全 文 ：江苏农业学报( Jiangsu J． of Agr． Sci． ) ，2015，31( 4) : 756 ～ 763
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任春梅，程兆榜，杨 柳，等． 江苏省葫芦科作物 6种病毒的多重 ＲT-PCＲ方法及应用［J］．江苏农业学报，2015，31( 4) : 756-763．
doi: 10． 3969 / j． issn． 1000-4440． 2015． 04． 008
江苏省葫芦科作物 6 种病毒的多重 ＲT-PCＲ 方法及
应用
任春梅， 程兆榜， 杨 柳， 缪 倩， 周益军
( 江苏省农业科学院植物保护研究所，江苏 南京 210014)
收稿日期: 2015-02-04
基金项目:国家公益性行业科研专项( 201303028 ) ; 江苏省农业科技
自主创新基金项目［CX( 13) 3023］
作者简介:任春梅( 1981-) ，女，江苏大丰人，硕士，助理研究员，主要
从事植物病毒研究。
通讯作者:程兆榜，( E-mail) onlyone8501@ 126． com
摘要: 江苏省葫芦科作物上的病毒主要有小西葫芦黄花叶病毒( ZYMV) 、西瓜花叶病毒( WMV) 、黄瓜花叶病
毒( CMV) 、黄瓜绿斑驳花叶病毒( CGMMV) 、烟草花叶病毒( TMV) 和番木瓜环斑病毒( PＲSV) ，通常发生复合侵染。
基于 GenBank中这 6 种病毒的核苷酸序列保守区设计特异性引物，在单重 ＲT-PCＲ技术的基础上，通过对影响 2 种
多重 ＲT-PCＲ扩增的 DNA聚合酶浓度、dNTPs及镁离子浓度、退火温度、延伸时间、循环次数等因素进行优化，对检
测灵敏度进行测定，建立了 2 种 PCＲ反应同时检测葫芦科作物上 6 种病毒的多重 ＲT-PCＲ方法。结果显示: 2 种多
重 ＲT-PCＲ体系均能同时扩增出各自特异性片段，测序分析结果表明序列同源性在 97%以上; 优化的 2 种多重 ＲT-
PC体系检测灵敏度为总 ＲNA稀释102 ～ 103倍，应用于江苏省 210 份样品的检测结果与单重 ＲT-PCＲ一致，体现了
检测的可靠性;检测结果表明近年来江苏省葫芦科作物以种子传播的 ZYMV 和 CGMMV 侵染为主，病毒的复合侵
染率达 75. 24%。
关键词: 葫芦科作物; 病毒; 多重 ＲT-PCＲ
中图分类号: S436． 421． 1 文献标识码: A 文章编号: 1000-4440( 2015) 04-0756-08
Establishment and application of multiplex ＲT-PCＲ assays for simultane-
ous detection of six viruses on Cucurbit crops in Jiangsu province
ＲEN Chun-mei， CHENG Zhao-bang， YANG Liu， MIAO Qian， ZHOU Yi-jun
( Institute of Plant Protection，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014，China)
Abstract: Cucurbit crops are frequently co-infected by zucchini yellow mosaic virus ( ZYMV) ，watermelon mosaic
virus ( WMV) ，cucumber mosaic virus ( CMV) ，cucumber green mottle mosaic virus ( CGMMV) ，tobacco mosaic virus
( TMV) and papaya ringspot virus ( PＲSV) in Jiangsu province． Based on the ＲT-PCＲ for the detection of single virus，the
two multiplex ＲT-PCＲ ( mＲT-PCＲ) systems were established for simultaneous detection of the six viruses by using six sets
of specific primers designed on the basis of conserved sequences of the viruses in GenBank． The main factors suches con-
centrations of DNA polymerase，Mg2 + and dNTPs，PCＲ conditions of annealing temperature，extension time and amplifica-
