含
量计算程序 PIC _ Calc0. 6 计算多态性引物的 PIC
值。利用软件 NTSYS-pc 分析 30 个无性系的遗传
关系，选用 SM 相似系数、UPGMA 法进行聚类分析。
2 结果与分析
2. 1 EST 序列所含微卫星的分布、频率和特点
408 条杉木 EST 序列经 CAP3 拼接后获得 Contigs 66
条，Singlets 245 条。通过 Batchprimer3 搜寻，共发现
28 个 SSR 位点分布在 26 条序列中，发生频率为
8. 36%，其中有 2 条含有 2 个 SSR 位点。2 643 条台
湾杉 EST 序列经 CAP3 拼接后获得 Contigs 115 条，
Singlets 269 条。含 SSR 位点的序列共 27 条，发生频
率约为 7. 03%。27 条序列共含 SSR 位点 32 个，其中
2 条各含有 3 个 SSR 位点，1 条含有 2 个 SSR 位点。
由表 2 可知，28 个杉木 SSR 位点共有二、三、四、
五、六核苷酸 5 种重复类型，其中以三核苷酸为基序
的 SSR 类型最多，约占 60. 71%，以四核苷酸为基序
的 SSR 类型次之，约占 25%，而以二、五、六核苷酸为
基序的 SSR 类型相对较少，分别为 3. 57%，7. 14%和
3. 57%。32 个台湾杉 SSR 位点的分布特征与杉木类
似，也表现为二、三、四、五、六核苷酸 5 种重复类型，
其中以三核苷酸为基序的 SSR 类型最多，约占
53. 13%，其次是四核苷酸为基序的 SSR 类型，约占
25%。另外，从具体基序看，无论是杉木还是台湾杉，
三碱基重复类型中所包含基序种类是最多的，均为
11 种，而且杉木 SSR 位点中是 AGA /TCT，而台湾杉
SSR 位点中是 GAT。四碱基类型基序次之，杉木和台
湾杉分别有 6 种和 7 种; 杉木中(TTTC) 3 出现频率
最高，为 28. 57%，其他几种重复类型的出现频率均为
14. 29% ; 台湾杉中出现频率较高的是 (AAAT) 3 /
(ATTT) 3 和(AGGC) 3 /(AGGG) 3，都为 25%，其他几
种类型的出现频率均为 12. 5%。其余核苷酸类型重
复基序均只出现 1 次。
表 2 杉木及台湾杉 EST-SSR 位点的类型及分布
Tab． 2 Distribution and repeat types of EST-SSRs in C． lanceolata and T． cryptomerioides
重复类型
Motif types
杉木 C． lanceolata 台湾杉 T． cryptomerioides
重复基元
Motif of sequences
出现次数
Occurrence number
发生频率
Frequency
重复基元
Motif of sequences
出现次数
Occurrence number
发生频率
Frequency
二核苷酸 Dinucleotide (TG) 10 1 3. 57% (CT) 6 /(TA) 7 1 /1 6. 25%
三核苷酸 (AGA) 4 /(TCT) 4 3 /1 60. 71% (AAT) 4 1 53. 13%
Trinucleotide (AGC) 4 1 (CAG) 4 /(CAG) 7 1 /1
(CAC) 6 1 (CCG) 4 1
(CAG) 5 2 (CGC) 5 1
(CTT) 4 /(GAA) 4 1 /1 (GAA) 4 1
(GAG) 4 1 (GAG) 4 2
(GCA) 7 1 (GAT) 4 /(GAT) 5 1 /2
(GGA) 4 1 (GCA) 5 2
(TCA) 4 1 (GGC) 4 1
(TGT) 4 1 (TGG) 4 2
(TTA) 4 /(TTG) 4 1 /1 (TTG) 4 1
四核苷酸 (GATA) 3 1 25. 00% (AAAT) 3 /(ATTT) 3 1 /1 25. 00%
Tetranucleotide (TCAG) 3 1 (AACA) 3 1
(TGGA) 3 1 (AGGC) 3 /(AGGG) 3 1 /1
(TTCA) 3 1 (ATCG) 3 1
(TTGG) 3 1 (ATCT) 4 1
(TTTC) 3 2 (ATGA) 3 1
五核苷酸 (TAAAA) 3 1 7. 14% (TTGAA) 3 1 3. 13%
Pentanucleotide (TGATC) 3 1
六核苷酸 (ACATAT) 3 1 3. 57% (CAGCCA) 4 1 12. 50%
Hexanucleotide (CCGCCA) 3 1
(CCTACC) 3 1
(GTAGGT) 3 1
2. 2 EST-SSR 引物的筛选 为检测所开发 EST-
SSR 标记的可用性，分别设计 22 对杉木和 28 对台
湾杉 EST-SSR 引物，并以 8 个不同来源的杉木无性
系 DNA 为模板，进行引物检测与筛选。结果表明
