全 文 ：第 源怨 卷 第 圆 期
圆 园 员 猿 年 圆 月
林 业 科 学
杂悦陨耘晕栽陨粤 杂陨蕴灾粤耘 杂陨晕陨悦粤耘 灾燥造郾 源怨袁晕燥郾 圆云藻遭援 袁圆 园 员 猿
凿燥蚤院员园援员员苑园苑 辕 躁援员园园员鄄苑源愿愿援圆园员猿园圆园苑
收稿日期院 圆园员圆 原 园怨 原 员缘曰 修回日期院 圆园员圆 原 员园 原 圆远遥
基金项目院 国家现代农业产业技术体系建设专项渊悦粤砸杂鄄圆圆冤曰 重庆市蚕桑重大科技专项渊悦杂栽悦袁 圆园园怨粤粤员园圆源冤遥
鄢余茂德为通讯作者遥
桑树查尔酮异构酶基因的克隆与原核表达分析鄢
刘长英摇 赵爱春摇 李摇 军摇 吕蕊花摇 余亚圣摇 王茜龄摇 鲁摇 成摇 余茂德
渊西南大学生物技术学院摇 家蚕基因组生物学国家重点实验室摇 重庆 源园园苑员缘冤
摘摇 要院 摇 以果叶兼用新桑品种耶嘉陵 猿园 号爷的果实为材料袁采用同源克隆法和抑制 孕悦砸法克隆桑树查尔酮异构
酶基因渊酝葬悦匀陨冤全序列遥 该基因的基因组序列全长圆 源园圆 遭责袁包含圆 员员圆 遭责长的 韵砸云 和 圆怨园 遭责 长的 猿忆哉栽砸 序列袁
韵砸云由 源 个外显子和 猿 个内含子组成袁该基因编码 圆员怨 个氨基酸遥 预测 酝葬悦匀陨编码蛋白质的分子质量为 圆猿郾 愿 噪怎袁
理论等电点为 缘郾 圆怨遥 采用 砸栽鄄孕悦砸法分析 酝葬悦匀陨在不同组织中的表达水平袁在叶片和果中的表达量较高袁在根中
表达量较低遥 构建 责耘栽鄄圆愿葬渊垣冤鄄酝葬悦匀陨原核表达重组质粒袁并在大肠杆菌中诱导表达遥
关键词院 摇 桑树曰 查尔酮异构酶曰 基因克隆曰 组织表达曰 原核表达
中图分类号院 杂苑员愿郾 源远摇 摇 摇 文献标识码院 粤摇 摇 摇 文章编号院 员园园员 原 苑源愿愿渊圆园员猿冤园圆 原 园园猿怨 原 园苑
悦造燥灶蚤灶早 葬灶凿 孕则燥噪葬则赠燥贼蚤糟 耘曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 悦澡葬造糟燥灶藻 陨泽燥皂藻则葬泽藻
郧藻灶藻 枣则燥皂 酝怎造遭藻则则赠 渊酝燥则怎泽 葬造遭葬冤
蕴蚤怎 悦澡葬灶早赠蚤灶早摇 在澡葬燥 粤蚤糟澡怎灶摇 蕴蚤 允怎灶摇 蕴俟 砸怎蚤澡怎葬摇 再怎 再葬泽澡藻灶早摇 宰葬灶早 载蚤造蚤灶早摇 蕴怎 悦澡藻灶早摇 再怎 酝葬燥凿藻
渊杂贼葬贼藻 运藻赠 蕴葬遭燥则葬贼燥则赠 燥枣 杂蚤造噪憎燥则皂 郧藻灶燥皂藻 月蚤燥造燥早赠摇 悦燥造造藻早藻 燥枣 月蚤燥贼藻糟澡灶燥造燥早赠袁 杂燥怎贼澡憎藻泽贼 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠摇 悦澡燥灶早择蚤灶早 源园园苑员缘冤
粤遭泽贼则葬糟贼院 摇 栽澡藻 酝葬悦匀陨 早藻灶藻 憎葬泽 糟造燥灶藻凿 枣则燥皂 贼澡藻 则蚤责藻 枣则怎蚤贼 燥枣 酝燥则怎泽 葬造遭葬 耶 允蚤葬造蚤灶早 猿园爷 遭赠 澡燥皂燥造燥早燥怎泽 糟造燥灶蚤灶早 葬灶凿
泽怎责责则藻泽泽蚤燥灶 孕悦砸援 栽澡藻 枣怎造造鄄造藻灶早贼澡 早藻灶燥皂蚤糟 泽藻择怎藻灶糟藻 燥枣 酝葬悦匀陨 蚤泽 圆 源园圆 遭责 蚤灶 造藻灶早贼澡袁 憎蚤贼澡 贼澡藻 猿忆哉栽砸 燥枣 圆怨园 遭责 葬灶凿 贼澡藻
燥责藻灶 则藻葬凿蚤灶早 枣则葬皂藻 渊韵砸云冤 燥枣 圆 员员圆 遭责援 陨贼泽 韵砸云 糟燥灶泽蚤泽贼泽 燥枣 枣燥怎则 藻曾燥灶泽 葬灶凿 贼澡则藻藻 蚤灶贼则燥灶泽袁 葬灶凿 蚤贼泽 糟阅晕粤 藻灶糟燥凿藻泽 圆员怨
葬皂蚤灶燥 葬糟蚤凿泽援 栽澡藻 责怎贼葬贼蚤增藻 皂燥造藻糟怎造葬则 憎藻蚤早澡贼 燥枣 贼澡藻 责则燥贼藻蚤灶 藻灶糟燥凿藻凿 遭赠 酝葬悦匀陨 早藻灶藻 蚤泽 圆猿郾 愿 噪怎 葬灶凿 蚤贼泽 贼澡藻燥则藻贼蚤糟葬造
蚤泽燥藻造藻糟贼则蚤糟 责燥蚤灶贼 蚤泽 缘郾 圆怨援 栽澡藻 砸栽鄄孕悦砸 憎葬泽 怎泽藻凿 贼燥 葬灶葬造赠扎藻 贼澡藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 造藻增藻造泽 燥枣 酝葬悦匀陨 蚤灶 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 贼蚤泽泽怎藻泽袁 葬灶凿 蚤贼泽
藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 造藻增藻造 憎葬泽 澡蚤早澡 蚤灶 造藻葬增藻泽 葬灶凿 枣则怎蚤贼泽袁 葬灶凿 则藻造葬贼蚤增藻造赠 造燥憎 蚤灶 则燥燥贼泽援 粤 责则燥噪葬则赠燥贼蚤糟 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 责造葬泽皂蚤凿袁
责耘栽鄄圆愿葬 渊 垣 冤鄄酝葬悦匀陨 憎葬泽 糟燥灶泽贼则怎糟贼藻凿 葬灶凿 贼则葬灶泽枣燥则皂藻凿 蚤灶贼燥 耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤 枣燥则 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶援 栽澡蚤泽 泽贼怎凿赠 憎蚤造造 澡藻造责 藻泽贼葬遭造蚤泽澡
贼澡藻燥则藻贼蚤糟葬造 枣燥怎灶凿葬贼蚤燥灶 枣燥则 贼澡藻 枣怎则贼澡藻则 则藻泽藻葬则糟澡 燥枣 酝葬悦匀陨援
