全 文 ：第 源苑 卷 第 苑 期
圆 园 员 员 年 苑 月
林 业 科 学
杂悦陨耘晕栽陨粤 杂陨蕴灾粤耘 杂陨晕陨悦粤耘 灾燥造郾 源苑袁晕燥郾 苑允怎造援 袁圆 园 员 员
唐菖蒲 圆种主要病毒的多重 砸栽鄄孕悦砸检测鄢
胡小燕摇 陈摇 莉摇 辛海波摇 连青龙摇 义鸣放
渊中国农业大学观赏园艺与园林系摇 北京 员园园员怨猿冤
摘摇 要院摇 根据黄瓜花叶病毒渊糟怎糟怎皂遭藻则 皂燥泽葬蚤糟 增蚤则怎泽袁悦酝灾冤和烟草花叶病毒渊 贼燥遭葬糟糟燥 皂燥泽葬蚤糟 增蚤则怎泽袁栽酝灾冤外壳蛋白
基因序列分别设计特异性引物对袁运用单重 砸栽鄄孕悦砸检测到病毒并筛选出适合多重 砸栽鄄孕悦砸 的引物对遥 以唐菖蒲
员愿杂 则砸晕粤为内参照袁建立同时检测 悦酝灾 和 栽酝灾 的多重 砸栽鄄孕悦砸 方法遥 此方法可从带病样品中扩增出 悦酝灾渊远圆怨
遭责冤和 栽酝灾渊源圆猿 遭责冤圆 条特异片段遥 测序结果表明院 悦酝灾 扩增产物与其他植物分离物核苷酸的同源性为 怨猿豫 耀
怨苑豫 袁栽酝灾扩增产物与其他分离物核苷酸的同源性可达 怨怨豫 遥
关键词院摇 唐菖蒲曰 多重 砸栽鄄孕悦砸曰 黄瓜花叶病毒曰 烟草花叶病毒曰 员愿杂 则砸晕粤
中图分类号院 杂远愿圆郾 圆源摇 摇 摇 文献标识码院粤摇 摇 摇 文章编号院员园园员 原 苑源愿愿渊圆园员员冤园苑 原 园员圆愿 原 园缘
收稿日期院 圆园园怨 原 员圆 原 员员曰 修回日期院 圆园员园 原 园猿 原 园怨遥
基金项目院 国家自然科学基金项目渊猿园源苑员圆圆员冤遥
鄢义鸣放为通讯作者遥
阅藻贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣 栽憎燥 灾蚤则怎泽藻泽 燥枣 郧造葬凿蚤燥造怎泽 澡赠遭则蚤凿怎泽 遭赠 酝怎造贼蚤责造藻曾 砸栽鄄孕悦砸
匀怎 载蚤葬燥赠葬灶摇 悦澡藻灶 蕴蚤摇 载蚤灶 匀葬蚤遭燥摇 蕴蚤葬灶 匝蚤灶早造燥灶早摇 再蚤 酝蚤灶早枣葬灶早
渊阅藻责葬则贼皂藻灶贼 燥枣 韵则灶葬皂藻灶贼葬造 匀燥则贼蚤糟怎造贼怎则藻 葬灶凿 蕴葬灶凿泽糟葬责藻 粤则糟澡蚤贼藻糟贼怎则藻袁悦澡蚤灶葬 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠摇 月藻蚤躁蚤灶早 员园园员怨猿冤
粤遭泽贼则葬糟贼院摇 杂责藻糟蚤枣蚤糟 责则蚤皂藻则 责葬蚤则泽 憎藻则藻 凿藻泽蚤早灶藻凿 葬糟糟燥则凿蚤灶早 贼燥 贼澡藻 早藻灶藻 泽藻择怎藻灶糟藻 燥枣 糟怎糟怎皂遭藻则 皂燥泽葬蚤糟 增蚤则怎泽渊悦酝灾冤 葬灶凿
贼燥遭葬糟糟燥 皂燥泽葬蚤糟 增蚤则怎泽渊栽酝灾冤糟燥葬贼 责则燥贼藻蚤灶 则藻早蚤燥灶援 栽澡藻 贼憎燥 增蚤则怎泽藻泽 糟燥怎造凿 遭藻 凿藻贼藻糟贼藻凿 遭赠 泽蚤皂责造藻 砸栽鄄孕悦砸 憎蚤贼澡 贼澡藻 责则蚤皂藻则泽
葬灶凿 贼澡藻 泽怎蚤贼葬遭造藻 责则蚤皂藻则泽 憎藻则藻 泽藻造藻糟贼藻凿 枣燥则 皂怎造贼蚤责造藻曾 砸栽鄄孕悦砸援 哉泽蚤灶早 员愿杂 则砸晕粤 燥枣 早造葬凿蚤燥造怎泽 葬泽 葬灶 蚤灶贼藻则灶葬造 糟燥灶贼则燥造袁 葬
皂怎造贼蚤责造藻曾 砸栽鄄孕悦砸 责则燥早则葬皂 憎葬泽 藻泽贼葬遭造蚤泽澡藻凿 贼燥 泽蚤皂怎造贼葬灶藻燥怎泽造赠 凿藻贼藻糟贼 贼澡藻 贼憎燥 增蚤则怎泽藻泽 燥枣 郧造葬凿蚤燥造怎泽 澡赠遭则蚤凿怎泽援 栽憎燥 泽责藻糟蚤枣蚤糟
