全 文 ：第 !" 卷 第 # 期
$ % & % 年 # 月
林 业 科 学
’()*+,)- ’)./-* ’)+)(-*
/012 !"，+02 #
3456，$ % & %
美国白蛾 ’’7反应体系的优化与初步应用!
杜 8 娟& 8 南宫自艳$ 8 周国娜& 8 高宝嘉&
（&6河北农业大学林学院 8 保定 %9&%%%；$6河北农业大学植物保护学院 8 保定 %9&%%%）
关键词：8 美国白蛾；’’7；反应体系
中图分类号：’9&:2 98 8 8 文献标识码：-8 8 8 文章编号：&%%& ; 9!::（$%&%）%# ; %&9# ; %<
收稿日期：$%%: ; %= ; %=。
基金项目：国家自然科学基金（#%99&9#=）。
!高宝嘉为通讯作者。
!"#$%$&’#$() ’)* +,-.$%$)’,/ 0"".$1’#$() (2 334 0)’./5$5 3/5#-% $)
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>? @?4A& 8 +4AB0AB CDE4A$ 8 CF0? G?0A4& 8 G40 H40ID4&
（&2 !"##$%$ "& ’"($)*(+，,%(-./#*/(0# 12-3$()-*+ "& 4$5$-8 60"7-2% %9&%%%；
$2 !"##$%$ "& 8#02* 8("*$.*-"2，,%(-./#*/(0# 12-3$()-*+ "& 4$5$-8 60"7-2% %9&%%%）
065#,’1#：8 -A 0JKDLDM4KD0A ’’7 5N4OKD0A PEPKNL Q4P NPK4R1DPFNS K0 DATNPKDB4KN KFN BNANKDO SDTN5PDKE 0U 4+9:02*(-0 ./2$0
（>5?5E）6 - J0J?14KD0A 0U 4+9:02*(-0 ./2$0 DA (4ABMF0? Q4P ?PNS K0 0JKDLDMN V(7 O0ASDKD0AP DA KFN ’’7 PEPKNL6 ,FN
5NP?1KP PF0QNS KF4K KFN RNPK O0ASDKD0A Q4P %2 !% LL01·. ; & S+,V，$2 < LL01·. ; & 3B$ W，%2 #$ !L01·. ; & J5DLN5P，&X ,4Y
J01ELN54PN，#% Z "% AB KNLJ14KN >+- DA $< !. ’’7 5N4OKD0A PEPKNL 4AS KFN 0JKDL41 4AAN41DAB KNLJN54K?5N 0U J5DLN5P Q4P
<$ [ 6 GNANKDO SDTN5PDKE 0U UDTN 4+9:02*(-0 ./2$0 J0J?14KD0AP Q4P PK?SDNS QDKF KFDP ’’7 5N4OKD0A PEPKNL，4AS KFN 5NP?1K
PF0QNS KFN LDO50P4KN11DKN J5DLN5P QN5N FDBF J01EL05JFDO 4AS KFDP PEPKNL Q4P P?DK4R1N 4AS PK4R1N6
7-/ 8(,*5：8 4+9:02*(-0 ./2$0；’’7；4A41EPDP PEPKNL
8 8 我国于 &=9= 年首次在辽宁省丹东市发现美国
白蛾（4+9:02*(-0 ./2$0）后，害虫扩散蔓延到山东、
陕西、河北、天津和上海。美国白蛾繁殖量大，寄主
植物种类繁多，扩散速度快，暴发时常食尽叶片。近
年来美国白蛾传入了北京，对首都园林绿化及生态
环境安全造成了严重影响（杨忠岐等，$%%9）。\M4]D
等（$%%&）通过比较日本不同地区与原产地佛罗里
达州美国白蛾种群的 >+- 序列后发现，美国白蛾在
日本化性的变异是由于适应日本不同地区气候的进
化反应，而非来自美国不同气候地区的种群。美国