运藻赠 憎燥则凿泽院 摇 酝燥则怎泽 葬造遭葬曰 糟澡葬造糟燥灶藻 蚤泽燥皂藻则葬泽藻曰 早藻灶藻 糟造燥灶蚤灶早曰 贼蚤泽泽怎藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶曰 责则燥噪葬则赠燥贼蚤糟 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶
摇 摇 类黄酮化合物是一类重要的植物次生代谢物
质袁具有光保护尧抗紫外线尧抗菌尧抗金属污染等生理
功能渊月蚤藻扎葬 藻贼 葬造援袁 圆园园员曰 运蚤凿凿 藻贼 葬造援袁 圆园园员曰 宰蚤灶噪藻造鄄
杂澡蚤则造藻赠袁 圆园园圆曰 月燥早泽 藻贼 葬造援袁 圆园园远冤袁还具有抗氧化尧抗
冠心病尧抗细胞毒素尧抗病毒等药理性质渊匀葬则遭燥则灶藻
藻贼 葬造援袁 圆园园园冤遥 类黄酮化合物的含量也是水果尧蔬菜
等经济作物的营养价值的重要指标遥 目前已从
缘 园园园多种植物中分离出了超过 远 园园园 种不同类型的
类黄酮化合物渊运燥藻泽 藻贼 葬造援袁 圆园园缘冤遥 控制类黄酮生物
合成的各个结构基因和转录因子已在多种植物中得
以克隆和鉴定渊匀蚤糟澡则蚤 藻贼 葬造援袁 圆园员员冤袁针对类黄酮生
物合成的基因工程应用研究也尤为活跃渊云燥则噪皂葬灶灶
藻贼 葬造援袁 圆园园员冤遥
查尔酮异构酶基因渊糟澡葬造糟燥灶藻 蚤泽燥皂藻则葬泽藻袁悦匀陨冤是
类黄酮生物合成途径的关键酶基因之一袁查尔酮异
构酶催化查尔酮异构化形成 渊 圆杂冤 原 黄烷酮或
渊圆杂冤 原 缘 原脱氧黄烷酮袁控制着类黄酮物质的合成
渊杂澡蚤皂葬凿葬 藻贼 葬造援袁 圆园园猿冤遥 植物 悦匀陨 基因最早通过抗
血清方法从菜豆 渊 孕澡葬泽藻燥造怎泽 增怎造早葬则蚤泽冤 和矮牵牛
渊孕藻贼怎灶蚤葬 伊 澡赠遭则蚤凿葬冤中克隆获得渊酝藻澡凿赠 藻贼 葬造援袁 员怨愿苑曰
增葬灶 栽怎灶藻灶 藻贼 葬造援袁 员怨愿愿 冤遥 目前已从沙梨 渊 孕赠则怎泽
责赠则蚤枣燥造蚤葬袁郧哉猿怨园缘源源 冤尧草莓 渊 云则葬早葬则蚤葬 伊 葬灶葬灶葬泽泽葬袁
粤月圆园员苑缘缘郾 员 冤尧 百 脉 根 渊 蕴燥贼怎泽 躁葬责燥灶蚤糟怎泽袁
粤月园缘源愿园员郾 员冤等上百种植物中克隆了 悦匀陨 基因遥
悦匀陨基因表达量的改变可导致类黄酮化合物合成的
变化袁已在烟草渊晕蚤糟燥贼蚤葬灶葬 贼葬遭葬糟怎皂冤尧大麻渊悦葬灶灶葬遭蚤泽
林 业 科 学 源怨 卷摇
泽葬贼蚤增葬冤尧马铃薯渊杂燥造葬灶怎皂 贼怎遭藻则燥泽怎皂冤尧番茄渊杂燥造葬灶怎皂
造赠糟燥责藻则泽蚤糟怎皂冤等植物中进行了转基因验证袁改变了类
黄酮化合物的含量渊酝怎蚤则 藻贼 葬造援袁 圆园园员曰 蕴怎噪葬泽扎藻憎蚤糟扎 藻贼
葬造援袁 圆园园源曰 晕蚤泽澡蚤澡葬则葬 藻贼 葬造援袁 圆园园缘曰 运燥糟葬 藻贼 葬造援袁 圆园园怨曰
杂噪佼则噪燥憎泽噪葬鄄栽藻造蚤糟澡燥憎泽噪葬 藻贼 葬造援袁 圆园员园冤遥
本研究以果叶兼用新桑品种 耶嘉陵 猿园 号爷
渊酝燥则怎泽 葬造遭葬耶 允蚤葬造蚤灶早 猿园爷冤为材料袁通过同源克隆法
结合抑制 孕悦砸法克隆桑树 悦匀陨基因全长序列袁并对
其进行生物信息学分析尧组织表达分析和原核表达
研究袁为 悦匀陨基因的进一步研究奠定基础遥
员摇 材料与方法
员郾 员摇 材料
桑树品种耶嘉陵 猿园 号爷 渊圆园园怨 年重庆市审定果
叶兼用品种冤栽培于西南大学生物技术学院桑树品
种资源圃遥 选取耶嘉陵 猿园 号爷健壮植株上各部位组
织袁用液氮速冻后存于 原愿园 益冰箱中备用遥
表 员摇 本研究使用的引物
栽葬遭援 员摇 孕则蚤皂藻则泽 怎泽藻凿 蚤灶 贼澡蚤泽 泽贼怎凿赠
引物名称孕则蚤皂藻则 灶葬皂藻 序列杂藻择怎藻灶糟藻
粤凿葬责贼燥则 员 缘忆鄄郧栽粤粤栽粤悦郧粤悦栽悦粤悦栽粤栽粤郧郧郧悦粤悦郧悦郧栽郧郧栽悦郧粤悦郧郧悦悦悦郧郧郧悦栽郧郧栽鄄猿忆
粤凿葬责贼燥则 圆 缘忆鄄晕匀圆 鄄粤悦悦粤郧悦悦悦鄄孕韵源 鄄猿忆粤孕员 缘忆鄄郧栽粤粤栽粤悦郧粤悦栽悦粤悦栽粤栽粤郧郧郧鄄猿忆
粤孕圆 缘忆鄄粤悦栽粤栽粤郧郧郧悦粤悦郧悦郧栽郧郧栽鄄猿忆
怎责鄄郧杂孕员 缘忆鄄悦粤栽郧悦粤郧粤郧栽悦粤粤栽粤郧郧粤悦栽鄄猿忆
怎责鄄郧杂孕圆 缘忆鄄悦栽悦栽粤粤粤郧粤粤悦栽悦郧粤悦郧郧粤悦栽悦悦鄄猿忆
凿燥憎灶鄄郧杂孕员 缘忆鄄郧悦栽栽栽栽悦悦粤粤粤郧粤栽郧粤粤栽悦悦粤栽粤鄄猿忆
凿燥憎灶鄄郧杂孕圆 缘忆鄄郧粤栽郧粤粤栽悦悦粤栽粤悦悦粤郧粤粤粤粤粤郧粤郧鄄猿忆
悦匀陨鄄员云 缘忆鄄粤悦栽粤栽粤郧郧郧悦粤悦郧悦郧栽郧郧栽鄄猿忆
悦匀陨鄄员砸 缘忆鄄郧粤再栽悦灾郧粤悦栽悦悦粤砸阅粤悦再郧悦鄄猿忆
悦匀陨鄄圆云 缘忆鄄粤栽郧郧悦栽悦栽栽粤悦郧粤悦粤郧栽悦粤悦悦鄄猿忆
悦匀陨鄄圆砸 缘忆鄄粤悦粤悦粤悦栽栽悦悦栽栽郧栽栽粤郧粤悦郧栽悦悦鄄猿忆
悦匀陨鄄猿云 缘忆鄄悦悦郧郧粤粤栽栽悦粤栽郧郧悦栽悦栽栽粤悦郧粤悦粤郧栽悦郧悦鄄猿忆
悦匀陨鄄猿砸 缘忆鄄悦悦郧悦栽悦郧粤郧郧栽悦栽栽栽栽郧栽悦栽悦栽栽栽粤粤郧悦粤鄄猿忆
粤悦栽陨晕猿鄄云 缘忆鄄粤郧粤粤悦粤悦悦悦栽郧栽栽悦栽悦悦栽悦粤悦栽鄄猿忆
粤悦栽陨晕猿鄄砸 缘忆鄄郧粤栽郧粤悦悦栽郧栽悦悦粤栽悦栽郧郧悦粤粤鄄猿忆
员郾 圆摇 基因组 阅晕粤和 砸晕粤 的提取及 糟阅晕粤第 员 链
的合成
采用 杂阅杂法渊孕葬灶 藻贼 葬造援袁 圆园园愿冤提取桑树基因组
阅晕粤袁按照 栽葬运葬砸葬公司 砸晕粤 抽提试剂盒说明书提
取总 砸晕粤遥 分别取适量体积 阅晕粤和 砸晕粤用 员豫的
琼脂糖凝胶电泳检测袁并用紫外分光光度计检测