遭葬灶凿泽袁悦酝灾渊远圆怨 遭责冤葬灶凿 栽酝灾渊源圆猿 遭责冤憎藻则藻 葬皂责造蚤枣蚤藻凿 枣则燥皂 葬造造 贼澡藻 泽葬皂责造藻泽 蚤灶枣藻糟贼藻凿 憎蚤贼澡 悦酝灾 葬灶凿 栽酝灾 遭赠 贼澡藻 皂怎造贼蚤责造藻曾
砸栽鄄孕悦砸援 杂藻择怎藻灶糟藻 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 贼澡藻 葬皂责造蚤枣蚤藻凿 责则燥凿怎糟贼泽 泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻 灶怎糟造藻燥贼蚤凿藻 泽藻择怎藻灶糟藻泽 澡燥皂燥造燥早赠 燥枣 悦酝灾 葬灶凿 栽酝灾
憎葬泽 怨猿豫 耀怨苑豫 葬灶凿 怨怨豫 袁 则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠袁 糟燥皂责葬则藻凿 憎蚤贼澡 贼澡藻 泽藻择怎藻灶糟藻泽 燥枣 燥贼澡藻则 蚤泽燥造葬贼藻泽援
运藻赠 憎燥则凿泽院摇 郧造葬凿蚤燥造怎泽 澡赠遭则蚤凿怎泽曰 酝怎造贼蚤责造藻曾 砸栽鄄孕悦砸曰 悦酝灾曰 栽酝灾曰 员愿杂 则砸晕粤
摇 摇 唐菖蒲渊郧造葬凿蚤燥造怎泽 澡赠遭则蚤凿怎泽冤是鸢尾科唐菖蒲属
多年生球茎类草本植物袁世界著名的四大切花之一遥
唐菖蒲主要依靠小籽球无性繁殖袁这使植物体内逐
渐积累大量病毒袁导致植株茎叶萎缩尧根部腐烂尧花
朵变形尧杂色袁严重影响了观赏价值袁是造成唐菖蒲
种性退化的主要原因遥 迄今为止袁在全世界已发现
的侵染唐菖蒲的病毒有 员园 多种袁其中黄瓜花叶病毒
渊糟怎糟怎皂遭藻则 皂燥泽葬蚤糟 增蚤则怎泽袁 悦酝灾冤 和烟草花叶病毒
渊贼燥遭葬糟糟燥 皂燥泽葬蚤糟 增蚤则怎泽袁栽酝灾冤在我国是常见侵染且分
布较广的 圆 种主要病毒渊刘丹红等袁 员怨怨源冤遥 因此袁
建立高效灵敏的唐菖蒲病毒检测方法袁对种球出入
境检疫尧脱毒苗检测具有重要意义遥
用于检测唐菖蒲病毒的方法主要有生物法尧血
清法尧电镜法和 砸栽鄄孕悦砸技术等袁其中生物法检测周
期长袁电镜技术依赖大型精密仪器且操作要求严格袁
血清法抗血清成本高且灵敏度低袁在病毒检测时均
具有一定的局限性遥 近年来袁砸栽鄄孕悦砸 技术因灵敏尧
快速尧特异等优点已被广泛应用到唐菖蒲病毒检测
中袁其中多重 砸栽鄄孕悦砸 技术能在一个反应体系中同
时检测多种病毒袁比单重 砸栽鄄孕悦砸 更经济尧更高效遥
病毒分子检测过程中袁常因模板尧酶等反应物的干扰
出现假阴性的情况袁运用内参照可有效解决假阴性
的问题袁提高检测结果的可信度渊王冲等袁 圆园园远冤遥
目前袁未见国内外利用内参照对 悦酝灾 和 栽酝灾 圆 种
唐菖蒲主要病毒进行多重 砸栽鄄孕悦砸 检测的报道遥 本
文以唐菖蒲的 员愿杂 则砸晕粤为内参照袁对 悦酝灾和 栽酝灾
的多重 砸栽鄄孕悦砸 检测技术进行了研究袁建立了唐菖
蒲 圆 种主要病毒的分子鉴定方法遥
员摇 材料与方法
员郾 员摇 材料
唐菖蒲品种耶 粤凿增葬灶糟藻凿 砸藻凿蒺 种球直径 圆郾 缘 耀
摇 第 苑 期 胡小燕等院 唐菖蒲 圆 种主要病毒的多重 砸栽鄄孕悦砸检测
猿郾 园 糟皂袁籽球直径 园郾 远 耀 园郾 愿 糟皂袁购自辽宁金城试验
基地遥 圆园园愿 年 源 月种球种植于中国农业大学科学
园试验地袁圆园园愿 年 员园 月采收具有 悦酝灾尧栽酝灾 明显
