全 文 ：第 49 卷 第 4 期
2 0 1 3 年 4 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 49，No. 4
Apr．，2 0 1 3
doi:10．11707 / j．1001-7488．20130407
收稿日期: 2012 － 08 － 29; 修回日期: 2012 － 10 － 16。
基金项目: 国家星火计划项目(2011GA780067) ; 广东高校边缘热带特色植物资源工程技术开发中心(GCZX-B1002) ; 广东省自然科学基
金项目 ( S2012010008737，10152404801000005，10452404801004328 ) ; 广东省科技计划项目 ( 2012A020602108 ) ; 湛江市科技攻关项目
(2011C3104010)。
* 曾富华为通讯作者。
转 TSRF1 基因尾叶桉的培育及其广谱抗病性*
欧阳乐军 刘 媛 黄真池 曾富华
(湛江师范学院生命科学与技术学院 湛江 524048)
摘 要: 以尾叶桉 U6 无性系无菌种子苗下胚轴为外植体，通过对不同生长调节剂的优化组合，建立尾叶桉高
效再生体系。应用正交试验设计，优化尾叶桉遗传转化体系。经 PCR 和 Southern 杂交检测表明，TSRF1 基因已整
合到尾叶桉基因组中; 转基因植株灌根接种青枯菌后，转基因植株表现出发病延迟，抗性提高，抗性相关酶活性
显著增强。转化植株离体叶片对疫霉菌抗性明显增强。荧光定量 PCR 的结果表明转基因植株接种致病菌后
TSRF1 基因表达量得到提高。研究结果表明，转 TSRF1 基因尾叶桉表现出一定的广谱抗病能力。
关键词: 尾叶桉; TSRF1 基因; 遗传转化; 广谱抗病性
中图分类号: S718. 46 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2013)04 － 0046 － 08
Transformation of TSRF1 into Eucalyptus urophylla and the Broad-Spectrum
Disease Resistance of the Transgenic Plant to Diseases
Ouyang Lejun Liu Yuan Huang Zhenchi Zeng Fuhua
(College of Life Science and Technology，Zhanjiang Normal University Zhanjiang 524048)
Abstract: In this study，the hypocotyls germinated from the seeds of Eucalyptus urophylla U6 were used as explants，
and the different plant growth substance combinations for the regeneration and conditions for genetic transformation of E．
urophylla were optimized by an orthogonal test． The TSRF1 gene was confirmed to integrate into the E． urophylla genome
by PCR and Southern blotting． The transgenic E． urophylla markedly enhanced the disease resistance to Ralstonia
solanacearum． The transgenic plants had stronger resistance to the leaf disease infested with Phytophthora． After
inoculation with R． solanacearum，the activity of PPO，PAL and SOD significantly increased． The expression of TSRF1
gene was increased after inoculation with diseases，detected by the method of Real-time PCR． These results suggested that
expression of the TSRF1 gene could improve broad-spectrum disease resistance in the transgenic E． urophylla．