白蛾入侵中国近 #% 年来，我国学者对它的适应性、
性信息素、对寄主的选择、天敌、预测预报和防治方
法等进行了广泛研究（季荣等，$%%#；魏建荣，
$%%#），但对它的入侵机制及不同入侵地区的种群
遗传变异等相关的研究还未见报道。随着分子生物
学技术的兴起及日臻成熟，各种分子遗传标记技术
不但能揭示相似姊妹种之间的差异，还有助于揭示
物种 的 起 源 和 进 化 规 律（ V4K5DOD4 $* 0#;，&==:；
70SN5DO]，&=="；CF4AB，$%%!）。
作为遗传标记方法之一的 ’’7 技术，其原理是
每个物种的重复单位的碱基组成及拷贝数存在很大
差异，具有检测敏感、共显性、多态性好等优点
（^5?B1E4] $* 0#;，&==:；/41SNP $* 0#;，&==#）。近年
来，’’7 技术在鳞翅目昆虫中的应用研究已有不少
报道（吉亚杰等，$%%!；张云武等，$%%&），而美国白
蛾的相关研究报道较少。由于 ’’7 技术也是基于
V(7 的一种标记，其反应条件易受各种因素的干
扰，如模板 >+-、,4Y>+- 聚合酶、S+,V 以及 3B$ W
的浓度等因子的条件不适合，则导致图谱弥散状背
景的产生、扩增产物的消失等，这些现象都影响 ’’7
的扩增结果，从而影响整个试验结果。为此本文以
美国白蛾沧州种群为试材，对各因子的最佳反应条
件进行研究，以期建立一套适合美国白蛾的 ’’7 反
应体系。
9: 材料与方法
&2 &8 材料 8 $%%: 年 < 月自沧州地区随机采集美国
白蛾虫蛹，室内羽化后在 ; $% [下保存。
&2 $8 方法 8 &）>+- 的提取 8 根据经典的 ’>’_>+-
提取法，对部分操作过程进行了优化（姜静，$%%#）。
主要改进之处：剪去枪头的尖端，蛋白酶 ^ 终质量
林 业 科 学 !" 卷 #
浓度 !$$ !%·&’ ( )，*+,-. 终质量浓度 )$$ !%·
&’ ( )，$/ 01的琼脂糖凝胶检测。
2）33*456* 反应体系 # 在 27 !’ 33*456* 反应
体系中，加入 $/ !$ &&89·’ ( ) :+;5，2/ 7 &&89·’ ( )
<%6=2，2/ $ > ;,? 聚合酶，$/ 72 !&89·’
( )引物，@$ A
"$ B% 模板 C+D，用重蒸水调整体系终体积为 27 !’。
用 :+;5、<%2 E、;,?C+D 聚合酶、引物、模板 C+D 当
中任 ) 种成分进行浓度梯度试验时，其他成分浓度不
变。引物序列参照文献（ FG !" #$%，2$$7），由上海生物
技术工程有限公司合成。:+;5 和 ;,?C+D 聚合酶均
购自海泰克生物技术有限公司（表 )）。
@）33*4 56* 扩增程序 # 0 对 33* 引物（表 )）
的退火温度梯度设置分别为 7$，7$/ 7，7)，7)/ 7，72
H；反应程序为 I! H预变性 ! &GB，I! H变性 2$ -，
退火 @$ -，J2 H延伸 )7 - @7 个循环，最后在 J2 H延
伸 2 &GB。56* 仪为 DK=42J2$ 型。
!）56* 产物的检测 # 配制 01非变性聚丙烯酰
胺凝胶，取扩增产物 ! !’ 加 ) !’ " 倍上样缓冲液
混匀、上样，恒压 2@$ L，2 M。标准分子量标记为
)$$ NO C+D ’,::.P。
电泳结束后将胶剥下，双蒸水冲洗 2 次、每次
)$ -；加 $/ 21硝酸银染色液，摇床轻摇 2$ &GB；双
蒸水冲洗 2 次、每次 )$ -；加 )7$ &’ 显色液，轻摇
7 A J &GB，即可见清楚条带显现，照相保存。电泳分
析使用君意 CQ64@$ 型电泳仪及君意 CQQ4"型垂
直板电泳槽。
表 !" 美国白蛾研究使用的微卫星引物
#$%& !" #’( )*( +, -./0+*$1(22.1( 30.-(0* .4 !"#$%&’()% *+&,%
引物编号与名称
5PG&.P 8P:.P ,B: B,&.
