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果 树 学 报 2008,25(5):703～707
JournalofFruitScience
葫芦科作物3种主要病毒的多重
RT-PCR方法的建立
赵 丽 1,2,古勤生 2*,陈红运 3,史团省 1,田延平 2,胡京昂 2
(1郑州大学生物工程系,郑州 450001;2中国农业科学院郑州果树研究所,郑州 450009;
3厦门出入境检验检疫局,厦门 361012)
摘 要:小西葫芦黄花叶病毒(Zucchiniyelowmosaicvirus,ZYMV)、西瓜花叶病毒(Watermelonmosaicvirus,WMV)
和黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)是危害葫芦科作物最严重、最广泛的 3种病毒。研究建立了以 18S
rRNA为内标检测 ZYMV、CMV和 WMV侵染葫芦科作物 3种主要病毒的多重 RT-PCR方法,并对影响多重 RT-
PCR扩增的退火温度、Taq聚合酶浓度、dNTPs浓度和镁离子浓度4种主要因素进行优化;对多重 RT-PCR的灵敏性
进行了测定,并与单重RT-PCR灵敏性进行比较。结果表明:最佳的退火温度、Taq聚合酶量、dNTPs浓度和Mg2+浓度
分别为60.7℃、1.0U、0.8mmol/L和2.5mmol/L。多重RT-PCR各病毒的灵敏度与单重RT-PCR相同。
关键词:西葫芦 (CucurbitamoschataDuch);病毒病;多重RT-PCR
中图分类号:S642.6 文献标识码:A 文章编号:1009-9980(2008)05-703-05
MultiplexRT-PCRassayforsimultaneousdetectionofthreevirusesof
Zucchini
ZHAOLi1,2,GUQin-sheng2*,CHENHong-yun3,SHITuan-sheng1,TIANYan-ping2,HUJing-ang2
(1BioengineeringDepartment,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan450001China;2ZhengzhouFruitResearchInstitute,CAAS,
Zhengzhou,Henan,450009China;3XiamenEntry-EixtInspectionandQuarantineBureau,Xiamen,Fujian361012China)
Abstract:Zucchiniyelowmosaicvirus(ZYMV),Watermelonmosaicvirus(WMV)andCucumbermosaicvirus(CMV)are
mostimportantpathogensinfectingcucurbitaceouscrops.Amultiplexreversetranscription-polymerasechainreaction
(mRT-PCR)wasdevelopedfordetectionofthreecucurbitaceousvriuses:ZYMV,WMVandCMVatthesametubewith18S
rRNAoftheplantasinternalcontrol.ThemainimpactfactorsofmRT-PCR:annealingtemperature(Tm),TaqDNAPoly-
merase,dNTPsandMg2+wereoptimized,andcomparedwithsensitivityofsingleRT-PCR(sRT-PCR).ThemRT-PCRfor
detectingthethreeviruses,theappropriateTm,TaqDNAPolymeraseconcentration,dNTPsconcentrationandMg2+concen-
trationwere60.7℃,1.0U,0.8mmol/Land2.5mmol/Lrespectively.TheresultsofthemultiplexRT-PCRwereconsistent
withsRT-PCRtodetecteachoftheviruses
Keywords:Zucchini(CucurbitamoschataDuch);Virusdisease;MultiplexRT-PCR
葫芦科植物约有118属825种,作为栽培作物
的有:西瓜、甜瓜、黄瓜、南瓜、丝瓜、冬瓜、瓠子、苦瓜
等。近30年来随着农业生产水平的提高和人们对高
品质瓜类蔬菜的追求,葫芦科作物栽培面积不断扩
大。该科作物病害的发生和危害程度也愈趋严重和
广泛[1],危害葫芦科作物的病毒多达 48种,包括 38
种确定种和9种暂定种和1种类病毒确定种[2],其中
发生最普遍危害最严重的病毒主要是3种:Zucchini
yelowmosaicvirus(ZYMV)、Watermelonmosaicvirus
(WMV)和Cucumbermosaicvirus(CMV)。目前,生物
学检测、电镜检测、血清学检测、RT-PCR检测和核
酸杂交检测都能用于检测侵染葫芦科作物的病毒,
但由于生物学检测法周期也长,电镜操作需要一定
技能,而且工作比较集中,所以样本数量大不易处
理,同时电子显微镜仪器昂贵,所以生物学方法和电
镜检测在葫芦科作物病毒检测中存在很大局限性。
尽管血清学方法得到了广泛应用[3-4],但商品化的抗
血清价格昂贵,一种抗血清只能检测一种病毒,而且
收稿日期:2007-10-15 接受日期:2008-05-29
基金项目:河南省科技攻关项目(082102150012)
作者简介:赵丽,女,在读硕士生。Tel:0371-65330956,E-mail:zl517320@126.com
?通讯作者。Authorforcorespondence.Tel:0371-65330997,E-mail:guqsh@126.com
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2008.05.018
果 树 学 报 25卷
病毒
Vrius
编号
CodeNo.