Key words: Eucalyptus urophylla; TSRF1; genetic transformation; broad-spectrum disease resistance
桉树原产澳大利亚，是桃金娘科(Myrtaceae)杯
果木属 ( Angophora )、伞房属 ( Corymbia ) 和桉属
(Eucalyptus)植物的统称，有 1 039 个种、亚种和变
种。据统计，全世界桉树人工林面积超过2 000万
hm2(Dibax et al．，2010)。由于桉树生长速度快、轮
伐期短、耐干旱、耐瘦瘠、适应性广，且用途广泛，
经济效益高，现已被世界近百个国家与地区引种，
遍布于地中海地区、东南亚、美洲和非洲，目前已成
为世界公认的三大人工林树种之一(Alcantara et al．，
2011)。我国引种桉树已有 100 多年历史，在 17 个
省(区)种植，每年新营造桉树林达 30 万 hm2，到
2011 年，中国桉树人工林面积达到 368 万 hm2，占
全国人工林面积的 6%以上，年生产木材近4 000万
m3，占国内自主生产纸浆材的 50%以上，每年带来
的经济效益多达2 000亿元(杨民胜等，2011)。
随着大面积桉树纯林的营造，桉树青枯病等细
菌性病害流行也愈加严重，成为桉树人工林发展的
重大障碍(王艳丽等，2011)。由于利用化学方法进
行防治效果不显著，加之对环境的副作用大，因
此，培育广谱抗病新品种是解决问题的根本措施。
桉属树种是异花授粉的多年生木本植物，杂种后代
严重分离变异，利用基因工程育种可弥补常规育种
第 4 期 欧阳乐军等: 转 TSRF1 基因尾叶桉的培育及其广谱抗病性
技术的不足，缩短育种周期，加速优质、高抗新品
种的选育进程(欧阳乐军等，2008)。本研究以尾叶
桉(Eucalyptus urophylla)U6 无菌种子苗下胚轴为外
植体，通过对培养基的优化，建立该树种的组织培
养再生体系，运用正交设计对影响尾叶桉遗传转化
效率的影响因素进行了研究，建立尾叶桉遗传转化
体系。将 TSRF1 基因转入尾叶桉，研究转基因植株
抗病能力的变化，为桉树抗病转基因育种提供一定
的参考。
1 试验材料
1. 1 植物材料
尾叶桉 U6 无性系种子由中国林业科学研究院
桉树研究与开发中心提供。
1. 2 菌种与质粒
质 粒 pROK2、根 癌 农 杆 菌 ( Agrobacterium
tumefaciens)LBA4404 均由中国农业科学院生物技
术研究所黄荣峰博士提供。 pROK2 质粒包含有
TSRF1 基因，该基因通过与植物抗病相关的顺式作
用元件相互作用，调控下游抗病相关基因表达。
1. 3 试剂
新型脲类细胞分裂素(PBU)由本实验室李再峰
教授提供; 2，4 － 二氯苯氧乙酸 (2，4-D)、吲哚 －
3 －丁酸( IBA)、萘乙酸 ( NAA)、吲哚乙酸 ( IAA)、
6 －苄基腺嘌呤(6-BA)、亚精胺( Spd)、腐胺( Put)、
维生素 C (Vc)、N －苯基 － N － 1，2，3 －噻二唑 －
5 －脲(TDZ)、PCR 试剂盒均购自生工生物工程(上
海)有限公司，Southern 杂交试剂盒购自 Roche 公
司的 DIG DNA Labeling and Detection Kit，其他试剂
为国产分析纯。
2 试验方法
2. 1 尾叶桉高效再生体系建立
2. 1. 1 愈伤组织的诱导 尾叶桉无菌种子苗高
3 ～ 5 cm 时，将其下胚轴切成 0. 5 ～ 1. 0 cm 长的小
段，接种于以 MS + Vc 100 mg·L － 1 + 蔗糖 30 g·L － 1 +
琼脂 7 g·L － 1为基本培养基、附加不同浓度梯度的
6-BA和 2，4-D 或 TDZ 和 2，4-D 的培养基上，2 周后
统计愈伤组织诱导率。
2. 1. 2 不定芽的诱导及分化 将长势良好的外植
体转入不定芽诱导培养基上，基本培养基为 BS(MS
有机由 B5 有机替代) + 腐胺 500 μmol·L － 1 + 亚精
胺 100 μmol·L － 1 + Vc 100 mg·L － 1 +蔗糖 30 g·L － 1 +
琼脂 7 g·L － 1，附加不同浓度梯度的 6-BA，IBA 和
TDZ。10 天左右更换新鲜培养基，25 天后统计出芽
率。
2. 1. 3 不同基本培养基以及植物生长调节剂对不
定芽伸长的影响 长度小于 0. 5 cm 的短小芽丛转
移到伸长培养基中，基本培养基为 BS 或 1 /2MS，
附加 Vc 100 mg·L － 1、蔗糖 30 g·L － 1、琼脂 7 g·L － 1，
以及不同浓度梯度的 PBU 和 NAA，30 天后观察不
定芽伸长情况。
2. 1. 4 再生苗的生根 将 3 ～ 5 cm 高的丛生芽切
成单株后分别转入 1 /2MS 培养基中，附加不同浓度
梯度的 IAA 与 NAA，20 天后统计生根情况。