阅晕粤及总 砸晕粤的浓度遥
以总 砸晕粤 为模板袁参照反转录酶 酝鄄酝蕴灾
渊孕则燥皂藻早葬冤说明书袁并以随机引物作为引物袁合成
糟阅晕粤第 员 链袁存于 原圆园 益备用遥
员郾 猿摇 酝葬悦匀陨基因保守序列的克隆
在 晕悦月陨 数据库中查找已登陆的 悦匀陨 基因袁利
用软件 月蚤燥耘凿蚤贼和 郧藻灶藻贼赠曾鄄增藻则泽蚤燥灶苑 设计引物 悦匀陨鄄员砸
和 悦匀陨鄄员云渊表 员冤袁以 阅晕粤 为模板进行 孕悦砸 扩增遥
反应体系渊圆缘 滋蕴冤为院 员园 伊 孕悦砸 缓冲液渊 垣 酝早悦造圆 冤
圆郾 缘 滋蕴袁 凿晕栽孕泽 渊圆郾 缘 皂皂燥造窑蕴 原员 冤 员 滋蕴袁引物 渊员园
滋皂燥造窑蕴 原员冤各 员 滋蕴袁栽葬择 酶 园郾 圆 滋蕴袁模板 阅晕粤 圆 滋蕴
和无菌双蒸水 员苑郾 猿 滋蕴遥 扩增程序院 怨源 益预变性
源 皂蚤灶曰 怨源 益变性 猿园 泽袁源怨 益退火 源缘 泽袁苑圆 益延伸
怨园 泽袁扩增 猿缘 个循环曰 最后 苑圆 益总延伸 员园 皂蚤灶遥 将
得到的 孕悦砸产物经 员豫琼脂糖凝胶电泳检测后袁切
下目的条带袁用胶回收试剂盒渊上海华舜冤回收袁产
物与 责酝阅员怨鄄栽 泽蚤皂责造藻 增藻糟贼燥则渊栽葬运葬砸葬冤载体相连接袁
转化 阅匀缘琢 感受态细胞袁最后将筛选到的阳性克隆
菌液送往南京金斯瑞公司测序遥
员郾 源摇 抑制 孕悦砸 法扩增 酝葬悦匀陨 基因 缘忆端和 猿忆端
序列
对基因组进行酶切处理袁体系渊缘园 滋蕴冤为院 基因
组圆园 滋蕴袁限制性内切酶渊耘糟燥砸吁袁阅则葬玉袁匀葬藻芋或 杂糟葬造玉冤
圆 滋蕴袁月怎枣枣藻则渊员园 伊 冤 缘 滋蕴和无菌水 圆猿 滋蕴曰 猿苑 益消化
源 澡遥 选择酶切效果较好的产物进行纯化遥
将合成的 圆 条寡核苷酸衔接头引物 粤凿葬责贼燥则 员
和 粤凿葬责贼燥则 圆 分别稀释成 缘园 滋皂燥造窑蕴 原员的浓度袁等体
积混匀袁在 员园园 益下保温 缘 皂蚤灶 后袁冷却至室温备
用遥 将处理好的衔接头与基因组酶切产物进行连
接袁体系渊圆园 滋蕴冤为院 酶切产物 愿 滋蕴袁接头 源 滋蕴袁
源园豫 孕耘郧源园园园 圆 滋蕴袁栽源 阅晕粤 连接酶 圆 滋蕴袁 员园 伊
蕴蚤早葬贼蚤燥灶 月怎枣枣藻则 圆 滋蕴袁水 圆 滋蕴遥 圆圆 益保温 员 耀 猿 澡 后
采用乙醇沉淀纯化回收袁获得 源 个 阅晕粤野库冶遥 以连
接产物为模板袁使用引物对 粤孕员 和 怎责鄄郧杂孕员 进行
缘忆端序列第 员 轮扩增袁粤孕员 和 凿燥憎灶鄄郧杂孕员 进行 猿忆端
序列第 员 轮扩增袁退火温度同为 源怨 益曰 然后以第 员
轮 孕悦砸产物为模板袁使用引物 粤孕圆 和 怎责鄄郧杂孕圆 进行
第 圆 轮 缘忆端序列扩增袁使用引物 粤孕圆 和 凿燥憎灶鄄郧杂孕圆
进行 猿忆端序列第 圆 轮扩增袁退火温度同为 缘圆郾 缘 益遥
最后将片段进行克隆尧测序遥
员郾 缘摇 酝葬悦匀陨 基因全长 阅晕粤 序列和 砸晕粤 序列的
扩增
将保守序列和获得的侧翼序列进行拼接袁通过
晕悦月陨网站上的的 遭造葬泽贼曾 程序预测分析全长编码序
列袁设计全长引物 悦匀陨鄄圆云 和 悦匀陨鄄圆砸渊表 员冤分别扩
增 糟阅晕粤尧阅晕粤全长编码序列袁退火温度为 缘圆 益袁最
后将目的片段克隆尧测序遥
员郾 远摇 酝葬悦匀陨基因生物信息学分析
利用软件 杂藻择怎藻灶糟藻则 源郾 圆尧郧藻灶藻贼赠曾鄄增藻则泽蚤燥灶 苑 等软
件进行引物设计和序列分析袁酝耘郧粤 源郾 员 进行系统发
育分析袁栽葬则早藻贼孕 员郾 员 杂藻则增藻则在线进行亚细胞定位情况
园源
摇 第 圆 期 刘长英等院 桑树查尔酮异构酶基因的克隆与原核表达分析
考察袁孕则燥贼孕葬则葬皂 计算蛋白的分子质量和理论等电点遥
员郾 苑摇 酝葬悦匀陨基因组织表达分析
选取桑树健壮植株的根尧表皮尧韧皮部尧托叶尧叶
柄尧叶片和果实等组织材料袁分别提取其总 砸晕粤袁以
反转录得到 糟阅晕粤 第 员 链为模板袁以 悦匀陨鄄圆云 和
悦匀陨鄄圆砸为引物进行 孕悦砸扩增 悦匀陨基因袁以桑树肌动
蛋白基因 酝葬粤悦栽猿 渊李军等袁 圆园员员冤为内参袁检测
酝葬悦匀陨在各组织中的表达情况遥
员郾 愿摇 酝葬悦匀陨基因原核表达分析
使用被引入酶切位点 耘糟燥砸玉的引物 悦匀陨鄄猿云 和
被引入酶切位点 载澡燥玉的引物 悦匀陨鄄猿砸 扩增 酝葬悦匀陨
基因袁退火温度为 缘愿 益遥 将 孕悦砸 产物经 耘糟燥砸玉和
载澡燥玉酶切消化后插入已被 耘糟燥砸玉和 载澡燥玉酶切消
化后的表达质粒载体 责耘栽鄄圆愿葬渊垣冤袁构建成原核表达
载体 责耘栽鄄圆愿葬渊垣冤鄄酝葬悦匀陨袁将重组质粒转化进入大肠
杆菌渊耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤冤月蕴圆员渊阅耘猿冤感受态细胞袁挑取
阳性克隆子袁并提取质粒进行酶切及测序鉴定遥
酝葬悦匀陨基因的诱导表达参考李镇刚等渊圆园员圆冤
的原核表达方法袁略有改动遥 将阳性大肠杆菌 月蕴圆员
渊阅耘猿冤克隆子接种于 缘 皂蕴 蕴月 液体培养基渊含 缘园
滋早窑皂蕴 原员卡那霉素冤袁猿苑 益培养过夜曰 然后按体积比
员颐 员园园 接种于 员园园 皂蕴 栽月 液体培养基渊含 缘园 滋早窑
皂蕴 原员卡那霉素冤袁猿苑 益培养至 韵阅远园园 灶皂值在 园郾 远 耀
园郾 愿 之间曰 加入 陨孕栽郧 至终浓度为 员 皂皂燥造窑蕴 原员袁在
猿苑 益下培养 远 澡遥 最后对所收集菌体处理后袁进行
杂阅杂鄄孕粤郧耘分析遥