序列
Sequence
扩增长度
Productlengt(bp)
18SrRNA
WMV
CMV
ZYMV
5’端引物 5’pairsprimer
3’端引物 3’pairsprimer
5’端引物 5’pairsprimer
3’端引物 3’pairsprimer
5’端引物 5’pairsprimer
3’端引物 3’pairsprimer
5’端引物 5’pairsprimer
3’端引物3’pairsprimer
5’-GACAGTCGGGGGCATTCGTATTTC-3’
5’-GGTGGTGCCCTTCCGTCAATTCC-3’
5’-CGGGGGCCCTCGAATACAAGCCCAATC-3’
5’-CGGGGTACCGCGGCCTTCATCTGTGC-3’
5’-CCCGGATCCTCCGCGGATGCTAACTTT-3’
5’-TGTCGACTCAGACTGGGAGCACC-3’
5’-CCCGGATCCTCGGGCACTCAGCAAAC-3’
5’-CCCGTCGACTTACTGCATTGTATTCACAC-3’
294
458
580
841
表1 扩增病毒和内标片段的特异性引物
Table1TheprimerpairsforamplifyingsegmentsofZYMV,WMV,CMVand18SrRNA
还具有一定的假阳性反应等问题。sRT-PCR和核酸
杂交检测方法一个反应只能检测一种病毒,而病毒
多是复合侵染,所以用这两种方法检测要耗费较多
时间和试剂。近年来多重RT-PCR(mRT-PCR)已广
泛应用于植物病毒的检测[5-9];但至今为止,国内外还
未有用mRT-PCR方法同时检测西葫芦科作物上发
生最普遍危害最严重的 WMV、CMV和 ZYMV3种
病毒的报道,mRT-PCR一次反应可以检测多种病
毒,在复合感染病毒的检测中,具有节省时间、降低
成本、提高效率优点[1],所以亟需建立一种能同时检
测这3种病毒的mRT-PCR方法,在葫芦科作物栽
培生产中,能够即快速、准确又简便和经济的检测出
幼苗带毒情况,以便尽早采取有效防治措施,对控制
病害在田间的发生,减少经济损失,以及在抗病筛选
和病害流行预测具有十分重要的意义。
1 材料和方法
1.1 病毒分离物
ZYMV、WMV、CMV3种毒原由本实验室保存,
在玻璃温室采用西葫芦繁殖病毒。
1.2 试剂
TRIZOLReagent购自 Invitrogen生物公司;M-
MuLV反转录酶购自 Fermentas;dNTPs和 Ribonu-
cleaseInhibitor购自Takara生物有限公司;TaqDNA
聚合酶购自上海申能博彩生物技术有限公司。
1.3 总RNA的提取
在sRT-PCR中,分别称取0.1g感染病毒的叶
片置于处理的研钵中,加液氮研磨成粉末;在mRT-
PCR中,称取等量的分别侵染 3种病毒的西葫芦叶
片置于处理的研钵中,加液氮研成粉末;都用 TRI-
ZOLReagent提取总RNA,最后用30μLRNasefree
H20溶解总RNA。
1.4 引物的设计和合成
根据GenBank上登录的各病毒序列,用DNA-
MANVersion5.2.2和 DNAStar6.0软件设计各病毒
和18SrRNA的特异性引物,由北京三博远志生物
技术有限公司合成,见表1。
1.5 sRT-PCR
以ZYMV、WMV、CMV相对应的 3’端引物反转
录得到cDNA第1链,反应程序参照M-MLV说明
书,40μL反应体系如下:8μL总RNA,2μL病毒特
异性 3’引物(10μmol/L),18.5μLRNasefreeH2O,
70℃变性5min,迅速置冰上 5min;再加入 8μL5×
Reactionbufer,2μLdNTPs(2.5mmol/Leach),0.5
μLRNaseInhibitor(40U/μL),37℃温浴 5min;最后
加入 1μL反转录酶 (5U/μL),42℃1h,70℃10
min;置冰上待用。
PCR反应在扩增仪上进行。25μL反应体系:
10×PCRbufer2.5μL,1μLdNTPs(10mmol/L),特异