2. 2 遗传转化体系优化的正交试验
采用农杆菌介导法将含质粒 pROK2 的菌液浸
染尾叶桉愈伤组织，按 L9(3
4)正交表设计试验，用
50 mg·L － 1 Kan 为抗生素筛选浓度，以抗性不定芽
诱导率为指标，考察预培养时间(5，7，9 天)、共培
养时间 ( 6，8，10 天 )、浸染时间 ( 0. 5，1. 0，1. 5
天)、菌液 OD 值(0. 5，0. 6，0. 7)4 个因素对抗性不
定芽诱导率的影响，每个因素设 3 个水平。
2. 3 转基因植株的分子检测
尾叶桉基因组 DNA 采用 CTAB 法微量提取。
以拟转化植株基因组 DNA 为模板进行 PCR 检测，
以质粒 pROK2 作阳性对照。用 Roche 公司 DIG
DNA Labeling and Detection Kit 进行 Southern 杂交
检测，操作步骤按说明书进行。
2. 4 转基因尾叶桉的抗病性检测
2. 4. 1 转基因尾叶桉抗病接种 待植株幼苗生长
到 5 ～ 6 叶期，参照 He 等(1983)伤根浇注菌液接种
法(土壤接种法青枯菌接种试验)。青枯病的病情
指数及抗性级别计算方法参照华静月等 (1984)的
方法。
2. 4. 2 离体叶片抗病性调查 将转化植株离体叶
片用灭菌水冲洗干净，擦去叶片表面的水分后，放
置在垫有多层滤纸的培养皿上，将带菌丝的疫霉菌
小菌饼块紧贴在叶柄上，在 25 ℃条件下保湿培养 3
天后，调查叶片发病情况。
2. 4. 3 转基因植株抗性相关酶活性测定 注射器
针筒尖端摩擦按压接种转基因植株的叶片 72 h 后，
剪下植株叶片进行相关生理指标的测定。CAT，
PAL，POD， PPO， SOD 活 性 测 定 参 考 Agarwal
(2007)的方法。H2 O2，MDA 含量测定参考 Lin 等
(2000)的方法。
2. 4. 4 转基因植株 TSRF1 基因荧光定量 PCR 分析
转基因植株分别接种青枯菌、疫霉菌和焦枯病菌 12 h
后，提取转基因植株总 RNA，在 BIO-RAD Real-Time
PCR System 上进行 Real-time PCR 分析，用相对定量
74
林 业 科 学 49 卷
的 Pfaffl 公式计算 TSRF1 基因扩增效率。
2. 5 数据统计与分析
每个试验处理均设置 5 个重复。培养条件为温
度(25 ± 2)℃，光照强度约 32. 5 μmol·m － 2 s － 1，光
照时间 12 h·d － 1。数据利用 SAS 分析软件进行处
理，文中百分率数据分析时经过正弦平方根转换。
3 结果与分析
3. 1 尾叶桉高效再生体系建立
3. 1. 1 愈伤组织的诱导 由表 1 可知，在不同浓
度的植物生长调节剂组合处理下的愈伤组织诱导率
差异达到显著水平。当 6-BA 浓度为 0. 6 mg·L － 1、
2，4-D 浓度为 0. 1 mg·L － 1时，愈伤组织呈现活力最
好的淡绿色，愈伤组织诱导率达到 95. 0%，外植体
褐化率最低。在不同浓度的 2，4-D 与 TDZ 组合诱
导下，愈伤组织的诱导率为 38. 3% ～ 96. 7% ; 当
2，4-D 0. 1 mg·L － 1、TDZ 为 2 μmol·L － 1时愈伤组织
诱导率达到 96. 7%，但愈伤组织呈白色和黄色，活
力不如 6-BA 与 2，4-D 组合处理的好，且有玻璃化
愈伤组织产生，不利于后续芽的分化。
表 1 不同植物生长调节剂组合对愈伤组织诱导的影响①
Tab． 1 Effects of combinations of different plant growth regulators on callus induction
2，4-D /
(mg·L － 1 )
6-BA /
(mg·L － 1 )
TDZ /
(μmol·L － 1 )
外植体数
Explant number
愈伤组织块数
Callus number
诱导率
Induction rate(% )
0. 1 0. 2 — 60 45 75 ± 1. 3 CD
0. 2 0. 2 — 60 30 50 ± 1. 1HK
0. 3 0. 2 — 60 21 35 ± 1. 6 L
0. 1 0. 4 — 60 50 83. 3 ± 1. 4 BC
0. 2 0. 4 — 60 53 88. 3 ± 1. 7 BC
0. 3 0. 4 — 60 38 63. 3 ± 1. 3 EGI
0. 1 0. 6 — 60 57 95. 0 ± 3. 1AB
0. 2 0. 6 — 60 54 90. 0 ± 1. 8ABC
0. 3 0. 6 — 60 39 65 ± 2. 6DE
0. 1 — 1 60 55 91. 7 ± 2. 3AB
0. 2 — 1 60 39 65 ± 1. 1DE
0. 3 — 1 60 23 38. 3 ± 2. 1 J