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 酝葬悦匀陨基因全序列的获得
采用引物 悦匀陨鄄员云 和 悦匀陨鄄员砸袁以 阅晕粤 为模板进
行 孕悦砸 扩增袁得到约员 苑圆怨 遭责的条带渊图 员冤遥 经连
接尧转化尧测序得到该片段的核苷酸序列袁通过 晕悦月陨
网站比对袁发现该序列与苹果渊酝葬造怎泽 凿燥皂藻泽贼蚤糟葬冤尧草
莓等植物的 悦匀陨基因序列同源性较高袁推测该序列
为 悦匀陨基因的保守区域袁在此被命名为 酝葬悦匀陨遥
分析得到的 阅晕粤 核心片段序列袁分别设计 缘忆
端尧猿忆端引物和衔接头引物袁以构建的 源 个 阅晕粤
野库冶为模板进行扩增袁经 耘糟燥砸吁袁匀葬藻芋和 杂糟葬造玉处
理的基因组模板都获得了 缘忆端阳性片段袁用 匀葬藻芋
处理的基因组模板得到了 猿忆端的 圆 条阳性片段渊图
圆冤遥 将保守序列和侧翼序列拼接得到了包含 悦匀陨
整个编码区的序列袁阅晕粤 全长圆 员员圆 遭责袁悦阅杂 全长
远远园 遭责袁由 源 个外显子和 猿 个内含子组成渊图 猿冤遥 通
过对桑树 耘杂栽序列的检索对比发现袁有 圆 条 耘杂栽 序
列 渊 郧藻灶月葬灶噪 登 陆 号 分 别 为 耘杂源源愿圆猿园郾 员 和
图 员摇 酝葬悦匀陨基因片段
云蚤早援 员摇 云则葬早皂藻灶贼 燥枣 酝葬悦匀陨
酝院 栽则葬灶泽圆园园园曰 员院 酝葬悦匀陨援
耘杂源源愿缘怨远郾 员冤与 酝葬悦匀陨 基因拼接序列完全重合袁因
此确认该基因的 猿忆哉栽砸 序列袁长为 圆怨园 遭责袁末端包
括 圆怨 个碱基 粤遥 所获得的 酝葬悦匀陨 基因组全长序列
已经在 郧藻灶月葬灶噪注册袁登陆号是 允匝愿圆源园缘园遥
图 圆摇 抑制 孕悦砸扩增 酝葬悦匀陨 缘忆端和 猿忆端电泳
云蚤早援 圆摇 粤皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 缘忆 葬灶凿 猿忆 贼藻则皂蚤灶葬造 遭赠 怎泽蚤灶早 泽怎责责则藻泽泽蚤燥灶 孕悦砸
酝院 栽则葬灶泽圆园园园援 员 原 猿院 缘忆端序列扩增渊分别为 耘糟燥砸吁袁 匀葬藻芋和
杂糟葬造玉冤曰 源院 猿忆端序列扩增渊匀葬藻芋冤遥 员 原 猿院 粤皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶
燥枣 缘忆 贼藻则皂蚤灶葬造 渊耘糟燥砸吁袁匀葬藻芋 葬灶凿 杂糟葬造玉袁则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠冤曰
源院 粤皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 猿忆 贼藻则皂蚤灶葬造 渊匀葬藻芋冤援
图 猿摇 酝葬悦匀陨全长
云蚤早援 猿摇 栽澡藻 枣怎造造鄄造藻灶早贼澡 燥枣 酝葬悦匀陨
酝院 栽则葬灶泽圆园园园曰 员院 全长 糟阅晕粤曰 圆院 全长 阅晕粤遥
酝院 栽则葬灶泽圆园园园曰 员院 栽澡藻 枣怎造造鄄造藻灶早贼澡 燥枣 糟阅晕粤曰 圆院 栽澡藻 枣怎造造鄄造藻灶早贼澡 燥枣 阅晕粤援
员源
林 业 科 学 源怨 卷摇
圆郾 圆摇 酝葬悦匀陨基因编码蛋白质序列分析
酝葬悦匀陨基因的 悦阅杂序列全长 远远园 遭责袁编码 圆员怨
个氨基酸渊图 源冤遥 孕则燥贼孕葬则葬皂 在线预测 酝葬悦匀陨 基因
编码蛋白质的相对分子量略为 圆猿郾 愿 噪怎袁理论等电点
为 缘郾 圆怨遥 栽葬则早藻贼孕 员郾 员 杂藻则增藻则在线考察亚细胞定位情
况袁不含信号肽袁为非分泌蛋白遥 对 酝葬悦匀陨 基因编
码蛋白质的二级结构元件分析袁包括 琢 原螺旋尧无规
卷曲尧延伸链和 茁 原转角袁所占比例分别是 源缘郾 远远豫 袁
圆缘郾 缘苑豫 袁圆圆郾 猿苑豫和 远郾 猿怨豫 遥
图 源摇 酝葬悦匀陨全长 糟阅晕粤序列及推导氨基酸序列
云蚤早援 源摇 栽澡藻 枣怎造造鄄造藻灶早贼澡 燥枣 糟阅晕粤 葬灶凿 糟阅晕粤鄄凿藻则蚤增藻凿 葬皂蚤灶燥 葬糟蚤凿 泽藻择怎藻灶糟藻泽 燥枣 酝葬悦匀陨
方框部分为起始密码子和终止密码子袁下划线为多聚腺苷酸尾遥
陨灶蚤贼蚤葬贼蚤燥灶 糟燥凿燥灶 葬灶凿 贼藻则皂蚤灶葬贼蚤燥灶 糟燥凿燥灶 葬则藻 泽澡燥憎灶 蚤灶 择怎葬凿则葬灶早造藻泽袁 葬灶凿 责燥造赠 粤 蚤泽 澡蚤早澡造蚤早澡贼 憎蚤贼澡 贼澡藻 怎灶凿藻则造蚤灶藻援
圆郾 猿摇 酝葬悦匀陨基因蛋白同源性分析
在 晕悦月陨 数据库中下载了拟南芥 渊 粤则葬遭蚤凿燥责泽蚤泽
贼澡葬造蚤葬灶葬冤尧草莓尧葡萄渊灾蚤贼蚤泽 增蚤灶蚤枣藻则葬冤尧大豆渊郧造赠糟蚤灶藻
皂葬曾冤等 员愿 个物种的 员怨 个 悦匀陨 基因袁利用它们的氨
基酸序列进行同源性分析遥 发现 酝葬悦匀陨 编码的氨
基酸 序 列 与 蔷 薇 目 渊 砸燥泽葬造藻泽 冤 植 物 沙 梨
渊郧哉猿怨园缘源源郾 员 冤尧草莓 渊 粤月圆园员苑缘缘郾 员 冤尧桃 渊 孕则怎灶怎泽
责藻则泽蚤糟葬袁匀酝缘源猿缘远怨郾 员 冤的 悦匀陨 基因同源性分别为
苑怨豫 袁苑愿豫 袁猿缘豫 曰 与茄目渊杂燥造葬灶葬造藻泽冤植物圆叶牵牛
渊 陨责燥皂燥藻葬 责怎则责怎则藻葬袁 粤云园圆愿圆猿愿郾 员 冤尧 烟 草
渊粤月圆员猿远缘员郾 员冤尧矮牵牛渊载员源缘愿怨郾 员冤的同源性分别
为 苑园豫 袁远怨豫 袁远怨豫 曰 与豆科渊蕴藻早怎皂蚤灶燥泽葬藻冤植物百