症状的唐菖蒲籽球袁以籽球离体培养获得的试管苗
作为阳性材料袁以健康唐菖蒲籽球试管苗作为阴性
对照材料遥
通过籽球茎尖培养获得的唐菖蒲组培苗保存于
三角瓶中遥
员郾 圆摇 方法
员郾 圆郾 员摇 引物设计摇 根据 晕悦月陨 郧藻灶遭葬灶噪中登录的唐
菖蒲 员愿杂 则砸晕粤和 悦酝灾尧栽酝灾病毒外壳蛋白渊悦孕冤的
基因序列袁应用 孕则蚤皂藻则 孕则藻皂蚤藻则 缘郾 园 软件分别设计
员愿杂 则砸晕粤和 圆 种病毒的特异引物袁引物核酸序列见
表 员遥
表 员摇 砸栽鄄孕悦砸特异引物
栽葬遭援 员摇 杂责藻糟蚤枣蚤糟 责则蚤皂藻则泽 枣燥则 砸栽鄄孕悦砸
引物来源杂燥怎则糟藻 燥枣 责则蚤皂藻泽 引物对孕则蚤皂藻 责葬蚤则泽 序列杂藻择怎藻灶糟藻渊缘忆 原 猿忆冤 引物位置 辕登录号孕燥泽蚤贼蚤燥灶 辕 粤糟糟藻泽泽蚤燥灶 晕燥援 产物大小孕则燥凿怎糟贼 泽蚤扎藻 辕 遭责
员愿杂 杂云 辕 杂砸 粤郧粤粤粤悦郧郧悦栽粤悦悦粤悦粤栽悦 源园员要源员愿 辕 蕴缘源园远圆 圆源缘
悦悦粤粤郧郧栽悦悦粤粤悦栽粤悦郧粤郧 远圆愿要远源缘 辕 蕴缘源园远圆
栽酝灾 栽云员 辕 栽砸员 郧栽悦栽郧栽栽栽粤郧悦悦郧郧栽栽栽郧郧栽 员怨怨要圆员愿 辕 粤允缘园怨园愿猿 源圆猿
粤粤郧悦悦栽郧粤栽悦郧粤悦粤栽粤郧郧郧粤 远园圆要远圆员 辕 粤允缘园怨园愿猿
栽酝灾 栽云圆 辕 栽砸员 郧粤栽郧郧粤粤粤郧粤郧悦悦郧粤悦郧粤郧 圆愿愿要猿园远 辕 粤允缘园怨园愿猿 猿猿源
粤粤郧悦悦栽郧粤栽悦郧粤悦粤栽粤郧郧郧粤 远园圆要远圆员 辕 粤允缘园怨园愿猿
悦酝灾 悦云员 辕 悦砸员 郧悦栽郧郧栽悦郧栽悦悦粤 粤悦渊悦 辕 栽冤 粤栽栽 员 圆苑远要员 圆怨猿 辕 粤酝园源愿愿猿员 源怨猿
栽郧郧郧粤粤栽郧悦郧栽栽郧郧栽郧悦栽 员 苑缘员要员 苑远愿 辕 粤酝园源愿愿猿员
悦酝灾 悦云圆 辕 悦砸圆 粤粤悦栽栽栽粤郧渊郧 辕 粤冤郧栽悦栽栽郧栽悦郧悦 员 圆圆缘要员 圆源猿 辕 粤酝园源愿愿猿员 源园缘
栽栽栽郧栽栽郧栽栽渊郧 辕 粤冤郧悦栽栽郧郧粤悦栽悦 员 远员园要员 远圆怨 辕 粤酝园源愿愿猿员
悦酝灾 悦云圆 辕 悦砸员 粤粤悦栽栽栽粤郧渊郧 辕 粤冤郧栽悦栽栽郧栽悦郧悦 员 圆圆缘要员 圆源猿 辕 粤酝园源愿愿猿员 缘源源
栽郧郧郧粤粤栽郧悦郧栽栽郧郧栽郧悦栽 员 苑缘员要员 苑远愿 辕 粤酝园源愿愿猿员
悦酝灾 悦云猿 辕 悦砸员 悦粤粤粤栽悦栽郧粤粤栽悦粤粤悦悦粤郧栽郧悦 员 员源园要员 员远园 辕 粤酝园源愿愿猿员 远圆怨
栽郧郧郧粤粤栽郧悦郧栽栽郧郧栽郧悦栽 员 苑缘员要员 苑远愿 辕 粤酝园源愿愿猿员
员郾 圆郾 圆摇 总 砸晕粤的提取摇 取 园郾 员 早 唐菖蒲叶片在液
氮中研磨袁根据 陨灶增蚤贼则燥早藻灶 公司 栽则蚤扎燥造 试剂说明袁提
取总 砸晕粤袁最后用 圆园 滋蕴 砸晕葬泽藻 枣则藻藻 凿凿匀圆韵 溶解
总 砸晕粤遥
员郾 圆郾 猿摇 单重 砸栽鄄孕悦砸摇 在离心管中加入 员源郾 缘 滋蕴总
砸晕粤和 园郾 缘 滋蕴 特异下游引物 渊 悦砸员尧栽砸员 或 杂砸袁
员园园 滋皂燥造窑蕴 原员冤袁苑园 益变性 缘 皂蚤灶袁取出冰浴 圆 皂蚤灶曰
加入 缘 伊 酝鄄酝蕴灾 遭怎枣枣藻则 缘 滋蕴袁员园 皂皂燥造窑蕴 原员 凿晕栽孕泽
员郾 圆缘 滋蕴袁 源园 哉窑滋蕴 原员 砸晕葬泽蚤灶 陨灶澡蚤遭蚤贼燥则 园郾 远圆缘 滋蕴袁