0. 1 — 2 60 58 96. 7 ± 4. 3A
0. 2 — 2 60 42 70 ± 2. 4DE
0. 3 — 2 60 35 58. 3 ± 1. 6 EH
0. 1 — 3 60 54 90. 0 ± 1. 8ABC
0. 2 — 3 60 48 80. 0 ± 2. 3 C
0. 3 — 3 60 31 51. 7 ± 2. 5 FH
①同列中不同字母表示差异极显著(P ＜ 0. 01)。下同。The data marked with different letters in the same column are significantly different (P ＜
0. 01) ． The same below．
3. 1. 2 不定芽的诱导及分化 不同浓度的植物生
长调节剂组合对不定芽的诱导率差异显著(表 2)。
IBA 浓度过高时不利于芽的诱导，最适浓度为 0. 2
mg·L － 1。当 TDZ 为 5 μmol·L － 1时，诱芽率略有降
低，优胜芽率明显下降。当 TDZ 为 3 μmol·L － 1、
6-BA为 0. 5 mg·L － 1时，诱芽率最高可达 66. 7%，优
胜芽率也能达到 51. 7%。
表 2 不同植物生长调节剂对不定芽诱导的影响
Tab． 2 Effects of combinations of different plant growth regulators on adventitious shoot induction
植物生长调节剂 Plant growth substance
6-BA /
(mg·L － 1 )
TDZ /
(μmol·L － 1 )
IBA /
(mg·L － 1 )
外植体数
Explant
number
出芽数
Adventitious
bud number
诱导率
Induction
rate(% )
优胜芽数
Good adventitious
bud number
优胜芽率
Rate of good
adventitious buds (% )
0. 5 — 0. 1 60 11 18. 3 ± 1. 63 I 4 6. 7 J
0. 5 — 0. 2 60 24 40. 0 ± 1. 9 BD 21 35. 0 BD
0. 5 — 0. 3 60 22 36. 7 ± 2. 3 BCE 16 26. 7 E
0. 5 — 0. 4 60 21 35. 0 ± 1. 1 BCE 17 28. 3 C
0. 5 3 0. 1 60 20 33. 3 ± 2. 4 C 11 18. 3GI
0. 5 3 0. 2 60 40 66. 7 ± 2. 8A 31 51. 7A
0. 5 3 0. 3 60 27 45. 0 ± 1. 1 B 18 30. 0 BCE
0. 5 3 0. 4 60 23 38. 3 ± 1. 7 BCF 15 25. 0 EF
0. 5 5 0. 1 60 19 31. 7 ± 2. 3 EHJ 7 11. 7HJ
0. 5 5 0. 2 60 21 35. 0 ± 3. 4 BCE 12 20. 0 FG
0. 5 5 0. 3 60 22 36. 7 ± 2. 2 BCE 14 23. 3 F
0. 5 5 0. 4 60 12 20. 0 ± 2. 5GI 3 5. 0 J
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第 4 期 欧阳乐军等: 转 TSRF1 基因尾叶桉的培育及其广谱抗病性
3. 1. 3 不定芽的伸长 由表 3 可知，NAA 和 PBU
所有浓度组合均能使短小芽丛伸长，在 NAA 浓度
0. 05 mg·L － 1时，芽苗生长情况较好。相对于 BS 基
本培养基，1 /2MS 对不定芽的诱导效果要好;
1 /2MS培养基添加 0. 6 mg·L － 1 的 PBU 及 0. 05
mg·L － 1的 NAA，伸长达到 2. 0 cm 以上的不定芽比
率达到 82. 3%，且增殖的芽丛数也较多，叶片
嫩绿。
表 3 不同培养基对不定芽伸长的影响①
Tab． 3 Effects of different culture media on shoot elongation
植物生长调节剂
Plant growth substance
基本培养基
Basal medium
NAA /
(mg·L － 1 )
PBU /
(mg·L － 1 )
1 /2MS BS
2. 0 cm 以上芽所占百分比
Rate of 2. 0 cm
longer shoot(% )
芽生长情况
Character of
adventitious buds
2. 0 cm 以上芽所占百分比
Rate of 2. 0 cm
longer shoot(% )
芽生长情况
Character of