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林 业 科 学 49 卷
20 对杉木 EST-SSR 引物和 9 对台湾杉 EST-SSR 引
物能扩增出理想的 PCR 产物(表 3)，引物有效扩增
率分别为 90. 9%和 32. 1%。
表 3 29 对引物信息①
Tab． 3 Information of 29 pairs of primers
引物编号
Primer No．
引物序列
Primer sequence(5—3)
重复单元
Motif of sequences
Tm /
℃
GC
(% )
片段大小
Expected size / bp
CL-1 F:AATCAAGCCAAATTAGGACG (TGATC) 3 54. 9 40. 0 229
R:TGAAGAATGAATGATGGTGG 53. 5 40. 0
CL-3 F:TGACTCGATCTGCAAGAAGAA (TGT) 4 58. 74 42. 86 163
R:TCCTGATCTCTTCATCATCACC 59. 09 45. 45
CL-4 F:TTCTCACTCCCTTCTCAGAGC (TTTC) 3 58. 76 52. 38 129
R:TACCATGAAAGGGGCCTAGTA 58. 59 47. 62
CL-5 F:TGGTGGGTCAGTGAGTGTTTA (TTGG) 3 59. 04 47. 62 169
R:GCCTCTTTAATTGCCACAATC 58. 71 42. 86
CL-6 F:CCGGATACTTGGACGTGATAC (CAG) 4 59. 33 52. 38 160
R:TTTGTGGAGGTTGTTGCATT 59. 02 40
CL-7 F:TCAGGGAGACTTTTCTTCCAA (TTTC) 3 58. 89 42. 86 152
R:AACTGCTGCTTGCTTTCTTTC 58. 92 42. 86
CL-8 F:GAGGACAGCAAAGAGGTTGTT (TCA) 4 58. 44 47. 62 155
R:AAACGTTCTGCCAATGTCTCT 58. 85 42. 86
CL-10 F:AACTGTGATTGGAGATGCAGA (CAC) 6 58. 3 42. 86 150
R:TTCTCCTCCTTCTTCTCTTCCTT 59. 15 43. 48
CL-11 F:CAACAGGGACAACGCTCTAAT (CAG) 5 59. 25 47. 62 142
R:TAACATTCCTTCCAGGCAGAT 58. 66 42. 86
CL-12 F:GTGCAGACTGCTGAAAAGTTG (TG) 10 58. 72 47. 62 176
R:TCCCATAGGCTCTAAACAGAGA 58. 1 45. 45
CL-13 F:TCAGTTTGGGCAGATCAGAAT (CTT) 4 59. 69 42. 86 146
R:CTTGACAAGCTCATCGCTGTA 59. 23 47. 62
CL-14 F:GACCCTTCCGTCGTGTAATAG (AGC) 4 58. 59 52. 38 161
R:TAGGGCTTTGTCCAAGTTCAG 59. 36 47. 62
CL-15 F:ACCTGTTGGTGAAGAGGAAGA (AGA) 4 58. 78 47. 62 151
R:AAAAGTGTTGCTTCCAGAGGA 58. 97 42. 86
CL-16 F:ACCTGTTGGTGAAGAGGAAGA (GAG) 4 58. 78 47. 62 151
R:AAAAGTGTTGCTTCCAGAGGA 58. 97 42. 86
CL-17 F:GGAGGACTGGGAGAAGAAGTT (TTA) 4 58. 8 52. 38 149
R:CTTGCATCAAAGATTCAGCAG 58. 66 42. 86
CL-18 F:AAGAACAGCCGTTTGAGAGAG (TTG) 4 58. 73 47. 62 145
R:GAAACTGCCCACTCAGGTTAT 58. 19 47. 62
CL-19 F:GAGGCAGTGGATGACGACTAC (AGA) 4 59. 74 57. 14 142
R:CATCATGGTAACATGGGAAGA 58. 28 42. 86
CL-20 F:TGCTTTGAGGACTCATTTGTG (TCT) 4 58. 91 42. 86 149
R:GTTTATGATCCCTTCCGAACC 59. 66 47. 62
CL-21 F:AACCCCAGGACCAGAAGTAGT (ATA) 4 58. 98 52. 38 166
R:ATGGTACCAACGAAATCAAGC 58. 97 42. 86
CL-22 F:CGATAGGGGCCTACTTAATTG (TTATA) 3 57. 81 47. 62 227