圆园园 哉窑滋蕴 原员 酝鄄酝蕴灾 反转录酶 员 滋蕴袁 加 砸晕葬泽藻 枣则藻藻
凿凿匀圆韵 补足至总体积 圆缘 滋蕴遥 源圆 益员澡袁苑园 益员缘 皂蚤灶袁
合成 糟阅晕粤遥
孕悦砸扩增体系为院 糟阅晕粤员 滋蕴袁员园 滋皂燥造窑蕴 原员上
下游引物各 员 滋蕴袁圆郾 缘 皂皂燥造窑蕴 原员 凿晕栽孕泽 圆 滋蕴袁员园 伊
孕悦砸 遭怎枣枣藻则 圆郾 缘 滋蕴袁缘 哉窑滋蕴 原员 栽葬择 酶 园郾 圆 滋蕴袁加
凿凿匀圆韵 补足至 圆缘 滋蕴遥 反应程序院 预变性 缘 皂蚤灶曰怨源 益变性 猿园 泽袁缘园 益退火 猿园 泽袁苑圆 益延伸 源缘 泽袁猿缘
个循环曰 苑圆 益延伸 员园 皂蚤灶袁源 益终止反应遥 取 员园 滋蕴
扩增产物进行 员豫琼脂糖凝胶电泳袁利用 月蚤燥砸葬凿 凝
胶成像系统观察结果遥
员郾 圆郾 源摇 多重 砸栽鄄孕悦砸摇 多重 砸栽 反应体系院 同时加
入 悦砸员尧栽砸员 和 杂砸特异下游引物各 园郾 缘 滋蕴 至同一
孕悦砸管袁其他条件与单重 砸栽相同遥
将 猿 对 引 物 渊 杂云 辕 杂砸尧 栽云员 辕 栽砸员尧 悦云猿 辕 悦砸员袁
员园 滋皂燥造窑蕴 原员冤加入同一 孕悦砸管袁各引物浓度组合见
表 圆遥 对多重 砸栽鄄孕悦砸的反应体系和反应程序进行
优化袁筛选合适的多重 砸栽鄄孕悦砸反应模式遥
表 圆摇 多重 砸栽鄄孕悦砸引物浓度组合
栽葬遭援 圆摇 悦燥皂遭蚤灶葬贼蚤燥灶泽 燥枣 责则蚤皂藻 糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶
蚤灶 皂怎造贼蚤责造藻曾 砸栽鄄孕悦砸
处理组合栽则藻葬贼皂藻灶贼糟燥皂遭蚤灶葬贼蚤燥灶
引物浓度
孕则蚤皂藻 糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶 辕 渊滋皂燥造窑蕴 原员 冤
杂云 辕 杂砸 栽云员 辕 栽砸员 悦云猿 辕 悦砸员
员 园郾 员 园郾 圆 园郾 源
圆 园郾 员 园郾 源 园郾 圆
猿 园郾 圆 园郾 圆 园郾 源
源 园郾 圆 园郾 圆 园郾 圆
缘 园郾 圆 园郾 源 园郾 圆
远 园郾 源 园郾 源 园郾 源
员郾 圆郾 缘摇 砸栽鄄孕悦砸产物的回收尧验证和测序摇 砸栽鄄孕悦砸
扩增产物用百泰克回收试剂盒回收纯化袁与 栽葬运葬砸葬
责酝阅员愿鄄栽载体连接后转化大肠杆菌 阅匀缘琢感受态细
胞袁挑取白色菌落经 孕悦砸 鉴定获取阳性克隆袁送奥
科生物公司进行测序袁测序结果利用 晕悦月陨 月造葬泽贼 和
阅晕粤酝粤晕软件进行同源性比较遥
员郾 圆郾 远摇 利用多重 砸栽鄄孕悦砸 检测唐菖蒲脱毒苗 摇 利
用已建立的多重 砸栽鄄孕悦砸 体系对随机抽样的 员园 株
怨圆员
林 业 科 学 源苑 卷摇
唐菖蒲茎尖组培脱毒苗进行病毒检测袁并用单重
砸栽鄄孕悦砸方法进行验证遥
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 单重 砸栽鄄孕悦砸检测及多重 砸栽鄄孕悦砸引物筛选
唐菖蒲总 砸晕粤经反转录后 孕悦砸 扩增的电泳结
果表明院 引物对 杂云 辕 杂砸能扩增出与预期大小一致的
员愿杂 则砸晕粤基因片段袁适合用作唐菖蒲病毒检测的内
参照曰 引物对 栽云员 辕 栽砸员 和 栽云圆 辕 栽砸员 能从染病植株