adventitious buds
0. 01 0. 2 12. 5 ± 2. 2G － 31. 3 ± 3. 3H －
0. 01 0. 6 40. 2 ± 2. 9 E + 39. 8 ± 2. 4G －
0. 01 1. 0 33. 8 ± 2. 2 F + 37. 5 ± 3. 3GH +
0. 05 0. 2 73. 7 ± 3. 9 B + + 50. 7 ± 4. 5 F +
0. 05 0. 6 82. 3 ± 4. 3A + + + 80. 1 ± 5. 2A + + +
0. 05 1. 0 71. 3 ± 2. 1 B + + + 78. 2 ± 3. 4A + +
0. 10 0. 2 76. 3 ± 3. 5AB + + + 75. 8 ± 1. 1AC + +
0. 10 0. 6 40. 5 ± 3. 6 CE － 51. 4 ± 1. 9DF + +
0. 10 1. 0 70. 0 ± 3. 1 BD + + 63. 5 ± 3. 7 BE +
① － : 差; + : 一般; + + : 较好; + + + : 好。－ : Character of adventitious buds is poor; + : Character of adventitious buds is normal; + + :
Character of adventitious buds is good; + + + : Character of adventitious buds is very good．
3. 1. 4 再生苗的生根 由表 4 可知，不定芽在接
种第 9 ～ 10 天开始生根，第 12 ～ 13 天出根达到高
峰期。当 NAA 为 0. 5 mg·L － 1，IAA 为 0. 2 mg·L － 1
时，平均生根数达到 9. 6 条，平均根长达到 2. 5 ～
3. 0 cm，为较好的诱导生根的植物生长调节剂
组合。
表 4 不同植物生长调节剂对生根的影响
Tab． 4 Effects of combinations of different plant growth regulators on rooting
NAA /
(mg·L － 1 )
IAA /
(mg·L － 1 )
平均生根数
Mean rooting number
平均根长
Mean length of roots / cm
生根状况
Character of rooting
0. 1 0. 2 7. 4 1. 0 ～ 1. 5 根纤细，侧根较少 The roots was slender and showed few lateral roots
0. 1 0. 6 6. 9 1. 0 ～ 1. 5 根过于纤细，须根多 The roots with more fibrous roots was very slender
0. 1 1. 0 6. 3 1. 5 ～ 2. 0 根纤细，根毛较多 The roots with more root hairs was slender
0. 5 0. 2 9. 6 2. 5 ～ 3. 0 根生长快
，侧根较多，根系发达
The roots with strong root system grew rapidly，showing more lateral roots
0. 5 0. 6 8. 7 2. 0 ～ 2. 5 根纤细，须根多 The roots with more fibrous roots was slender
0. 5 1. 0 6. 3 2. 5 ～ 3. 0 根纤细
，侧根较多，根系发达
The strong root system was slender，showing more lateral roots
1. 0 0. 2 5. 3 2. 0 ～ 2. 5 根纤细，须根多 The roots with more fibrous roots was slender
1. 0 0. 6 3. 8 0. 5 ～ 1. 0 根粗壮，侧根较少 The roots with a few lateral roots was thick
1. 0 1. 0 3. 2 0. 3 ～ 0. 5 根粗壮，无侧根 The roots was thick and no lateral roots were observed
3. 2 遗传转化参数的正交试验 L9(3
4)结果
遗传转化参数优化的正交试验结果见表 5。各
因素不同水平的抗性不定芽诱导率不同，其中组合
6 为最佳 水 平 组 合，抗 性 不 定 芽 诱 导 率 高 达
52. 8%。各因素对不定芽诱导率的影响大小依次为
共培养时间 ＞预培养时间 ＞ 浸染时间 ＞ 菌液浓度，
其中共培养时间对不定芽诱导率的影响最显著，而
菌液浓度影响最小。最优组合为 A2B3C1D2，即预