性引物各 1μL(10μmol/L),2μLRT产物,0.3μL
TaqDNA聚合酶(5U/μL)和 17.2μLddH2O;反应程
序:94℃3min,94℃30s,58℃50s,72℃1min,30
个循环,72℃10min。取5μLPCR产物在1.5%琼脂
糖凝胶上电泳,经凝胶成像系统进行观察分析。
1.6 mRT-PCR
mRT反应体系:加入混合提取的 3种病毒总
RNA15μL,同时将3种病毒3’端特异性引物和 18S
rRNA3’端特异性引物各2μL加入到同一RT反应
管中,其它条件与单重RT相同。
mPCR体系:25μL反应体系:10×PCRbufer
2.5μL(Mg2+free),3.0μLMgCl2 (25mmol/L),1μL
dNTPs(10mmol/L),将 0.3μL18SrRNA、0.15μL
WMV、0.1μLCMV和 1.0μLZYMV特异性引物(10
μmol/L)加入到同一个 PCR管中,2μLRT产物,0.3
μLTaqDNA聚合酶(5U/μL)和 11.6μLddH2O;反
应程序:94℃3min,94℃30s,60.7℃50s,72℃
1min,30个循环,72℃10min。取5μLPCR产物在
1.5%琼脂糖凝胶上电泳,经凝胶成像系统进行观察
分析。
1.7 mRT-PCR主要影响因素的优化
704
5期
2000
M 1 2 3 4 5 6N M 12 3 4 5 6 7 N
2000
在有效的mRT-PCR条件下,mRT条件不变,考
察mPCR主要影响因素,考察某一影响因素时,其它
因素不变。退火温度:设50.8、52.5、55.8、57.5、60.7、
62.0℃6种处理;TaqDNA聚合酶量:设 0.0、0.5、
1.0、1.5、2.5、3.5、4.5U7种处理;dNTPs浓度梯度:设
0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L7种处理;Mg2+
浓度梯度:设 0.0、0.5、1.0、1.5、2.5、3.5mmol/L6种
处理。
2 结果与分析
2.1 sRT-PCR
用分别提取的单一病毒 RNA,经反转录,对
各对引物进行退火温度梯度试验,在退火温度为
58℃时,用sRT-PCR同一PCR程序能同时扩出18S
rRNA(294bp)、WMV(458bp)、CMV(580bp)和ZYMV
(841bp)清晰的目的条带 (图未列出),从而确定
mRT-PCR退火温度58℃。
2.2 mRT-PCR特异性
将混合提取的总 RNA反转录的产物用于单重
扩增18SrRNA、WMV、CMV和ZYMV,结果能够扩
增出18SrRNA(294bp)、WMV(458bp)、CMV(580bp)
和 ZYMV(841bp)目的条带,与 sRT-PCR扩出的目
的条带一致,说明混合提取的3种病毒的RNA的一
次反转录的产物能够用于mPCR的扩增;用相同的
反转录产物进行mPCR反应,扩出的各目的条带与
sRT-PCR各条带大小相同,说明mRT-PCR方法能
够同时检测这3种病毒(图1)。
2.3 mRT-PCR主要影响因素的优化结果
退火温度的优化:结果显示,退火温度在 55.8～
62.0℃范围内,效果都比较好,本试验选择60.7℃为
最佳退火温度进行下面的试验(图2-A)。
TaqDNA聚合酶量梯度:结果显示,当TaqDNA
聚合酶为0.5U时就能清晰地扩出各条目的条带,随
着酶量的增加,没有很大的变化,本试验选择 1.0U
进行下面实验(图2-B)。
dNTPs浓度梯度:结果显示,当dNTPs浓度低于
0.6mmol/L时,不能扩出所有目的条带,而浓度为0.6、
0.8、1.0mmol/L能够扩出各条目的条带,0.8mmol/L
要比0.6mmol/L条带更清晰些,但1.0mmol/L与0.8
mmol/L相比没有变化,所以选择 0.8mmol/L作为最
佳dNTPs浓度(图2-C)。
Mg2+浓度梯度:结果显示,当Mg2+低于1.0mmol/L
时只能扩出部分条带,当达到1.0mmol/L后就能够
bp