中扩增出 栽酝灾的特异片段曰引物对 悦云员 辕 悦砸员尧悦云圆 辕
悦砸员尧悦云猿 辕 悦砸员 能扩增出 悦酝灾的特异片段袁而 悦云圆 辕
悦砸圆 除了扩增出 悦酝灾 的特异片段之外还出现非特
异性扩增产物曰 设置的阴性对照没有对应的目的条
带渊图 员冤遥引物对 栽云员 辕 栽砸员尧栽云圆 辕 栽砸员 和 悦云员 辕 悦砸员尧
悦云圆 辕 悦砸员尧悦云猿 辕 悦砸员 可分别用于单重 砸栽鄄孕悦砸 检测
唐菖蒲 栽酝灾和 悦酝灾病毒遥
利用软件 阅晕粤酝粤晕 检测引物间的互补性及引
物退火温度袁引物对 悦云员 辕 悦砸员尧悦云员 辕 悦砸圆尧悦云圆 辕 栽砸员尧
栽云圆 辕 悦砸圆尧悦云猿 辕 悦砸圆 存在较强的互补性袁不适合用
于多重 孕悦砸 引物组合遥 引物对 杂云 辕 杂砸尧栽云员 辕 栽砸员尧
悦云猿 辕 悦砸员 退火温度接近袁且扩增的目的片段大小有
明显差异袁易于区分遥 因此袁选择 杂云 辕 杂砸尧栽云员 辕 栽砸员尧
悦云猿 辕 悦砸员 作为多重 砸栽鄄孕悦砸的引物遥
图 员摇 单重 砸栽鄄孕悦砸扩增结果
云蚤早援 员摇 粤皂责造蚤枣蚤藻凿 则藻泽怎造贼泽 燥枣 泽蚤灶早造藻 砸栽鄄孕悦砸
酝院 阅晕粤 分子标记 阅蕴圆园园园 酝葬噪藻则 阅蕴圆园园园曰 员院 引物对 杂云 辕 杂砸
扩增内参 粤皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 蚤灶贼藻则灶葬造 糟燥灶贼则燥造 遭赠 杂云 辕 杂砸曰 圆 原猿院 引物
对 栽云员 辕 栽砸员尧栽云圆 辕 栽砸员 扩增 栽酝灾 粤皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 栽酝灾 遭赠 栽云员 辕
栽砸员袁栽云圆 辕 栽砸员曰 源 原苑院 引物对 悦云员 辕 悦砸员尧悦云圆 辕 悦砸圆尧悦云圆 辕 悦砸员 和
悦云猿 辕 悦砸员 扩增 悦酝灾 粤皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 悦酝灾 遭赠 悦云员 辕 悦砸员袁悦云圆 辕
悦砸圆袁悦云圆 辕 悦砸员 葬灶凿 悦云猿 辕 悦砸员曰 愿院 阴性对照 晕藻早葬贼蚤增藻 泽葬皂责造藻援
圆郾 圆摇 多重 砸栽鄄孕悦砸检测
以 员愿杂 则砸晕粤 作为内参照袁通过双重尧三重 砸栽鄄
孕悦砸分别可从带有 栽酝灾和 悦酝灾病毒的唐菖蒲叶片
中扩增出 员 条或 圆 条特异的病毒片段袁健康叶片则
仅扩增内参照片段袁均未出现非特异性扩增产物
渊图 圆冤遥
圆郾 猿摇 多重 砸栽鄄孕悦砸优化体系的建立
通过不同引物浓度组合进行多重扩增袁结果显
图 圆摇 多重 砸栽鄄孕悦砸特异性扩增结果
云蚤早援 圆摇 杂责藻糟蚤枣蚤糟蚤贼赠 葬皂责造蚤枣蚤藻凿 则藻泽怎造贼泽 燥枣 皂怎造贼蚤责造藻曾 砸栽鄄孕悦砸
酝院 阅晕粤 分子标记 阅蕴圆园园园 酝葬噪藻则 阅蕴圆园园园曰 员院 健康叶片扩增
员愿杂 则砸晕粤 粤皂责造蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 员愿杂 则砸晕粤 枣则燥皂 澡藻葬造枣澡赠 造藻葬增藻泽曰 圆院 双
重扩增 员愿杂 则砸晕粤和 栽酝灾 阅燥怎遭造藻 葬皂责造蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 员愿杂 则砸晕粤 葬灶凿