R:CATGACCAATGGATAAGTCTAC 53. 79 40. 91
TC-1 F:AAGCTCAACCAATCAACCAAG (CAG) 7 59. 23 42. 86 135
R:TTGTGCAAGACATTGAAGACC 58. 76 42. 86
TC-11 F:CAGATCGAGACCCAGAAAGC (CCAC) 4 59. 95 55 212
R:TTACCCTCGTCTGCTCTCCT 59. 04 55
TC-12 F:GCTATTTCTGCAGTGGAGGAT (TTG) 4 58. 42 47. 62 133
R:CTCCATATGCAAGGGCTTTAC 58. 73 47. 62
TC-16 F:AAACAAAGCAGGAGGTAAAGC (GAG) 4 57. 7 42. 86 172
R:GAGTGCGGTTGAACAGATACC 59. 61 52. 38
TC-17 F:GTTTAAAGCGCGAACAAGAAC (GAT) 4 59. 07 42. 86 152
R:TGATAACACTCCGGTTTCCAT 59. 3 42. 86
TC-18 F:AACCACCATTGCTACCACAGT (GCA) 5 59. 39 47. 62 133
R:TTTGGGCTTCTTGTAACTGCT 59. 03 42. 86
TC-26 F:GGGAGCATTCACTTATGGACA (AAAG) 3 59. 95 47. 62 165
R:AACCCATAAACCACAAGAACG 58. 87 42. 86
TC-27 F:TGTCTTGGAAGTTTCGTTCG (GGAT) 3 58. 9 45 160
R:ATGAATTGAGTAGGGCACTCG 59. 21 47. 62
TC-28 F:TCTCAGGGTGGCCAATTAGTA (ATCA) 3 59. 58 47. 62 215
R:TTGTTCCCGAACTACACGTATC 59. 02 45. 45
①引物 CL-1—CL-22 来自杉木 EST 序列; 引物 TC-1—TC-28 来自台湾杉 EST。Primer CL-1—CL-22 were designed from the ESTs of C．
lanceolata; Primer TC-1—TC-16 were designed from the ESTs of T． cryptomerioides．
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第 10 期 张 圣等: 杉木与台湾杉 EST － SSR 标记的开发与应用
2. 3 SSR 位点验证 为进一步验证所开发 EST-
SSR 标记的真实性，根据条带是否与预测大小较为
一致，或是否具有多态性的原则，从 12 对引物的
PAGE 电泳凝胶上回收了 19 个片段，并进行了测序
分析(表 4)。由表 4 可以看出仅有 1 条片段不含有
SSR 位点，即测序的扩增片段中 SSR 位点的含有率
为 95%。由片段 9，10，11 和 12 可以看出，片段差异
是由 SSR 的重复次数引起(序列比对结果见图 1)。
由片段 6，7，8 可以得出，当扩增片段远大于预测片
段大小时，片段的差异性就不一定是由 SSR 的重复
次数引起，有可能是片段中含有内含子造成。对于
这种条带，在后续的读带时不进行统计。
表 4 扩增片段信息
Tab． 4 Information of amplified fragments
片段编号
No．
引物编号
Primer No．
模板重复单元
Motif of template
预测片段大小
Expected size / bp
实际片段大小
Fragment length / bp
片段重复单元
Motif of fragment
无性系号
No． of clones
1 CL-1 (TGATC) 3 229 170 (TGATC) 3 15
2 CL-3 (TGT) 4 163 163 (TGT) 4 9
3 CL-5 (TTGG) 3 169 169 (TTGG) 3 24
4 CL-5 (TTGG) 3 169 173 (TTGG) 4 25
5 CL-7 (TTTC) 3 152 152 (TTTC) 3 3
6 CL-8 (TGA) 4 155 155 (TGA) 4 16
7 CL-8 (TGA) 4 155 465 (TGA) 4 16
8 CL-8 (TGA) 4 155 476 (TGA) 4 16
9 CL-12 (TG) 10 176 170 (TG) 7 9
10 CL-12 (TG) 10 176 172 (TG) 8 10
11 CL-12 (TG) 10 176 176 (TG) 10 24
12 CL-12 (TG) 10 176 178 (TG) 11 25