脉根 渊 粤月园缘源愿园员郾 员 冤尧 蒺 藜 状 苜 蓿 渊 酝藻凿蚤糟葬早燥
贼则怎灶糟葬贼怎造葬袁 载酝 赃 园园猿缘怨圆苑员愿郾 员 冤尧 大 豆 渊 晕酝 赃
园园员圆源愿圆怨园郾 员冤尧菜豆渊载员远源苑园郾 员冤尧甘草渊郧造赠糟赠则则澡蚤扎葬
怎则葬造藻灶泽蚤泽袁耘云园圆远怨愿园郾 员冤尧百脉根渊粤月园缘源愿园圆郾 员冤的同
源性分别为 缘苑豫 袁苑圆豫 袁缘怨豫 袁缘怨豫 袁缘愿豫 袁苑缘豫 曰 与
金虎尾目 渊 酝葬造责蚤早澡蚤葬造藻泽 冤 植物毛果杨 渊 孕燥责怎造怎泽
贼则蚤糟澡燥糟葬则责葬袁 载酝 赃 园园圆猿员缘圆圆圆郾 员 冤尧 蓖 麻 渊 砸蚤糟蚤灶怎泽
糟燥皂皂怎灶蚤泽袁载酝赃园园圆缘圆园愿圆源郾 员冤的同源性分别为 苑苑豫 袁
猿缘豫 曰 与锦葵目渊酝葬造增葬造藻泽冤植物甜橙渊悦蚤贼则怎泽 泽蚤灶藻灶泽蚤泽袁
粤月园员员苑怨源郾 员冤尧虎耳草目 渊 杂葬曾蚤枣则葬早葬造藻泽冤 植物牡丹
渊 孕葬藻燥灶蚤葬 泽怎枣枣则怎贼蚤糟燥泽葬袁 郧匝怨愿源员远员郾 员 冤尧 葡 萄 目
渊灾蚤贼葬造藻泽冤植物葡萄渊载酝赃园园圆圆愿圆园苑圆郾 圆冤尧十字花目
渊月则葬泽泽蚤糟葬造藻泽冤植物拟南芥 渊酝愿远猿缘愿郾 员冤尧天门冬目
渊粤泽责葬则葬早葬造藻泽冤植物洋葱渊粤造造蚤怎皂 糟藻责葬袁粤再缘源员园猿源郾 员冤
的同源性分别为 苑缘豫 袁苑缘豫 袁苑猿豫 袁远愿豫 袁远源豫 遥 结
果显示大部分植物与 酝葬悦匀陨 基因编码氨基酸序列
圆源
摇 第 圆 期 刘长英等院 桑树查尔酮异构酶基因的克隆与原核表达分析
的同源性在 缘苑豫 耀 愿园豫 遥 与蓖麻和桃的同源性仅
有 猿缘豫 袁后者与桑树同目袁但 酝葬悦匀陨 基因的亲缘性
却很远袁有待进一步的研究遥
圆郾 源摇 酝葬悦匀陨基因进化分析
分析 酝葬悦匀陨 与拟南芥尧草莓尧葡萄等植物的
悦匀陨基因编码氨基酸序列袁进行进化距离分析袁发现
酝葬悦匀陨与草莓尧沙梨尧杨树和牡丹等物种进化距离
较近袁而与大豆尧桃和蓖麻等物种进化距离较远遥 以
酝葬悦匀陨与其他物种的 悦匀陨 基因编码氨基酸序列比
对为基础袁构建 晕允进化树袁以分析它们的进化关系
渊图 缘冤遥 参照遗传进化距离和进化树的构型袁将整
个进化树划为 猿 个亚群院 玉袁域和芋遥 其中玉类包
含了沙梨尧草莓尧牡丹尧葡萄尧桑树尧毛果杨等植物曰
域类包括百脉根尧菜豆尧大豆和甘草等豆科植物曰 芋
类包括桃子和蓖麻遥 酝葬悦匀陨 与草莓尧杨树和葡萄关
系较近袁其次是豆科植物袁与桃尧蓖麻关系最远遥
图 缘摇 酝葬悦匀陨与其他植物 悦匀陨的 晕藻蚤早澡遭燥则鄄允燥蚤灶蚤灶早系统进化树
云蚤早援 缘摇 栽澡藻 晕藻蚤早澡遭燥则鄄允燥蚤灶蚤灶早 贼则藻藻 燥枣 酝葬悦匀陨 葬灶凿 悦匀陨 燥枣 燥贼澡藻则 责造葬灶贼泽
圆郾 缘摇 酝葬悦匀陨基因组织表达分析
对桑树根尧茎表皮尧韧皮部尧托叶尧叶柄尧叶片和
果实等组织的 砸栽鄄孕悦砸 分析渊图 远冤发现袁酝葬悦匀陨 基
因在各个组织中都有表达袁但具有一定的差异遥
酝葬悦匀陨在根中表达很微弱袁几乎无法检测曰 酝葬悦匀陨
在叶和果实中的表达量要高于韧皮部尧托叶尧茎表皮
和叶柄等组织曰 叶片越幼嫩袁酝葬悦匀陨 的表达量有增
强的趋势遥
图 远摇 酝葬悦匀陨组织表达分析
云蚤早援 远摇 栽澡藻 贼蚤泽泽怎藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 酝粤悦匀陨
员院 根 砸燥燥贼曰 圆院 韧皮部 孕澡造燥藻皂曰 猿院 茎表皮 杂贼藻皂 藻责蚤凿藻则皂蚤泽曰 源院 叶柄 孕藻贼蚤燥造藻曰 缘院 托叶 杂贼蚤责怎造藻曰
远院 叶 圆园 蕴藻葬枣 圆园曰 苑院 叶 员远 蕴藻葬枣 员远曰 愿院 叶 源 蕴藻葬枣 源曰 怨院 叶 圆 蕴藻葬枣 圆曰 员园院 果实 云则怎蚤贼援
圆郾 远摇 酝葬悦匀陨基因原核表达分析
将 酝葬悦匀陨的 皂砸晕粤全长 悦阅杂 序列克隆到原核
表达载体 责耘栽鄄圆愿葬渊垣冤的酶切位点 耘糟燥砸玉和 载澡燥玉
之间袁构建出 责耘栽鄄圆愿葬渊垣冤鄄酝葬悦匀陨 重组质粒袁将重组
质粒进行酶切分析渊图 苑冤袁结果表明表达载体构建
成功遥 对重组质粒进行测序分析袁编码区序列没有
出现突变遥
将重组质粒转入大肠杆菌 月蕴圆员渊阅耘猿冤袁在加有
员 皂皂燥造窑蕴 原员 陨孕栽郧的 栽月 液体培养基中诱导表达 远 澡
后袁收集菌液遥 分别对菌体和菌液处理后进行 杂阅杂鄄
孕粤郧耘分析袁发现对菌体做的 杂阅杂鄄孕粤郧耘 分析中得
到接近 圆怨 噪怎 的目的条带袁与预测结果相符合渊图
猿源
林 业 科 学 源怨 卷摇
图 苑摇 重组质粒的双酶切鉴定
云蚤早援 苑摇 灾藻则蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 责造葬泽皂蚤凿 遭赠 凿怎葬造 凿蚤早藻泽贼蚤燥灶
酝院 栽则葬灶泽圆园园园援 员院未酶切空载 责耘栽鄄圆愿葬渊垣冤质粒曰 圆院双酶切重组质粒遥
员院 孕造葬泽皂蚤凿 燥枣 责耘栽鄄圆愿葬渊垣冤 憎蚤贼澡燥怎贼 凿蚤早藻泽贼蚤燥灶曰
圆院 砸藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 责造葬泽皂蚤凿 遭赠 凿怎葬造 凿蚤早藻泽贼蚤燥灶援
愿冤袁表明 酝葬悦匀陨在原核细胞中得以表达遥 而对菌液
做 杂阅杂鄄孕粤郧耘分析结果显示很弱的带袁表明 酝葬悦匀陨
蛋白在大肠杆菌主要以包涵体的形式存在袁在菌液