栽酝灾曰 猿院 双重扩增 员愿杂 则砸晕粤 和 悦酝灾 阅燥怎遭造藻 葬皂责造蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣
员愿杂 则砸晕粤 葬灶凿 悦酝灾曰 源院 三重扩增 员愿杂 则砸晕粤袁栽酝灾 和 悦酝灾
栽则蚤责造藻曾 葬皂责造蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 员愿杂 则砸晕粤袁栽酝灾 葬灶凿 悦酝灾援
示袁相同浓度的引物进行多重扩增时袁内参照的扩增
片段最亮袁长片段的 悦酝灾扩增片段较弱渊图 猿冤遥 这
是因为引物存在竞争性扩增袁内参照片段短较易扩
增袁且内参照模板量高于病毒模板量遥 对引物浓度
进行调节袁增加 悦酝灾 的引物浓度袁并降低内参照的
引物浓度袁 得到最佳引物浓度组合为 杂云 辕 杂砸
园郾 圆 滋皂燥造窑蕴 原员尧 栽云员 辕 栽砸员 园郾 圆 滋皂燥造 窑 蕴 原员尧 悦云猿 辕
悦砸员 园郾 源 滋皂燥造窑蕴 原员遥
图 猿摇 不同引物浓度组合的多重 砸栽鄄孕悦砸扩增结果
云蚤早援 猿摇 酝怎造贼蚤责造藻曾 砸栽鄄孕悦砸 葬皂责造蚤枣蚤藻凿 则藻泽怎造贼泽 怎泽蚤灶早 凿蚤枣枣藻则藻灶贼
糟燥皂遭蚤灶葬贼蚤燥灶泽 燥枣 责则蚤皂藻则 糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶
酝院 阅晕粤分子标记 阅蕴圆园园园 酝葬噪藻则 阅蕴圆园园园曰 员院 杂云 辕 杂砸 园郾 员滋皂燥造窑
蕴 原员袁栽云员 辕 栽砸员 园郾 圆 滋皂燥造窑蕴 原员袁悦云猿 辕 悦砸员 园郾 源 滋皂燥造窑蕴 原员曰 圆院 杂云 辕 杂砸
园郾 员滋皂燥造窑蕴 原员袁栽云员 辕 栽砸员 园郾 源 滋皂燥造窑蕴 原员袁悦云猿 辕 悦砸员 园郾 圆 滋皂燥造窑蕴 原员曰
猿院 杂云 辕 杂砸 园郾 圆 滋皂燥造窑蕴 原员袁 栽云员 辕 栽砸员 园郾 圆 滋皂燥造窑蕴 原员袁 悦云猿 辕 悦砸员 园郾 源
滋皂燥造窑蕴 原员曰 源院 杂云 辕 杂砸 园郾 圆 滋皂燥造窑蕴 原员袁栽云员 辕 栽砸员 园郾 圆 滋皂燥造窑蕴 原员袁
悦云猿 辕 悦砸员 园郾 圆 滋皂燥造窑蕴 原员曰 缘院 杂云 辕 杂砸 园郾 圆 滋皂燥造窑蕴 原员袁 栽云员 辕 栽砸员 园郾 源
滋皂燥造窑蕴 原员袁悦云猿 辕 悦砸员 园郾 圆 滋皂燥造窑蕴 原员曰 远院 杂云 辕 杂砸 园郾 源 滋皂燥造窑蕴 原员袁
栽云员 辕 栽砸员 园郾 源 滋皂燥造窑蕴 原员袁 悦云猿 辕 悦砸员 园郾 源 滋皂燥造窑蕴 原员 援
经过多重 砸栽鄄孕悦砸 的优化袁发现提高长片段
悦酝灾的引物浓度尧增加延伸时间有利于多重 孕悦砸
扩增遥 试验得到最佳反应体系为院 糟阅晕粤 圆 滋蕴袁内
参照引物 杂云 辕 杂砸各 园郾 缘 滋蕴袁栽酝灾引物 栽云员 辕 栽砸员 各
园郾 缘 滋蕴袁 悦酝灾 引 物 悦云猿 辕 悦砸员 各 员 滋蕴袁
圆郾 缘 皂皂燥造窑蕴 原员 凿晕栽孕泽 源 滋蕴袁 员园 伊 孕悦砸 遭怎枣枣藻则
园猿员
摇 第 苑 期 胡小燕等院 唐菖蒲 圆 种主要病毒的多重 砸栽鄄孕悦砸检测
圆郾 缘 滋蕴袁缘 哉窑滋蕴 原员 栽葬择 酶 园郾 缘 滋蕴袁加 凿凿匀圆韵 补足
至圆缘 滋蕴遥扩增程序院 怨源 益预变性 缘 皂蚤灶曰 怨源 益变