引物序列
3.?R.BS. 8T OPG&.P（7’( @’）
重复序列
*.O.,U UVO.
)/ KW$IW
KW$IK
;6D;666XDX;666D6;6D
D;;X6;6;;66;D;6;XX6;D
（6D）)@
2 / X;;6;6XX;6X;XX;;;;DX
DD66X6;;66X66XD;;D6
（X;+）)I X6;（X;D）2
@ / K6$@W
K6$@K
6;XX6D666;6;D;;;D;6;
DD6DDDD6DD;;D;DDD6;6;;D6
（6D）I
! / XY$IW
XY$IK
D66DD6;;6XD6D66;;6;
6D6;X6666XDD66;D;D6
（XD;）0
7 / DZ$7W
DZ$7K
D6;;6;D6;X6X;X;XDD6;
X;666;;;X;66XD;DD;D;X
（D6）)7
" / DW$!W
DW$!K
XXDX6D66DD;XDDXDD;X;
X;;;6;D66;6D;XXXD;6;;;
（6D;）7 6X;（6D;）2 6D6
J/ CK$2W
CK$2K
;DX6;6D6X;DDDD6;DD;6DD
6;X;66DDDX6DDD6;D;6
（6D）)$
0 / CY)2W
CK)2K
6;X6;DXDX6;;;6;X;X;;
DDXDD;;;6DD;;;DDXD6;XD6
（D;）2 XX（XQ）7 D;X
;（X6）7 6;（X;）)2
5" 结果与分析
2[ )# :+;5 浓度对 33* 反应的影响 # 图 ) 泳道 ) A
! 显示了 ! 个浓度（$/ )，$/ 2，$/ !，$/ " &&89·’ ( )）的
56* 扩增产物情况。虽均有扩增产物，但浓度为
$[ )$ &&89·’ ( )时 56* 产物的产量极低，几乎无扩
增谱带；浓度为 $/ 2$，$/ !$ 和 $/ "$ &&89·’ ( )时均
有扩增谱带，但过量的 :+;5- 会与聚合酶竞争结合
<%2 E，抑制 56* 反应。通过比较，$/ !$ &&89·’ ( )时
扩增带最清晰稳定，而且条带整齐，故 :+;5 的浓度
以 $/ !$ &&89·’ ( )为宜。
2[ 2# <%2 E 浓度对 33* 反应的影响 # <%2 E 浓度在
33* 反应中也非常重要，它是 56* 中 C+D 聚合酶
的活性所必需的辅助因子，因此其浓度在每一引物
与模板配对中均应达最适量。图 2 中泳道 ) A ! 显
示了 <%2 E的 ! 个浓度 )[ 7，2[ 7，@[ 7，![ $ &&89·’ ( )
的扩增结果，由于当 <%2 E浓度为 )[ 7 &&89·’ ( )时扩
增产物条带模糊，浓度为 @[ 7 和 ![ $ &&89·’ ( )时背
景加深，只有 2[ 7 &&89·’ ( ) 时扩增谱带清晰且
稳定。
2[ @# ;,?C+D 聚合酶浓度、引物浓度、模板 C+D 对
33* 反应的影响 # ;,?C+D 聚合酶浓度过低则合成
产物量减少，浓度过高可引起非特异性产物的扩增。
图 @ 显示了不同 ;,?C+D 聚合酶的浓度的 56* 扩
增产物情况。因 ;,?C+D 聚合酶浓度为 $/ 7 > 时条
带模糊不清，为 2[ $，@[ $ > 时易出现非特异性条带，
只有为 )/ $ > 时谱带清晰、且无非特异性产物的扩
增，扩增效果最好。
同理，当引物浓度为 $/ 72 和 $/ J2 !&89·’ ( )时，
背景加深、条带不清，因此只有 $/ @2 !&89·’ ( )为引
!J)
! 第 " 期 杜 ! 娟等：美国白蛾 ##$ 反应体系的优化与初步应用
图 %! &’() 浓度对 ##$ 反应的影响