tion cycles，sensitivity of the detection were examined and optimized． The results showed that expected fragments of the six
viruses were amplified in the two mＲT-PCＲ systems and the sequences shared above 97 percent similarities with those of
other relative viruses． The optimized mＲT-PCＲ could
detect diluted 100 to 1000 times． The results of the mＲT-
PCＲ were consistent with sＲT-PCＲ on detecting 210 sam-
ples of cucurbit crops in Jiangsu province which reflects
the reliability of the protocol． The results also revealed that
in recent years the seed transmission viruses ZYMV and
CGMMV were the dominant infectious viruses on cucurbit
657
crops in Jiangsu province，with the co-infection rate of 75． 24% ．
Key words: cucurbit crop; virus; multiplex ＲT-PCＲ
葫芦科作物是一种仅次于禾本科、豆科和茄科
作物的世界性重要经济作物，主要分布于热带和亚
热带［1-2］。与大田作物相比，该类作物类型多，品种
杂，单品种面积小。葫芦科作物病害中病毒病害的
发生最为严重，国际病毒分类委员会( ICTV) 发布的
侵染葫芦科作物的病毒达 38 个确定种和 9 个暂定
种［3］。不仅病毒种类繁杂，株系众多，而且不同病
毒同时侵害引起的复合侵染现象普遍，病害发生年
度间变化大，给防控和检测都带来很大难度［4］。
江苏省自种植结构调整发展高效农业以来，蔬
菜种植业发展迅速，目前复种面积已达1． 3 × 105
hm2以上( 含西瓜甜瓜) ，生产中病毒病是其主要病
害问题之一。江苏省葫芦科作物病毒病原种类主要
有西 瓜 花 叶 病 毒［5］ ( Watermelon mosaic virus，
WMV) 、小西葫芦黄花叶病毒［6］ ( Zucchini yellow
mosaic virus，ZYMV) 、黄瓜花叶病毒［7］( Cucumber
mosaic virus，CMV) 和黄瓜绿斑驳病毒［8］( Cucumber
green mottle mosaic virus，CGMMV ) ，烟草花叶病
毒［9］( Tobacco mosaic virus，TMV) 和番木瓜环斑病
毒［10］( Papaya ringspot virus，PＲSV) 偶有发生，在田
间常发生复合感染现象。针对这一具体情况，开发
简便、快捷、稳定、实用以及能够同时检测多个病毒
的技术用于生产上病毒病害发生动态的监测，对于
葫芦科作物病毒病防控至关重要。
多重 ＲT-PCＲ 检测技术最早由 Chamberian
等［11］于 1988 年提出，现已广泛应用于生命科学各
个领域，在植物病毒病的检测中也已成为一种重要
的检测手段［12-16］。与其他检测方法 ( 生物学、血清
学、电镜观察、单重 ＲT-PCＲ、核酸杂交等［17］) 相比，
多重 ＲT-PCＲ 检测技术具有诸多优点，它能在同一
个 PCＲ体系中同时扩增多个目的基因，省时，省力，
效率高，特别是节省昂贵的实验试剂和珍贵的实验
材料。由于葫芦科病毒病的病原多，感染情况复杂，
针对单一病毒的检测方法已远远不能满足检测工作
的需求，所以国内外已有一些此类病毒的多重 ＲT-
PCＲ检测报道。王威麟等［18］针对西瓜上普遍发生
的 ZYMV、WMV、TMV、SqMV 和 CMV 5 种病毒建立
了一步 ＲT-PCＲ 检测方法;赵丽等［19］建立了一种同
时检测葫芦科作物 3 种主要病毒 ZYMV、WMV 和
CMV的多重 ＲT-PCＲ 方法; Kwon 等［20］用 2 个多重
PCＲ系统检测侵染韩国葫芦科作物的 7 种病毒。根
据前人的研究结果，本试验针对江苏省葫芦科作物
病毒病发生的种类和特点，建立一种适用于江苏省
葫芦科作物病毒病检测的多重 ＲT-PCＲ 方法，并对
江苏省各地采集的样品进行检测应用，以期为江苏
省葫芦科作物病毒病害的发生动态进行长期有效的
监测，从而有针对性地采取防控措施。
1 材料与方法
1． 1 毒源和试剂
WMV、ZYMV、CMV、CGMMV、TMV 和 PＲSV 6