性源缘 泽袁缘园 益退火 员 皂蚤灶袁苑圆 益延伸 圆 皂蚤灶袁猿园 个循
环曰 苑圆 益延伸 员园 皂蚤灶遥
圆郾 源摇 砸栽鄄孕悦砸产物序列分析
对扩增产物回收并测序袁结果显示 悦酝灾 经引
物对 悦云猿 辕 悦砸员 扩增的片段为 远圆怨 遭责袁与预期的产
物大小一致袁通过与 郧藻灶藻月葬灶噪中其他植物的 悦酝灾
分离物序列比对发现袁本试验得到的 悦酝灾 悦孕 基
因序列与日本六出花分离物 渊 郧藻灶藻月葬灶噪 晕燥援
粤月圆远员员苑猿冤同源性为 怨猿豫 袁与台湾香蕉分离物
渊郧藻灶藻月葬灶噪 晕燥援 耘哉猿圆怨园员远冤同源性达 怨苑豫 渊图 源冤遥
栽酝灾经引物对 栽云员 辕 栽砸员 扩增的片段为 源圆猿 遭责袁与
预期的产物大小一致袁与西班牙烟草分离物
渊郧藻灶藻月葬灶噪 晕燥援 粤允缘园怨园愿猿冤和韩国凤仙花分离物
渊郧藻灶藻月葬灶噪 晕燥援 粤月猿缘源怨缘缘冤等同源性高达 怨怨豫
渊图 缘冤遥 这 圆 种病毒的 悦孕 基因是高度保守的遥
本试验建立的唐菖蒲 悦酝灾 和 栽酝灾 多重 砸栽鄄孕悦砸
体系检测结果可靠袁试验设计的病毒引物也具有
广泛适用性遥
图 源摇 唐菖蒲 悦酝灾扩增片段与其他植物 悦酝灾分离物核苷酸序列的同源性比较
云蚤早援 源摇 栽澡藻 澡燥皂燥造燥早赠 糟燥皂责葬则蚤泽燥灶 燥枣 灶怎糟造藻燥贼蚤凿藻 葬糟蚤凿 泽藻择怎藻灶糟藻泽 燥枣 悦酝灾 葬皂燥灶早 郧造葬凿蚤燥造怎泽 葬灶凿 燥贼澡藻则 蚤泽燥造葬贼藻泽
图 缘摇 唐菖蒲 栽酝灾扩增片段与其他植物 栽酝灾分离物核苷酸序列的同源性比较
云蚤早援 缘摇 栽澡藻 澡燥皂燥造燥早赠 糟燥皂责葬则蚤泽燥灶 燥枣 灶怎糟造藻燥贼蚤凿藻 葬糟蚤凿 泽藻择怎藻灶糟藻泽 燥枣 栽酝灾 葬皂燥灶早 郧造葬凿蚤燥造怎泽 葬灶凿 燥贼澡藻则 蚤泽燥造葬贼藻泽
圆郾 缘摇 多重 砸栽鄄孕悦砸检测唐菖蒲茎尖脱毒苗
利用多重 砸栽鄄孕悦砸 方法对 员园 株经茎尖脱毒处
理的唐菖蒲组培苗进行检测遥 结果表明院 圆 株组培
苗未脱除 悦酝灾袁猿 株组培苗未脱除 栽酝灾渊图 远冤遥 运
用单重 砸栽鄄孕悦砸 验证袁结果一致遥 证明了本试验建
立的多重 砸栽鄄孕悦砸方法适用于脱毒苗的检测遥
图 远摇 多重 砸栽鄄孕悦砸检测唐菖蒲组培苗
云蚤早援 远摇 阅藻贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣 贼憎燥 增蚤则怎泽藻泽 燥枣 郧造葬凿蚤燥造怎泽
蚤灶 增蚤贼则燥 责造葬灶贼造藻贼泽 遭赠 皂怎造贼蚤责造藻曾 砸栽鄄孕悦砸
猿摇 结论与讨论
多重 砸栽 反应中引物可采用 猿 种形式院 韵造蚤早燥
渊凿栽冤尧随机引物和特异引物遥 韵造蚤早燥 渊 凿栽冤 引物与
砸晕粤猿忆端 孕燥造赠赃渊粤冤加尾结合袁可用其检测带 孕燥造赠赃
渊粤冤 的病毒渊晕蚤藻 藻贼 葬造援袁 圆园园园曰 肖远辉等袁 圆园园苑冤遥
随机引物会合成大量植物 糟阅晕粤袁干扰病毒 糟阅晕粤合
成效率遥 特异引物则有针对的合成病毒 糟阅晕粤袁提
高了 糟阅晕粤模板的纯度袁减少了非特异模板的干扰
渊运葬贼燥糟澡 藻贼 葬造援袁 圆园园圆 冤遥 本研究的预试验中使用
韵造蚤早燥渊凿栽冤引物均未扩增出病毒条带袁可能是因为
悦酝灾和 栽酝灾 圆 种病毒均不具有 孕燥造赠赃渊粤冤 尾袁不适
合用 韵造蚤早燥渊凿栽冤 进行反转录遥 而采用 圆 种病毒特异