中表达量较低袁因此要获得高量的 酝葬悦匀陨 基因表达
产物还需要进一步优化原核表达条件遥
图 愿摇 重组 酝葬悦匀陨蛋白的 杂阅杂鄄孕粤郧耘分析
云蚤早援 愿摇 杂阅杂鄄孕粤郧耘 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 酝葬悦匀陨 责则燥贼藻蚤灶
员袁圆院 重组质粒菌表达产物曰 猿袁 源院 空质粒菌表达产物曰
酝院 光谱彩虹预染蛋白 皂葬则噪藻则遥 员袁圆院 耘曾责则藻泽泽蚤燥灶 责则燥凿怎糟贼泽 枣则燥皂
遭葬糟贼藻则蚤葬 憎蚤贼澡 藻皂责贼赠 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 责造葬泽皂蚤凿曰 猿袁源院 耘曾责则藻泽泽蚤燥灶 责则燥凿怎糟贼泽
枣则燥皂 遭葬糟贼藻则蚤葬 憎蚤贼澡 藻皂责贼赠 责造葬泽皂蚤凿曰 酝院 酝怎造贼蚤糟燥造燥则 责则燥贼藻蚤灶 皂葬则噪藻则援
猿摇 结论与讨论
本试验采用同源克隆法和抑制 孕悦砸 法克隆出
了桑树 悦匀陨基因全序列遥 对 酝葬悦匀陨 基因在各组织
中的 砸栽鄄孕悦砸 分析结果显示袁该基因在各个组织中
都有一定的表达袁但存在组织特异性遥 而 酝葬悦匀陨 在
根中的表达量较低袁可能是由于根相对于桑树的叶尧
果实等其他组织器官袁其类黄酮化合物的合成效应
较低袁也有可能在根中还存在一个特异表达的 悦匀陨
基因遥 在矮牵牛 渊 增葬灶 栽怎灶藻灶 藻贼 葬造援袁 员怨愿愿 冤尧甘草
渊运蚤皂怎则葬 藻贼 葬造援袁 圆园园员冤等植物中已经发现多个具有组
织特异性的 悦匀陨 基因袁桑树中也可能存在多个 悦匀陨
基因袁还有待进一步验证遥 叶片和果实中富含类黄
酮化合物袁是桑树中类黄酮化合物存在的主要器官袁
因此 酝葬悦匀陨在叶和果实中表达量较高遥 随着桑叶
叶位的升高袁类黄酮化合物含量越高渊杨普香等袁
圆园园员冤袁悦匀陨基因表达逐渐增强袁说明叶片越幼嫩袁类
黄酮物质的合成愈加活跃遥 类黄酮化合物具有较强
的抗氧化活性袁对植物机体可能具有一定的保护作
用袁在幼叶中大量合成类黄酮化合物并高表达
酝葬悦匀陨袁具有一定的生理意义遥
分析 悦匀陨基因核苷酸序列袁构建了 晕允 进化树袁
进化树被划为 猿 个亚群袁葡萄尧草莓等植物聚在一
类袁豆科植物聚在一类袁桃和蓖麻聚在一类遥 张越等
渊圆园员员冤将来源于不同植物的 员愿 种 悦匀陨 编码氨基酸
序列进行进化树分析袁划为 圆 个亚群袁正如图 缘 中的
玉和域类所示遥 杂澡蚤皂葬凿葬等渊圆园园猿冤根据 悦匀陨的作用
底物的不同袁将植物中 悦匀陨分为 圆 种类型袁圆 种类型
都能催化 远 原羟基查尔酮转化为渊圆杂冤 原黄烷酮或
渊圆杂冤原 缘 原脱氧黄烷酮袁其中 栽赠责藻 域型还能将远 原脱
氧查尔酮异构化为渊圆杂冤 原黄烷酮或渊圆杂冤 原 缘 原脱氧
黄烷酮袁且主要存在于豆科植物中遥 蛋白质同源性
分析 酝葬悦匀陨编码的氨基酸序列与 栽赠责藻 玉类氨基酸
序列同源性较高袁与 栽赠责藻 域类同源性低袁酝葬悦匀陨 在
晕允进化树中也位于玉类袁因此初步将桑树查尔酮异
构酶归为 栽赠责藻 玉型遥
国内外学者曾研究过有关大豆尧矮牵牛尧紫苜蓿
渊酝藻凿蚤糟葬早燥 泽葬贼蚤增葬冤等植物的 悦匀陨 基因在大肠杆菌的
表达渊酝藻澡凿赠 藻贼 葬造援袁 员怨愿苑曰 颜华等袁 员怨怨苑曰 允藻扎 藻贼 葬造援袁
圆园园园冤袁并获得具有活性的重组蛋白袁对 悦匀陨 蛋白的
功能进行了深入的分析袁揭示了 悦匀陨 在类黄酮生物
合成中的重要作用遥 本研究将 酝葬悦匀陨 基因构建到
责耘栽鄄圆愿葬渊垣冤载体上袁构建出 责耘栽鄄圆愿葬渊垣冤鄄酝葬悦匀陨袁并
成功在大肠杆菌中得以表达袁表明 酝葬悦匀陨 能在原核
细胞中表达袁为进一步优化该基因原核表达奠定了
基础袁为获得重组蛋白并深入研究该基因的功能提
供了依据遥
类黄酮生物合成途径是目前植物中研究较为精
细的次生代谢途径之一袁其代谢途径也被认为是研
究遗传学尧生物化学尧细胞生物学和生物技术等领域
的良好研究模式渊宰蚤灶噪藻造鄄杂澡蚤则造藻赠袁 圆园园员冤遥 目前针对
黄酮进行的生物工程应用尤为活跃袁在花色修饰尧药
用植物成分改变和作物营养物质改良等方面都有大
量研究遥 悦匀陨基因是类黄酮合成的限速酶之一袁是
源源
摇 第 圆 期 刘长英等院 桑树查尔酮异构酶基因的克隆与原核表达分析
各类黄酮合成重要节点袁具有基因工程改良价值遥
番茄果实中含有大量的番茄红素袁同时还含有少量
的类黄酮化合物袁酝怎蚤则等渊圆园园员冤将矮牵牛 悦匀陨鄄粤 基
因转入番茄中导致果皮中黄酮物质增加了 苑愿 倍袁间
接地 提 高 了 番 茄 的 营 养 价 值遥 杂噪佼则噪燥憎泽噪葬鄄
栽藻造蚤糟澡燥憎泽噪葬等渊圆园员园冤将 悦匀陨 与 悦匀杂袁阅云砸 猿 个基因
同时在亚麻渊蕴蚤灶怎皂 怎泽蚤贼葬贼蚤泽泽蚤皂怎皂冤中过量表达袁导致
亚麻纤维尧亚麻油和亚麻籽中分别富集酚类化合物尧
多不饱和脂肪酸类和木酚素袁改变了大麻材料的组
成成分袁同时以转基因亚麻制作的绷带还具有促进
伤口愈合的作用遥 可见对 悦匀陨 基因的修饰对于改
良作物品质具有一定的作用遥
本研究对 酝葬悦匀陨 的初步研究将为深入研究该
基因的功能和基因工程应用奠定工作基础袁同时也
将推动桑树类黄酮生物合成途径的研究遥
参 考 文 献
李摇 军袁 赵爱春袁 王茜龄袁 等援 圆园员员援 三个桑树肌动蛋白基因的克隆
与组织表达分析援 作物学报袁 猿苑渊源冤院 远源员 原 远源怨援