1000
750
500
250
M 1 2 3 4 5 6 N
bp
1000
750
赵 丽等:葫芦科作物3种主要病毒的多重RT-PCR方法的建立 705
果 树 学 报 25卷
M 30 3-1 3-2 3-3 3-4 3-5 3-6 N M 30 3-1 3-2 3-3 3-4 3-5 3-6 N
扩出全部条带,并且随浓度增加ZYMV的目的条带
越来越亮,但当Mg2+浓度为3.5mmol/L时,各目的条
带的亮度反而变弱,所以选择最佳 Mg2+浓度为
2.5mmol/L(图2-D)。
2.4 mRT-PCR灵敏度
用提取的健康的植物总 RNA对混合提取的
病毒总RNA以30、3-1、3-2、3-3、3-4、3-5、3-6的倍数进行
稀释。结果显示,(图 3)在 sRT-PCR和 mRT-PCR
中 ZYMV、CMV和 WMV灵敏度分别都是 3-4、3-6和
3-6;表明,mRT-PCR与sRT-PCR一样能够准确的检
测出病毒。由于用健康叶子提取的总RNA来进行稀
释,稀释的只是病毒的RNA,而18SrRNA浓度未被
稀释,所以内标对照扩增的带的强度在整个稀释过
程中没有变化。
3 讨 论
本试验成功的建立了能够同时检测侵染葫芦科
作物的 3种主要病毒 ZYMV、CMV和 WMV的
mRT-PCR技术,与 sRT-PCR相比,mRT-PCR更省
时、经济高效。并以 18SrRNA作为内参照,内参照
的使用虽然增加了 mRT-PCR体系优化的难度,但
能够有效的避免假阴性现象,提高了检测结果的可
信度。Gambino等[10]和王冲等[11]运用18SrRNA作为
总RNA提取和mRT-PCR方法的内参照,而Hassan
等[12]和牛建新等[13]运用植物mRNA(如nad5)作为总
RNA提取和mRT-PCR方法的内参照,验证检测结
果的可靠性。作为内参对照,首先应该比较稳定,而
且在RNA中含量要高。mRNA的半衰期短,很容易
降解,所以要求所用的试验材料非常新鲜,否则就会
影响检测效果;而18SrRNA为核糖体RNA,在植物
体内含量丰富,并且其半衰期比mRNA要长的多。鉴
于这两点在本试验中选用18SrRNA作为内参照。
由于mRT-PCR要求在同一反应体系中进行多
个位点的特异性扩增,存在引物之间的竞争作用,因
而技术难度增大,一个理想的mRT-PCR反应体系,
并非sRT-PCR的简单混合,需要针对目标产物,进
行全面分析、反复试验,建立适宜的反应体系和反应
条件,所以本试验针对影响mRT-PCR反应的4种
主要因素进行了试验,对mRT-PCR反应条件进行
了优化,特别在Mg2+浓度的优化中发现,随着Mg2+浓
度增加目的条带越来越清晰,并且强度增加,但达到
一定值后反而减弱mRT-PCR的扩增效果。Mg2+影响
PCR的多个方面,如 DNA聚合酶的活性,这会影响
产量;dNTP和模板同镁离子结合,降低了酶活性所
需要的游离镁离子的量,所以PCR体系中要有足够
的游离Mg2+;在引物浓度的试验中(图未列出)发现,
扩增片段长的引物所需要的浓度要偏高一些,与丁
芳等[14]的结果一致。
在 mRT-PCR灵敏度检测结果表明:mRT-PCR
中各病毒的灵敏度与 sRT-PCR中各病毒的灵敏度
相同,这与 Gambino等[10]结果相同,说明 mRT-PCR
的检测效果与 sRT-PCR的检测效果一样。并且
mRT-PCR与sRT-PCR相比更省时、经济,更简便。
4 结 论
建立了能够同时检测侵染葫芦科作物的3种主
706
5期 赵 丽等:葫芦科作物3种主要病毒的多重RT-PCR方法的建立
要病毒ZYMV、CMV和WMV的mRT-PCR技术。此
技术在葫芦科作物复合感染病毒的检测中,具有节
省时间、降低成本、提高效率优点。因此,在葫芦科作
物栽培生产中,能够即快速、准确又简便和经济的检
测出幼苗带毒情况,以便尽早采取有效防治措施,对
控制病害在田间的发生、减少经济损失、抗病筛选和
病害流行预测具有十分重要的意义。
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