13 CL-20 (TCT) 4 149 149 (TCT) 4 2
14 TC-11 (CCAC) 4 172 163 None 18
15 TC-16 (GAG) 4 172 166 (GAG) 2 13
16 TC-16 (GAG) 4 172 178 (GAG) 6 13
17 TC-18 (GCA) 5 133 136 (GCA) 6 29
18 TC-27 (GGAT) 3 160 160 (GGAT) 3 4
19 TC-28 (ATCA) 3 215 215 (ATCA) 3 18
图 1 片段 9，10，11，12 和引物设计序列 0 的
序列比对结果
Fig． 1 The alignment results of sequence 9，10，11，12 and 0
片段大小差异由 TG 重复次数不同引起。The differences of the
sequences are caused by the repeat numbers of TG．
2. 4 杉木无性系的遗传多样性分析 利用筛选出
的 20 对杉木 EST-SSR 引物和 9 对台湾杉 EST-SSR
引物，对 30 个杉木无性系 DNA 进行 PCR 扩增。结
果有 9 对杉木 EST-SSR 引物扩增出多态性，占可扩
增出目的片段引物的 31%，呈现出较高的多态性
(图 2); 9 对台湾杉 EST-SSR 引物中仅 1 对具多态
性。10 对引物中扩增获得的等位基因数最多为 5
个，最少为 2 个，平均等位基因数为 2. 9，幅度为 2 ～
5 个(表 5)。
10 个微卫星标记的多态性信息含量( PIC)为
0. 109 7 ～ 0. 585 5，平均为 0. 375 7。根据 Botstein 等
(1980 ) 的理论，有 2 个标记为低度 多态 位点
(0 ＜ PIC ＜ 0. 25)，6 个标记为中度多态位点(0. 25 ＜
PIC ＜ 0. 5)，剩余 2 个为高度多态位点(PIC ＞ 0. 5)，
CL-20 位点 PIC 最高(0. 585 5)，CL-5 位点 PIC 最低
(0. 109 7) (表 5)。进一步采用 POPGENE 对这 30
个无性系的遗传多样性进行评价。结果显示这些无
性系的平均等位基因数为 1. 666 7、有效等位基因平
均数为 1. 666 7、Shannon 多样性指数为 0. 462 1。而
771
林 业 科 学 49 卷
利用软件 NTSYS-pc 进行聚类表明，以相似系数 0. 80 为界限，可以把 30 个无性系分成 6 大类(图 3)。
图 2 2 对引物在 30 个杉木无性系间的多态性
Fig． 2 Polymorphisms showed in 30 different Chinese Fir clones by two pairs of primers
A．引物 CL-12 Primer CL-12; B． 引物 CL-17 Primer CL-17．
表 5 10 对多态性引物的 PIC 值及等位基因数
Tab． 5 PIC value and allele numbers of 10 polymorphic primers
引物
Primer
PIC 等位基因数
Number of alleles
引物
Primer
PIC 等位基因数
Number of alleles
CL-3 0. 398 9 3 CL-13 0. 163 8 2
CL-5 0. 109 7 3 CL-17 0. 304 7 2
CL-7 0. 441 5 3 CL-18 0. 369 0 2
CL-8 0. 390 8 3 CL-20 0. 585 5 3
CL-12 0. 551 6 5 TC-16 0. 442 2 3
图 3 基于 EST-SSR 标记对 30 份材料的 UPGMA 聚类
Fig． 3 Dendrogram of 30 different materials based on EST-SSR markers
3 结论与讨论
3. 1 结论 本文对 408 条杉木 EST 序列和 2 643
条台湾杉 EST 序列进行 SSR 特征分析，分别搜寻到
28 个杉木 SSR 位点和 32 个台湾杉 SSR 位点。在此
基础上共设计 SSR 引物 50 对，其中 10 对引物的扩
增条带具有多态性。扩增产物测序结果表明，绝大
部分扩增片段均含有相应的 SSR 位点。采用多态
871
第 10 期 张 圣等: 杉木与台湾杉 EST － SSR 标记的开发与应用
性引物对 30 个杉木无性系遗传多样性进行分析，结
果表明平均等位基因数为 1. 666 7、有效等位基因平
均数为 1. 666 7、Shannon 多样性指数为 0. 462 1。10
个微卫星标记的多态性信息含量(PIC)为0. 109 7 ～
0. 585 5，平均为 0. 375 7。以相似系数 0. 80 为界
限，可以把 30 个无性系分成 6 大类。这些结果说明