培养 7 天、菌液浓度 0. 7、浸染 0. 5 h 和共培养 8 天。
应用方差分析法(表 6)可知: 试验设计的共培
养时间、预培养时间 2 个因素对抗性不定芽的诱导
率有极显著影响; 菌液浓度、浸染时间在不同水平
下对抗性不定芽的诱导率差异也达到显著水平。
94
林 业 科 学 49 卷
表 5 正交试验结果
Tab． 5 The results of orthogonal experiments
编号
No．
A
预培养时间
Pre-culture time / d
B
菌液浓度
Agrobacterium concentration
C
浸染时间
Infection time / h
D
共培养时间
Co-infection time / d
不定芽分化率
Shoot differentiation
rate(% )
1 1 1 1 1 12. 50
2 1 2 2 2 42. 3
3 1 3 3 3 6. 48
4 2 1 2 3 9. 9
5 2 2 3 1 13. 90
6 2 3 1 2 52. 8
7 3 1 3 2 21. 80
8 3 2 1 3 5. 50
9 3 3 2 1 11. 90
k1 20. 4 14. 7 23. 6 12. 8
k2 25. 5 20. 6 21. 4 39. 0
k3 13. 1 23. 7 14. 1 7. 7
极差 Range 12. 4 8. 8 9. 5 31. 3
表 6 正交试验结果的方差分析①
Tab． 6 The results of analysis of variance
编号 No． 变异来源 Source 平方和 SS 自由度 DF 均方 MS F
1 预培养时间 Pre-culture time 40. 7 2 20. 35 4. 5＊＊
2 菌液浓度 Agrobacterium concentration 6. 3 2 3. 15 0. 7 *
3 浸染时间 Infection time 17. 0 2 8. 5 1. 89 *
4 共培养时间 Co-infection time 666. 3 2 333. 16 74. 03＊＊
误差 Error 36. 3 8 4. 5
①* : 差异显著; ＊＊: 差异极显著。* : Significant difference at P0. 05 ; ＊＊: Highly significant difference at P0. 01 ．
经农杆菌浸染后的愈伤组织(图 1A，B)转入抗
性不定芽诱导(图 1C)，再经不定芽增殖(图 1D)、
伸长(图 1E，F)以及生根培养(图 1G)，最后移栽
得到完整的再生植株(图 1H)。
3. 3 拟转化植株的分子检测
任意选取 20 株拟转化植株，进行 PCR 检测，
结果发现共有 4 株转化植株扩增到目的条带，PCR
阳性率为 20% (图 2A )。图 2B 中 PCR-Southern
blotting 检测结果表明，杂交膜上含有能显色的目的
基因片段，大小为 250 bp，说明目的基因已插入到
尾叶桉基因组中。
3. 4 转基因植株抗性接种结果
3. 4. 1 转基因尾叶桉抗病接种 使用伤根接种的
方法接种青枯菌。接种 3 天后，非转基因植株开
始发病(图 3)，转基因植株则在接种后第 7 天出
现发病株。对照植株在接种 12 天时病情指数达
到 86. 5，发病率为 100%，其中 86. 7% 的植株全
株枯萎死亡。而转基因植株病情指数在接种 19
天时为 55. 4，存活率达到 54. 5%，转基因尾叶桉
较对照提高 2 ～ 2. 9 个抗性级别，评价为中等抗病
水平。
3. 4. 2 转化植株离体叶片抗病性结果 未转基
因尾叶桉离体叶片接种疫霉菌 3 天后，开始表现
出病症，叶片出现明显的水渍状，而转 TSRF1 尾
叶桉叶片无致病症状出现。直到 6 天后，转基因
植株才在与病菌接触的叶柄附近出现水渍症状病
症，而此时未转基因植株病症明显，整个叶片
腐烂。
3. 5 转基因植株酶活性测定
转基因尾叶桉叶片接种青枯菌后，CAT 活性由
229. 1 U·g － 1 FW 降低到 152. 3 U·g － 1 FW，降到原
来的 33. 5%，POD 活性由 89. 0 U·g － 1 FW 降低到
75. 0 U·g － 1 FW，降到原来的 15. 7% ;而 SOD 活性
由 114. 5 U·g － 1 FW 升高到 174. 3 U·g － 1 FW，增幅
为 50. 4%，PPO 和 PAL 活性均比没有接种的植株
有所提高，差异达到极显著水平(图 4)。转基因植
株接种青枯菌后，H2 O2含量增幅 30% 以上，MDA
含量则由 2. 42 μmol· g － 1 FW 降低到 1. 4 μmol·g － 1
FW，降幅为 70% (图 4)。
3. 6 转基因植株 TSRF1 基因荧光定量 PCR 分析