李镇刚袁 赵爱春袁 王茜龄袁 等援 圆园员圆援 芽孢杆菌中性植酸酶基因的原
核表达及酶学性质分析援 蚕业科学袁 猿愿渊员冤院 员员圆 原 员员怨援
颜摇 华袁 宋摇 云袁 李翎云袁 等援 员怨怨苑援 查尔酮异构酶基因的克隆序列
分析及在大肠杆菌中的表达援 植物学报袁 猿怨渊员员冤院 员园猿园 原 员园猿源援
杨普香袁 黎小萍援 圆园园员援 夏秋桑叶黄酮化合物含量变化初探援 蚕桑
通报袁 猿圆渊猿冤院 圆猿 原 圆源援
张摇 越袁 刘学英袁 王效忠袁 等援 圆园员员援 植物查尔酮异构酶基因渊悦匀陨冤
研究进展援 基因组学与应用生物学袁 猿园院 员园源猿 原 员园缘园援
月蚤藻扎葬 运袁 蕴燥蚤泽 砸援 圆园园员援 粤灶 粤则葬遭蚤凿燥责泽蚤泽 皂怎贼葬灶贼 贼燥造藻则葬灶贼 贼燥 造藻贼澡葬造
怎造贼则葬增蚤燥造藻贼鄄月 造藻增藻造泽 泽澡燥憎泽 糟燥灶泽贼蚤贼怎贼蚤增藻造赠 藻造藻增葬贼藻凿 葬糟糟怎皂怎造葬贼蚤燥灶 燥枣
枣造葬增燥灶燥蚤凿泽 葬灶凿 燥贼澡藻则 责澡藻灶燥造蚤糟泽援 孕造葬灶贼 孕澡赠泽蚤燥造燥早赠袁 员圆远
渊猿冤院 员员园缘 原 员员员缘援
月燥早泽 允袁 耘遭葬凿蚤 粤袁 酝糟阅葬增蚤凿 阅袁藻贼 葬造援 圆园园远援 陨凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 枣造葬增燥灶燥蚤凿
澡赠凿则燥曾赠造葬泽藻泽 枣则燥皂 早则葬责藻增蚤灶藻 葬灶凿 贼澡藻蚤则 则藻早怎造葬贼蚤燥灶 凿怎则蚤灶早 枣则怎蚤贼
凿藻增藻造燥责皂藻灶贼援 孕造葬灶贼 孕澡赠泽蚤燥造燥早赠袁员源园渊员冤院 圆苑怨 原 圆怨员援
云燥则噪皂葬灶灶 郧袁 酝葬则贼藻灶泽 杂援 圆园园员援 酝藻贼葬遭燥造蚤糟 藻灶早蚤灶藻藻则蚤灶早 葬灶凿 葬责责造蚤糟葬贼蚤燥灶泽
燥枣 枣造葬增燥灶燥蚤凿泽援 悦怎则则藻灶贼 韵责蚤灶蚤燥灶 蚤灶 月蚤燥贼藻糟澡灶燥造燥早赠袁 员圆
渊圆冤院 员缘缘 原 员远园援
匀葬则遭燥则灶藻 允 月袁 宰蚤造造蚤葬皂泽 悦 粤援 圆园园园援 粤凿增葬灶糟藻泽 蚤灶 枣造葬增燥灶燥蚤凿 则藻泽藻葬则糟澡
泽蚤灶糟藻 员怨怨圆援 孕澡赠贼燥糟澡藻皂蚤泽贼则赠袁 缘缘渊远冤院 源愿员 原 缘园源援
匀蚤糟澡则蚤 陨袁 月葬则则蚤藻怎 云袁 月燥早泽 允袁 藻贼 葬造援 圆园员员援 砸藻糟藻灶贼 葬凿增葬灶糟藻泽 蚤灶 贼澡藻
贼则葬灶泽糟则蚤责贼蚤燥灶葬造 则藻早怎造葬贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 枣造葬增燥灶燥蚤凿 遭蚤燥泽赠灶贼澡藻贼蚤糟 责葬贼澡憎葬赠援
允燥怎则灶葬造 燥枣 耘曾责藻则蚤皂藻灶贼葬造 月燥贼葬灶赠袁 远圆渊愿冤院 员 原 员怨援
允藻扎 允 酝袁 月燥憎皂葬灶 酝 耘袁 阅蚤曾燥灶 砸 粤袁 藻贼 葬造援 圆园园园援 杂贼则怎糟贼怎则藻 葬灶凿
皂藻糟澡葬灶蚤泽皂 燥枣 贼澡藻 藻增燥造怎贼蚤燥灶葬则蚤造赠 怎灶蚤择怎藻 责造葬灶贼 藻灶扎赠皂藻 糟澡葬造糟燥灶藻
蚤泽燥皂藻则葬泽藻援 晕葬贼怎则藻 杂贼则怎糟贼怎则葬造 月蚤燥造燥早赠袁 苑渊怨冤院 苑远愿 原 苑怨员援
运蚤凿凿 孕 杂袁 蕴造怎早葬灶赠 酝袁 孕燥泽糟澡藻灶则蚤藻凿藻则 悦袁 藻贼 葬造援 圆园园员援 栽澡藻 则燥造藻 燥枣 则燥燥贼
藻曾怎凿葬贼藻泽 蚤灶 葬造怎皂蚤灶怎皂 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 葬灶凿 泽蚤造蚤糟燥灶鄄蚤灶凿怎糟藻凿 葬皂藻造蚤燥则葬贼蚤燥灶 燥枣
葬造怎皂蚤灶怎皂 燥枣 枣造葬增燥灶燥蚤凿泽 葬灶凿 燥贼澡藻则 责澡藻灶燥造蚤糟泽援 允燥怎则灶葬造 燥枣 耘曾责藻则蚤皂藻灶贼葬造
月燥贼葬灶赠袁 缘圆院 员猿猿怨 原 员猿缘圆援
运蚤皂怎则葬 再袁 粤燥噪蚤 栽袁 粤赠葬遭藻 杂援 圆园园员援 悦澡葬造糟燥灶藻 蚤泽燥皂藻则葬泽藻 蚤泽燥扎赠皂藻泽 憎蚤贼澡
凿蚤枣枣藻则藻灶贼 泽怎遭泽贼则葬贼藻 泽责藻糟蚤枣蚤糟蚤贼蚤藻泽 贼燥憎葬则凿泽 远忆鄄澡赠凿则燥曾赠鄄 葬灶凿 远忆鄄
凿藻燥曾赠糟澡葬造糟燥灶藻泽 蚤灶 糟怎造贼怎则藻凿 糟藻造造泽 燥枣 郧造赠糟赠则则澡蚤扎葬 藻糟澡蚤灶葬贼葬袁 葬
造藻早怎皂蚤灶燥怎泽 责造葬灶贼 责则燥凿怎糟蚤灶早 缘鄄凿藻燥曾赠枣造葬增燥灶燥蚤凿泽援 孕造葬灶贼 悦藻造造
孕澡赠泽蚤燥造燥早赠袁 源圆渊员园冤院 员员远怨 原 员员苑猿援
运燥糟葬 哉袁 月藻则澡燥憎 酝 粤袁 云藻遭则藻泽 灾 允袁 藻贼 葬造援 圆园园怨援 阅藻糟则藻葬泽蚤灶早 怎灶责葬造葬贼葬遭造藻
枣造葬增燥灶燥蚤凿 糟燥皂责燥灶藻灶贼泽 蚤灶 糟蚤贼则怎泽院 贼澡藻 藻枣枣藻糟贼 燥枣 贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶
糟燥灶泽贼则怎糟贼援 孕澡赠泽蚤燥造燥早蚤葬 孕造葬灶贼葬则怎皂袁 员猿苑渊圆冤院 员园员 原 员员源援
运燥藻泽 砸袁 灾藻则憎藻蚤躁 宰袁 匝怎葬贼贼则燥糟糟澡蚤燥 云袁 藻贼 葬造援 圆园园缘援 云造葬增燥灶燥蚤凿泽院 葬 糟燥造燥则枣怎造
皂燥凿藻造 枣燥则 贼澡藻 则藻早怎造葬贼蚤燥灶 葬灶凿 藻增燥造怎贼蚤燥灶 燥枣 遭蚤燥糟澡藻皂蚤糟葬造 责葬贼澡憎葬赠泽援
栽则藻灶凿泽 蚤灶 孕造葬灶贼 杂糟蚤藻灶糟藻袁 员园渊缘冤院 圆猿远 原 圆源圆援