引物反转录得到的 糟阅晕粤 质量高袁有利于后续 孕悦砸
扩增遥
在多重 砸栽鄄孕悦砸 检测时因受到模板尧酶等反应
物的干扰袁检测结果常出现假阴性遥 已有报道运用
晕粤阅匀脱氢酶 灶葬凿缘 基因和 皂砸晕粤 作为内参照防止
假阴性袁提高检测结果的可靠性渊牛建新等袁 圆园园远曰
酝藻灶扎藻造 藻贼 葬造援袁圆园园圆曰 栽澡燥皂责泽燥灶 藻贼 葬造援袁圆园园猿冤遥 在唐菖
员猿员
林 业 科 学 源苑 卷摇
蒲中运用内参照检测病毒还未见报道遥 员愿杂 则砸晕粤
在植物体中含量很高袁半衰期比 皂砸晕粤 长袁周年存
在于植物体内遥 本研究选用唐菖蒲 员愿杂 则砸晕粤 作内
参照袁稳定地扩增出内参片段袁这一内参同样适用于
唐菖蒲其他病毒的检测遥
多重 孕悦砸在同一反应中进行多个位点的特异
扩增袁引物间的配对尧引物间的竞争性扩增等均影响
扩增效果渊黄银花等袁 圆园园猿冤遥 本试验在选择多重扩
增引物时避免了引物间尧引物和其他模板间的互补
配对袁未产生非特异性扩增的干扰遥 筛选得到的引
物 栽皂 值较接近袁保证了在相同的反应程序中均得
到扩增遥 试验得到的扩增片段大小有一定差异袁有
利于电泳时区分产物遥
据报道袁国内外利用单重 砸栽鄄孕悦砸 技术已成功
检测了唐菖蒲上的多种病毒 渊 砸葬躁 藻贼 葬造援袁 员怨怨愿袁
圆园园圆曰 丁元明等袁 圆园园愿冤遥 本研究建立了多重 砸栽鄄
孕悦砸检测体系并对扩增程序进行了优化袁同时检测
了两种病毒袁简化了操作程序袁比单重 砸栽鄄孕悦砸 更经
济尧更高效遥 田间栽培的唐菖蒲往往受多种病毒的
复合侵染袁因此多重 孕悦砸 方法有更广阔的应用
前景遥
参 考 文 献
丁元明袁秦绍钊袁王云月袁等援 圆园园愿援 进境唐菖蒲种球携带南芥菜花
叶病毒的检测援华中农业大学学报袁圆苑渊员冤院 源远 原 源愿援
黄银花袁胡晓湘袁徐慰倬袁等援 圆园园远援 影响多重 孕悦砸扩增效果的因素援
遗传袁圆缘渊员冤院 远缘 原 远愿援
刘丹红袁杨家书袁王志民袁等援 员怨怨源援 沈阳地区唐菖蒲病毒种类鉴定援
沈阳农业大学学报袁圆缘渊圆冤院 员缘怨 原 员远猿援
牛建新袁马兵钢袁何 摇 梅袁等援 圆园园远援 库尔勒香梨主要病毒多重 砸栽鄄
孕悦砸检测技术研究援植物病理学报袁猿远渊员冤院 员圆 原 圆员援
王摇 冲袁陈集双袁洪 摇 健袁等援 圆园园远援 以 员愿杂 则砸晕粤 为内参照的多重
砸栽鄄孕悦砸检测 猿 种百合病毒援植物病理学报袁猿远渊猿冤院 圆园源 原 圆员员援
肖远辉袁曾继吾袁张秋明袁等援 圆园园苑援 柑橘衰退病尧裂皮病和碎叶病的
多重 砸栽鄄孕悦砸检测方法研究援植物病理学报袁猿苑渊员冤院 猿员 原 猿缘援
运葬贼燥糟澡 酝袁砸葬皂 砸袁在葬蚤凿蚤 粤 粤袁藻贼 葬造援 圆园园圆援 杂贼葬贼怎泽 燥枣 遭藻葬灶 赠藻造造燥憎 皂燥泽葬蚤糟
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酝藻灶扎藻造 宰袁 允藻造噪皂葬灶灶 宰袁 酝葬蚤泽泽 耘援 圆园园圆援 阅藻贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣 枣燥怎则 葬责责造藻 增蚤则怎泽藻泽
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渊责任编辑摇 朱乾坤冤
圆猿员