转基因植株接种致病后，TSRF1 基因转录效率
都得到一定量的提高(图 5)。其中接种青枯菌 12 h
后，TSRF1 基因转录效率提高到本底表达的 9. 1
倍，最低是接种水杨酸，也提高了 6. 5 倍。
05
第 4 期 欧阳乐军等: 转 TSRF1 基因尾叶桉的培育及其广谱抗病性
图 1 尾叶桉的遗传转化
Fig． 1 The genetic transformation procedures of E． urophylla
A，B． 愈伤组织; C． 不定芽诱导; D． 不定芽的增殖; E，F． 不定芽伸长; G． 生根; H．移栽。
A，B． Callus inoculated; C． Induction of resistance shoots; D． Differentiation of resistant adventitious buds; E，F．
Elongation of resistant shoots; G． Rooting of elongated shoot; H． Plants in a plastic pot in greenhouse．
图 2 拟转基因尾叶桉的分子检测
Fig． 2 Detection of some putative transgenic E． urophylla
A: 拟转基因尾叶桉的 PCR 检测 M: 100 bp ladder Marker; O: 阴性对照; P: 阳性对照; 1 － 20: 转基因
植株。B: 转基因尾叶桉 PCR- Southern blotting 检测 M: DL5000 bp Marker; 1: 阳性对照; 2: 阴性对
照; 3 － 5: TSRF1 条带。
A: PCR detection of some putative transgenic E． urophylla M: 100 bp ladder Marker; O: Non-transgenic
plant; P: Positive control; 1 － 20: Transgenic plants． B: The PCR- Southern blotting detection of transformed
E． urophylla M: DL5000 bp Marker; 1: Positive control; 2: Negative control; 3 － 5: TSRF1 gene．
图 3 青枯菌接种 3 天后致病情况
Fig． 3 The incidence investigation of E． urophyllas leaves
in the 3th day after inoculation with Ralstonia solanacearum
NT: 非转基因植株 Non-transgenic E． urophylla; T: 转 基因植株
Transgenic E． urophylla．
4 讨论
桉树转基因成功的关键在于建立高效的组织培
养再生体系和遗传转化体系。桉树是多年生木本植
物，其细胞返幼状态差，难以脱分化，也难于分化
成芽，外植体也极易褐化，因此，在组织培养中诱
导愈伤组织形成和分化均有较大难度。本实验室利
用 PBU 和其他植物生长调节剂组合成功建立了尾
巨桉(Eucalyptus urophylla × E． grandis)、广州一号
桉(E． urophylla × E． tereticornis‘Guangzhou No． 1’)
等的高效再生体系(欧阳乐军等，2011; 2012)，不
定芽诱导率都可达到 90%以上。在本试验中，通过
优化不同浓度及种类的植物生长调节剂组合，尾叶
15
林 业 科 学 49 卷
图 4 尾叶桉相关生理指标变化
Fig． 4 The change of the physiological indexes of E． urophylla
NT: 非转基因植株; T: 转基因植株; T-Rs: 接种青枯菌的转基因植株; SOD: 超氧化物歧化酶; CAT:
过氧化氢酶; PPO: 多酚氧化酶; PAL: 苯丙氨酸解氨酶; POD: 过氧化物酶;H2 O2 : 过氧化氢;MDA:
丙二醛。不同字母表示差异极显著(P ＜ 0. 01)。
NT: Non-transformed E． urophylla; T: Transgenic E． urophylla; T-Rs: Transgenic plants inoculated with R．
solanacearum; SOD: Superoxide dismutase; CAT: Catalase; PPO: Polyphenol oxidase; PAL: Phenylalanine