蕴怎噪葬泽扎藻憎蚤糟扎 酝袁 酝葬贼赠泽蚤葬噪鄄运葬贼葬 陨袁 杂噪葬造葬 允袁 藻贼 葬造援 圆园园源援 粤灶贼蚤燥曾蚤凿葬灶贼
糟葬责葬糟蚤贼赠 皂葬灶蚤责怎造葬贼蚤燥灶 蚤灶 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责燥贼葬贼燥 贼怎遭藻则 遭赠 糟澡葬灶早藻泽 蚤灶
责澡藻灶燥造蚤糟 糟燥皂责燥怎灶凿泽 糟燥灶贼藻灶贼援 允燥怎则灶葬造 燥枣 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 葬灶凿 云燥燥凿
悦澡藻皂蚤泽贼则赠袁 缘圆渊远冤院 员缘圆远 原 员缘猿猿援
酝藻澡凿赠 酝 悦袁 蕴葬皂遭 悦 允援 员怨愿苑援 悦澡葬造糟燥灶藻 蚤泽燥皂藻则葬泽藻 糟阅晕粤 糟造燥灶蚤灶早 葬灶凿
皂砸晕粤 蚤灶凿怎糟贼蚤燥灶 遭赠 枣怎灶早葬造 藻造蚤糟蚤贼燥则袁 憎燥怎灶凿蚤灶早 葬灶凿 蚤灶枣藻糟贼蚤燥灶援 栽澡藻
耘酝月韵 允燥怎则灶葬造袁 远渊远冤院 员缘圆苑 原 员缘猿猿援
酝怎蚤则 杂 砸袁 悦燥造造蚤灶泽 郧 允袁 砸燥遭蚤灶泽燥灶 杂袁 藻贼 葬造援 圆园园员援 韵增藻则藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣
责藻贼怎灶蚤葬 糟澡葬造糟燥灶藻 蚤泽燥皂藻则葬泽藻 蚤灶 贼燥皂葬贼燥 则藻泽怎造贼泽 蚤灶 枣则怎蚤贼 糟燥灶贼葬蚤灶蚤灶早
蚤灶糟则藻葬泽藻凿 造藻增藻造泽 燥枣 枣造葬增燥灶燥造泽援 晕葬贼怎则藻 月蚤燥贼藻糟澡灶燥造燥早赠袁 员怨院 源苑员 原 源苑源援
晕蚤泽澡蚤澡葬则葬 酝袁 晕葬运葬贼泽怎噪葬 栽袁 再葬皂葬皂怎则葬 杂援 圆园园缘援 云造葬增燥灶燥蚤凿 糟燥皂责燥灶藻灶贼
葬灶凿 枣造燥憎藻则 糟燥造燥则 糟澡葬灶早藻 蚤灶 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 贼燥遭葬糟糟燥 责造葬灶贼泽 遭赠 泽怎责责则藻泽泽蚤燥灶
燥枣 糟澡葬造糟燥灶藻 蚤泽燥皂藻则葬泽藻 早藻灶藻援 云耘月杂 蕴藻贼贼藻则泽袁 缘苑怨院 远园苑源 原 远园苑愿援
孕葬灶 郧袁 蕴燥怎 悦援 圆园园愿援 陨泽燥造葬贼蚤燥灶 燥枣 葬灶 员鄄葬皂蚤灶燥糟赠糟造燥责则燥责葬灶藻鄄员鄄糟葬则遭燥曾赠造葬贼藻
燥曾蚤凿葬泽藻 早藻灶藻 枣则燥皂 皂怎造遭藻则则赠 渊酝燥则怎泽 葬造遭葬 蕴援 冤 葬灶凿 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 贼澡藻
枣怎灶糟贼蚤燥灶 燥枣 贼澡蚤泽 早藻灶藻 蚤灶 责造葬灶贼 凿藻增藻造燥责皂藻灶贼 葬灶凿 泽贼则藻泽泽藻泽 则藻泽责燥灶泽藻援
允燥怎则灶葬造 燥枣 孕造葬灶贼 孕澡赠泽蚤燥造燥早赠袁 员远缘院 员圆园源 原 员圆员猿援
杂澡蚤皂葬凿葬 晕袁 粤燥噪蚤 栽袁 杂葬贼燥 杂袁藻贼 葬造援 圆园园猿援 粤 糟造怎泽贼藻则 燥枣 早藻灶藻泽 藻灶糟燥凿藻泽 贼澡藻
贼憎燥 贼赠责藻泽 燥枣 糟澡葬造糟燥灶藻 蚤泽燥皂藻则葬泽藻 蚤灶增燥造增藻凿 蚤灶 贼澡藻 遭蚤燥泽赠灶贼澡藻泽蚤泽 燥枣
早藻灶藻则葬造 枣造葬增燥灶燥蚤凿泽 葬灶凿 造藻早怎皂藻鄄泽责藻糟蚤枣蚤糟 缘鄄凿藻燥曾赠 渊 蚤泽燥冤 枣造葬增燥灶燥蚤凿泽 蚤灶
蕴燥贼怎泽 躁葬责燥灶蚤糟葬援 孕造葬灶贼 孕澡赠泽蚤燥造燥早赠袁 员猿员渊猿冤院 怨源员 原 怨缘员援
杂噪佼则噪燥憎泽噪葬鄄栽藻造蚤糟澡燥憎泽噪葬 运袁 在窑怎噪 酝袁 运怎皂造葬 粤袁 藻贼 葬造援 圆园员园援 晕藻憎
凿则藻泽泽蚤灶早 皂葬贼藻则蚤葬造泽 凿藻则蚤增藻凿 枣则燥皂 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 枣造葬曾 责则燥凿怎糟贼泽 贼燥 贼则藻葬贼 造燥灶早鄄
泽贼葬灶凿蚤灶早 增藻灶燥怎泽 怎造糟藻则泽鄄葬 责蚤造燥贼 泽贼怎凿赠援 宰燥怎灶凿 砸藻责葬蚤则 葬灶凿
砸藻早藻灶藻则葬贼蚤燥灶袁 员愿渊圆冤院 员远愿 原 员苑怨援
增葬灶 栽怎灶藻灶 粤 允袁 运燥藻泽 砸 耘袁 杂责藻造贼 悦 耘袁 藻贼 葬造援 员怨愿愿援 悦造燥灶蚤灶早 燥枣 贼澡藻 贼憎燥
糟澡葬造糟燥灶藻 枣造葬增葬灶燥灶藻 蚤泽燥皂藻则葬泽藻 早藻灶藻泽 枣则燥皂 孕藻贼怎灶蚤葬 澡赠遭则蚤凿葬院
糟燥燥则凿蚤澡葬贼藻袁 造蚤早澡贼鄄则藻早怎造葬贼藻凿 葬灶凿 凿蚤枣枣藻则藻灶贼蚤葬造 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 枣造葬增燥灶燥蚤凿
早藻灶藻泽援 栽澡藻 耘酝月韵 允燥怎则灶葬造袁 苑渊缘冤院 员圆缘苑 原 员圆远猿援
宰蚤灶噪藻造鄄杂澡蚤则造藻赠 月援 圆园园员援 云造葬增燥灶燥蚤凿 月蚤燥泽赠灶贼澡藻泽蚤泽院 葬 糟燥造燥则枣怎造 皂燥凿藻造 枣燥则
早藻灶藻贼蚤糟泽袁 遭蚤燥糟澡藻皂蚤泽贼则赠袁 糟藻造造 遭蚤燥造燥早赠 葬灶凿 遭蚤燥贼藻糟澡灶燥造燥早赠援 孕造葬灶贼
孕澡赠泽蚤燥造燥早赠袁 员圆远渊圆冤院 源愿缘 原 源怨猿援
宰蚤灶噪藻造鄄杂澡蚤则造藻赠 月援 圆园园圆援 月蚤燥泽赠灶贼澡藻泽蚤泽 燥枣 枣造葬增燥灶燥蚤凿泽 葬灶凿 藻枣枣藻糟贼泽 燥枣 泽贼则藻泽泽援
悦怎则则藻灶贼 韵责蚤灶蚤燥灶 蚤灶 孕造葬灶贼 月蚤燥造燥早赠袁 缘渊猿冤院 圆员愿 原 圆圆猿援
渊责任编辑摇 徐摇 红冤
缘源