开发和筛选出的 EST-SSR 引物可用于杉木育种资
源的遗传多样性评价。
3. 2 讨论 1)杉木与台湾杉 EST-SSR 标记特点
已有的研究表明，不同物种 EST 序列中 SSR 位点的
发生频率不同。本研究分析了杉木 EST 序列中 SSR
位点的特征，结果发现杉木 EST 序列中 SSR 位点的
发生频率约为 8. 36%，台湾杉 EST 序列中 SSR 位点
的发生频率约为 7. 03%，其频率比其他物种的 EST-
SSR 要高。如杨秀艳等(2011)发现 1 620 条日本落
叶松(Larix kaempferi) EST 序列中 SSR 位点的发生
频率仅为 3. 85%，宋跃朋等(2010)发现 5 359 条与
杨树(Populus)木质部形成相关的 ESTs 序列中 SSR
位点的频率为 5. 2%，也比杉木和台湾杉略低。产
生这种情况的原因可能是物种差异造成的，也可能
是本试验中用于分析的 EST 序列过少，存在一定的
偏向性造成的。随着数据库中杉木 EST 序列的增
加，将来的分析结果可能更加可靠。
EST-SSR 标记目前已在多种植物的遗传多样性
评价、图谱构建等方面得到广泛应用，但在杉木中依
然没有相关的报道。为了充分利用公共数据库中积
累的 EST 序列资源，丰富可用于杉木的分子标记，
为杉木育种资源系统评价和分子辅助育种提供重要
依据，本文利用杉木和台湾杉的 EST 序列开发出 10
对多态性引物，其中 10 对多态性引物仅有 1 对来自
台湾杉。这说明杉木和台湾杉之间具有一定的亲缘
关系，且这些具有多态性的位点可能是种间较保守
的基因，但若要开发杉木 EST-SSR 标记，可能仍要
依赖来自杉木本身的 EST 序列。
2)EST-SSR 标记在杉木育种群体中的应用 遗
传多样性一般代表种内的遗传差异水平，可以反映
物种适应环境的能力和被改造的潜力。本试验中，
10 对多态性引物对 30 个不同来源杉木无性系的遗
传多样性分析结果显示，该群体的 Shannon 多样性
指数平均值为 0. 462 1、平均等位基因数为 1. 666 7、
有效等位基因平均数为 1. 666 7，比杨玉玲等
(2009)利用 ISSR 分子标记对 24 个不同地理种源杉
木的分析结果略高，表明所研究杉木育种群体的遗
传多样性处于较高的水平。
但基于 EST-SSR 标记分析，本文也发现以相似
系数 0. 800 为界限，这 30 个无性系可分成 6 个亚
群，但亚群内个体来源并无明显规律可循。这说明
本研究开发的 EST-SSR 分子标记可用于杉木遗传
多样性分析，但由于数量有限，对杉木个体间亲缘关
系的揭示不是十分清晰。因此，今后有必要采用高
通量测序等手段获得更多的杉木 EST 序列，以开发
更多有用的 EST-SSR 分子标记，并进行性状与标记
的关联分析，开发有效的标记，为杉木的分子辅助育
种研究提供依据。
3)EST-SSR 分子标记存在的问题及解决措施
EST-SSR 作为一种新型的分子标记，在比较作图、遗
传图谱构建、种质资源遗传多样性评价与保护等研
究中具有很大优势，但同时它也存在一定的缺陷:
一方面，功能基因长期在选择的压力下存在着较高
的保守性，而 EST-SSR 恰好来源于这些相对保守的
功能基因序列，因此与 Genomic SSR 标记相比较，
EST-SSR 标记的多态性较低 ( Eujayl et al．，2001);
另一方面，SSR 分子标记多态性的原理是扩增片段
中不同的微卫星重复数目产生不同的片段长度，但
是对于长度相同而由不同碱基重复序列组成的 SSR
或者长度相近的 SSR 不能有效加以区分; 除此之
外，EST-SSR 来自基因的编码部分，并不包含内含子
等相关信息，在进行引物设计时可能会跨越内含子，
有可能对扩增结果造成干扰。但相对于 Genomic-
SSR，EST-SSR 的开发更简单方便，同时成本更低，
因此随着公共数据库中序列信息的增加，EST-SSR
被越来越多的研究者采用。
针对以上 EST-SSR 存在的不足，研究者们可以
利用公共数据库中不断增加的 EST 序列开发新的
EST-SSR 标记，而现在高通量测序技术的出现，也使
得获得 EST 序列的成本越来越低，有助于增加多态
性 SSR 引物的数量，从而弥补 EST-SSR 标记本身多
态性较低带来的问题; 同时，结合其他分子标记如
AFLP，CAPS，SNP 等进行比较研究，可以提高试验
的可靠性和准确性。另一方面，在对 EST-SSR 引物
的电泳检测中，可以适当增加 PAGE 胶的浓度，提高
凝胶的分辨率; 同时，针对与预测片段差异较大的
片段，可以通过测序等手段，验证其真实性，避免内
含子对读带造成的干扰。
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(责任编辑 徐 红)
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