*+,- %! .//0123 4/ &’() 1451052672+453 45 ##$ 60712+45
% 8 9：&’() 浓度分别为 :- %，:- ;，:- 9，:- < ==4>·? @ %
&’() 1451052672+45 :A %，:- ;，:- 9，:- < ==4>·? @ %；
B：%:: CD 标准分子质量 %:: CD E’F >7&&06-
下同 (G0 37=0 C0>4H-
图 ;! B,; I的浓度对 ##$ 反应的影响
*+,- ;! .//0123 4/ B,; I 1451052672+453 45 ##$ 60712+45
% 8 9：B,; I浓度分别为 %- J，;- J，"- J，9- : ==4>·? @ %
B,; I 1451052672+45 %- J，;- J，"- J，9- : ==4>·? @ % -
图 "! (7K 聚合酶浓度对 ##$ 反应的影响
*+,- "! .//0123 4/ (7K D4>L=06730 1451052672+453
45 ##$ 60712+45
% 8 9：(7K 酶分别为 :- J，%- :，;- :，"- : M
(7K D4>L=06730 :- J，%- :，;- :，"- : M
物优化浓度（图 9）；模板 E’F 在 ":，<: 5, 时谱带
基本稳定且带型清晰，浓度低时条带模糊不清，过高
则背景加深、较难分辨（图 J）。
;A 9! )N$ 反应过程中退火温度对扩增结果的影响
! 退火温度是决定引物与模板结合的另一重要因
素，研究表明（图 <）退火温度较低时无扩增条带或
多为非特异性条带，只有 J;- : O为 F*:9 的最佳退
火温度。其他引物的最佳退火温度见表 ;。
;A J! ##$P)N$ 优化体系的应用 ! 选引物 EQ%;，按
图 9! 引物浓度对 ##$ 反应的影响
*+,- 9! .//0123 4/ D6+=06 1451052672+453 45 ##$ 60712+45
% 8 9：引物浓度分别为 :- %;，:- ";，:- J;，:- R; !=4>·? @ %
)6+=06 1451052672+45 :- %;，:- ";，:- J;，:- R; !=4>·? @ % -
图 J! 模板 E’F 对 ##$ 反应的影响
*+,- J! .//0123 4/ 20=D>720 E’F 7=4S52 45 ##$ 60712+45
% 8 9：模板 E’F 分别为 %J，":，<:，T: 5,
(0=D>720 E’F %J，":，<:，T: 5,-
图 *+,- +5,
20=D0672S60 45 ##$ 60712+45
% 8 J：第 < 对引物 J:，J:- J，J%，J%- J，J; O
)6+=06 < J:，J:- J，J%，J%- J，J; O；
所用引物为 F*:9 (G0 D6+=06 S30& +5 2G0 ##$P)N$ +3 F*:9-
照 &’() 的 B,; I、(7KE’F 聚合酶、引物、模板 E’F
浓度分别为 :A 9: ==4>·? @ %，;- J ==4>·? @ %，%- : M，
:- "; !=4>·? @ %，": 8 <: 5,，退火温度为 J:- : O进行
J 个不同入侵地的美国白蛾种群的 ##$ 扩增，图 R
表明该 ##$P)N$ 反应体系的优化条件能扩增出清
晰、多态性高的谱带，能够阐明美国白蛾不同侵入地
间种群的遗传变异和多态性。
同样用引物 EQ%; 对沧州美国白蛾种群中的
%R 个个体进行 )N$ 扩增，由图 U 可知该引物也能扩
增出清晰、多态性高的谱带。表明上述 ##$P)N$ 反
应体系稳定可靠。
JR%