ammonia-lyase; POD: Peroxidase; H2 O2 : Hydrogen peroxide; MDA: Malondialdehyde． Different letters
indicate the significant difference(P ＜ 0. 01) ．
图 5 TSRF1 基因表达特性分析
Fig． 5 Induced expression characteristics analysis of TSRF1 gene
桉愈伤组织诱导率达到 95%以上，且活力旺盛，后
续不定芽的分化与增殖较好，生根及移栽成活率均
可达到 95%以上。
研究表明，农杆菌转化植物细胞是一复杂的过
程，最初是农杆菌对植物细胞的附着，接着是农杆
菌的 vir 基因受诱导活化，最后是 T-DNA 的转移以
及在植物细胞核基因组中的整合与表达等，因此，
外植体的基因型及生理状态、农杆菌菌液浓度及浸
染时间等都对外源基因转化效率有较大的影响(王
关林等，2002)。本研究中通过正交试验优化遗传
转化参数，建立了尾叶桉遗传转化体系，抗性芽的
诱导 率 可 达 到 50% 左 右，经 PCR 和 Southern
blotting 检测结果表明，阳性植株比率达到 20%，高
于本试验前期报道的结果(Ouyang et al．，2012)。研
究发现，预培养 7 天时外植体脱分化旺盛，形成胚
性愈伤组织，是良好的感受态细胞，此时，农杆菌
可以很容易和分裂细胞结合，提高转化效率; 同
时，通过 7 天预培养，外植体伤口愈合，两端形成
亚铃状的突起，从而降低了农杆菌对外植体的伤
害，外植体褐化死亡减少，有利于抗性芽的分化。
共培养时间也是影响转化效率的一个重要因素，通
过适宜时间的共培养，防止农杆菌过度生长影响外
植体的活力，减轻外植体与农杆菌长时间接触而受
伤害程度; 同时，适宜时间的共培养也可避免农杆
菌与外植体接触不充分而降低转化效率。本研究中
发现，在尾叶桉遗传转化体系中，共培养 8 天时，
有利农杆菌充分整合到外植体脱分化细胞，进而降
低假阳性植株的比率，提高转化效率。浸染时间和
菌液浓度对转化也有一定的影响，适宜的浸染时间
和菌液浓度既可避免农杆菌对植物细胞的毒害作用
又可使菌液与外植体充分接触，提高转化率。在本
研究中，农杆菌菌液浓度在 OD600 = 0. 7，浸染 0. 5 h
时，转化率最高。
危害桉树的病害种类很多，其中青枯病、焦枯
病、灰霉病、茎腐病等细菌型和真菌型病害最为严
重，而具广谱性抗病的目的基因太少，转化的抗病
基因抗病范围有限，抗病范围过窄，一种基因只对
个别的病原产生抗性，因此应选用具广谱抗病性基
因，扩大抗病范围，提高转基因桉树的综合抗病的
能力和实际应用效果。研究表明 TSRF1 通过与植
物抗病相关的顺式作用元件相互作用，调控下游相
关抗病基因表达，参与植物抗病相关的乙烯、水杨
酸和茉莉素信号途径和 ABA 信号途径的调控(张洪
博，2005)。本研究中转 TSRF1 基因尾叶桉接种细
菌性病原体青枯菌后，表现发病延迟，抗性提高，
25
第 4 期 欧阳乐军等: 转 TSRF1 基因尾叶桉的培育及其广谱抗病性
较对照最高可提高 2. 9 个抗性级别; 而对真病型病
原体疫霉菌的离体叶片抗性接种结果也表明转
TSRF1 尾叶桉抗性比非转基因植株明显要强，发病
延迟，病症减轻。
大量研究证实，SOD、PAL、PPO 等是与植物抗
病性密切相关的酶，是植物抗逆性强弱的指标之
一。研究表明，当生物或非生物逆境作用于植物时
往往引起植物细胞中的氧化爆发 ( Bestwick et al．，
1997)。然而过量的活性氧会造成氧化胁迫，使细
胞产生细胞水平和分子水平上的不可逆损伤。植株
体内的保护酶系统又不断清除活性氧，使得植物体
内活性氧代谢维持在平衡状态。本研究发现，转基
因尾叶桉接种青枯菌后 SOD 活性增幅达 50%以上，
PPO 和 PAL 活性均与没有接种的植株差异达到极
显著水平，通过酶活性的提高有效缓解了接种病菌
对植株造成的伤害( Fletcher et al．，2006)。曾富华
等(2005)报道 H2 O2可做为抗病信号，能激活植物
与抗病相关的代谢过程，增强抗病能力。本试验中
的转基因植株接种青枯菌后，MDA 含量大幅下降，
使得 H2 O2含量增加 30%以上，从而可能激活了植
株与抗病相关的代谢过程，增强抗病能力。荧光定
量 PCR 结果也表明，转基因植株接种致病菌后，
TSRF1 基因转录效率都得到一定量的提高，且表现
出对多种致病因子应答，最高转录表达倍数可提高
近 10 倍左右。上述研究结果初步表明 TSRF1 基因
能在一定程度提高植株的广谱抗病能力。
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(责任编辑 徐 红)
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