林 业 科 学 !" 卷 #
表 !" ##$ 引物最佳退火温度
%&’( !" %)* +,-./&0 &11*&0.12 -*/,*3&-43* +5 ,3./*36
引物名称
$%&’(% )*’(
最佳退火温度
+,-&’*. *))(*.&)/ -(’,(%*-0%( 1 2
引物名称
$%&’(% )*’(
最佳退火温度
+,-&’*. *))(*.&)/ -(’,(%*-0%( 1 2
3456 78 9:57 7;
<=5! 75 945! 78
3>5? 75 =358 78
@A56 75 =A;8 75
图 B# 引物 945! 的扩增结果
4&/C B# D(E0.- FG HHD *’,.&G&I*-&F) FG ,%&’(% =A;8
; J 7：丹东 =*)KF)/；" J ;5：烟台 L*)-*&；;; J ;7：秦皇岛 M&)N0*)/K*F；;" J 85：正定 ON()/K&)/；8; J 87：沧州 C
图 P# 引物 =A;8 对 ;B 个沧州美国白蛾基因组 =Q9 的扩增结果
4&/C P# $%FG&.( FG *’,.&I*-&F) ,%FK0I-E G%F’ /()(-&( =Q9 FG ;B !" #$%&’ FG >*)/RNF0 *II(EE&F)E 0E&)/ ,%&’(% =A;8
7" 讨论
HHD 具有稳定性、共显性和多态性等优点，是一
种较为理想的分子标记技术。但在实际应用中，必
须对每个微卫星位点的两翼序列有针对性地设计引
物。一个全新引物的设计，对试验技能要求高，成功
率较低（ ON*)/，855!；姜静，855?）；获得引物较为
便捷的方法是检索 @()3*)S、:序列数据库，参考相关资料进行改进设计。
微卫星标记在鳞翅目昆虫种群遗传学研究中有
不少报道，ON*)/ = W（855!）研究发现鳞翅目粉蝶和
蛾类昆虫基因组的微卫星侧翼序列高度保守，认为
这可能是鳞翅目昆虫微卫星丰富度较低的原因。
<(/.(IR 等（855B）通过对 ?8 种昆虫的微卫星序列的
研究也证实不同物种之间微卫星位点的侧翼序列差
异很大。本研究采用与美国白蛾同一鳞翅目的家蚕
（()*+,- *)./）、棉铃虫（!&0/#)1&.2’ ’.*/3&.’）、马尾
松 松 毛 虫（ 4&%5.)0/*$6 2$%#7’7$6 ）、舞 毒 蛾
（8,*’%7./’ 5/62’.）等昆虫（ V& &7 ’0C，8557；U& &7 ’0C，
8557；@%*E(.* &7 ’0C，8557；李竞等，8557；沈利，
855!；王少丽等，855?；D(KKX &7 ’0C，;666）已有报道
的多态性表现好的引物，建立了适合研究美国白蛾
的 HHD 反应体系，但并不是在鳞翅目昆虫上多态性
表现好的引物对研究美国白蛾都适用，例如家蚕的
B 对微卫星引物就不能成功应用美国白蛾的遗传研
究，用马尾松毛虫筛选出的 P 对引物在美国白蛾遗
传研究中可以得到较好的扩增其主要原因可能是微
卫星高度保守的侧翼序列所致（李竞等，8557；沈
利，855!；王少丽等，855?）。
虽然 HHD 技术在其他昆虫上己经有了很多应
用，但是不同的昆虫具有不同的最适宜体系，因而筛
选 HHD 引物及建立稳定的反应体系是 HHD 多态性
标记成功应用的基础。在 HHD 优化的体系中，过量
的 KQT$E 会与聚合酶竞争结合 D 反
应。其他成分的浓度过高则会引起引物与模板的错
配，产生非特异性扩增；过低会影响 $>D 产物的产
量，条带明显不清楚。$>D 中 =Q9 聚合酶的活性所必需的辅助因子，因此
其浓度在每一引物与模板配对中均应做到最适。
T*Z=Q9 聚合酶浓度过高，可引起非特异性产物的
扩增；浓度过低则合成产物量减少。引物浓度偏高
会引起错配和非特异性产物扩增，且可增加引物之
"B;
! 第 " 期 杜 ! 娟等：美国白蛾 ##$ 反应体系的优化与初步应用
间形成二聚体的机率，非特异性扩增能竞争所使用
的酶、%&’( 和引物，导致 )&* 合成产率下降。模板
的质量并不需要很纯，但一定得量化，其浓度太小会
影响 (+$ 的产量，浓度太大则会产生非特异性产物
或造成扩增泳道背景加深（,-./01. !" #$%，2334）。退
火温度是决定引物与模板结合的另一重要因素，实
验过程中发现不同引物的最佳退火温度不同，但在
本试验中引物的退火温度范围比较小，因而不需太
大的变动，选用其他的引物时可以根据 &5 值稍作
调整，将 &5 控制在 4 6 7 8。
参 考 文 献
季 ! 荣，谢宝瑜，李欣海 9 233"9 外来入侵种———美国白蛾的研究进
展 9昆虫知识，:3（;），" < ;79
吉亚杰，张德兴 9 233:9 鳞翅目昆虫基因组中微卫星 )&* 的特征以
及对其分离的影响 9 动物学报，43（:）：=37 < =;:9
姜 ! 静 9 233"9分子生物学实验原理与技术 9 哈尔滨：东北林业大学
出版社 9
李 ! 竞，刘文明，房守民 9 23349 ##$ 标记在中国野桑蚕和家蚕的遗
传多态性分析中的应用 9蚕业科学，";（"）：24; < 24=9
沈 ! 利 9 233:9家蚕 ##$ 标记和 +*(# 标记的筛选及其应用 9 中国科
学院硕士学位论文 9
魏建荣 9 233"9利用生命表评价白蛾周氏啮小蜂对美国白蛾的控制作
用 9昆虫学报，:=（"）：";7 < "2:9
王少丽，徐 ! 广，杨效文，等 9 233"9 棉铃虫不同寄主植物种群间的微
卫星引物扩增多态性研究 9 棉花学报，;4（2）：>? < 729
杨忠岐，张永安 9 233>9重大外来入侵害虫———美国白蛾生物防治技
术研究 9昆虫知识，::（:）：:=4 < :>;9
张云武，张亚平 9 233;9 微卫星及其应用 9 动物学研究，22（ :）：";4
< "239
,-./01. @ @， ABCDEF/G * H9 23349 +-F//I/J0BC0/ CDK0/ECL.ECFD FM
’!$()*+!,-# #,.(/!,# 5CB-F/.E011CE0/ ./ JFE0DEC.1 5.-N0-/ MF- FEG0-
-01.E0% /JJ0BC0/ CD EG0 H01CBFK0-J.IH01CFEGC/ BF5J10O9 @FP-D.1 FM
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5CB-F/.E011CE0 -0J0.E 10DLEG -0/P1ECDL M-F5 . [.1.DB0 [0ES00D /1CJJ.L0
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A0L10B‘ X，*D%0-/FD # @，_FP-LP0E )9 233>9 ACB-F/.E011CE0 M1.DNCDL
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$F%0-CBN , Y9 ;??=9 ,0FL-.JGCB /E-PBEP-0 FM CD/0BE JFJP1.ECFD/：,0D0
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（责任编辑 ! 朱乾坤）
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