种病毒的分离物于 2012 － 2014 年从江苏省南京市、
盐城市盐都区、徐州市、洪泽县、淮安市等地发病的
甜瓜、西葫芦、西瓜、南瓜等上采集，通过 6 种病毒的
血清学诊断试剂盒( Agdia公司) 找到 6 种病毒单独
侵染的样品，并在西葫芦上接种繁殖，样品保存于
－ 70 ℃ 冰箱中。总 ＲNA 提取试剂 Trizol 购自
Invitrogen公司，Taq DNA 聚合酶、dNTP、BamHⅠ、
SalⅠ购自大连宝生物公司，反转录酶 M-MLV、ＲNA
酶抑制剂购自 Promega 公司，琼脂糖凝胶回收试剂
盒、大肠杆菌( E． coli DH5ɑ) 感受态细胞、pMD18-T
载体购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
1． 2 总 ＲNA提取
在单重 ＲT-PCＲ 中，分别称取各病毒单独侵染
叶片 0． 1 g; 在多重 ＲT-PCＲ 中，分别称取等量单独
侵染 6 种病毒的叶片，WMV、ZYMV、CMV 和 CGM-
MV 4 种叶片充分混合( 标记为 H4 ) ，TMV 和 PＲSV
2 种叶片充分混合( 标记为 H2) ，H4、H2 各取 0. 1 g。
单重和多重 ＲT-PCＲ 中，都以健康西葫芦叶片为阴
性对照( 标记为 CK) ，也取 0. 1 g。叶片在冰浴条件
下迅速彻底研磨，然后用 Trizol 试剂盒按产品说明
书提取总 ＲNA。
1． 3 引物设计与合成
根据 GenBank 上登录的各病毒相对保守基因
的序列，应用 Primer Premier 5． 0 软件设计各病毒特
异性引物。引物设计完成后，通过 NCBI 对其特异
性进行鉴定，结果表明均具有良好的特异性( 表 1) 。
引物由上海英俊生物技术公司合成。
757任春梅等:江苏省葫芦科作物 6 种病毒的多重 ＲT-PCＲ方法及应用
表 1 多重 ＲT-PCＲ扩增 6 种病毒的特异性引物
Table 1 Specific primers for multiple ＲT-PCＲ detection of 6 viruses
引物 序列 ( 5→3) 扩增长度( bp) 退火温度( ℃ )
WMV-F CCAGTGGCAAAGGTGATA 485 51． 0
WMV-Ｒ TGCTGCGTCTGAGAAATG 54． 2
ZYMV-F AGCTCCATCATAGCTGAGCAG 1 200 52． 1
ZYMV-Ｒ TAGCTTGCGCTTGCAAACGAC 55． 2
CMV-F CACTATTCCCGACTTTGAGACCC 389 55． 0
CMV-Ｒ CTCATAAGCGGCATACTCTAACAT 53． 5
CGMMV-F CCACGAGTTGTTTCCTAATGCTG 660 53． 3
CGMMV-Ｒ TTTGCTAGGCGTGATCGGATTGT 55． 0
TMV-F TGGATCCGCCGACCCAATAGAGTTA 410 55． 5
TMV-Ｒ GTCGAGGTCCAAACTAAACCAGAAG 56． 5
PＲSV-F ATGAGGCTGTGGATGCTGGTTTA 325 54． 0
PＲSV-Ｒ GATTGAGTGGCACGAGTATTAGA 56． 0
1． 4 单重 ＲT-PCＲ
以 WMV、ZYMV、CMV、CGMMV、TMV和 PＲSV
单一病毒的 ＲNA为模版，oligodT18 引物［21］反转录
得到 cDNA 第一链，反应程序参照 M-MLV 说明
书，15. 0 μl 反应体系为: 3. 0 μl ＲNA，1. 0 μl oli-
godT18 ( 10 μmol /L) ，6. 0 μl DEPC-ddH2O，65 ℃
变性 5 min，迅速置冰上 5 min; 再加入 2. 5 μl 5 ×
ＲT buffer，0. 5 μl dNTP ( 各 2. 5 mmol /L) ，0. 5 μl
ＲNase Inhibitor ( 40 U /μl) 和 0. 5 μl M-MLV 反转
录酶( 200 U /μl) ，短暂离心后 DEPC-ddH2O 补足
至 15. 0 μl，42 ℃水浴 1 h，70 ℃灭活 5 min，置冰
上待用。
25. 00 μl PCＲ 标准反应体系: 15. 75 μl ddH2O，
2. 50 μl 10 × PCＲ buffer( Mg2 + free) ，1. 50 μl MgCl2
( 25 mmol /L ) ，2. 00 μl dNTP Mixture ( 各 2. 5
mmol /L) ，1. 00 μl 上游和下游引物混合物 ( 各 10
μmol /L) ，0. 25 μl r-Taq DNA 聚合酶 ( 5 U /μl ) 和
2. 00 μl cDNA 模板。PCＲ 反应程序: 94 ℃预变性 5
min; 94 ℃变性 50 s，53 ℃退火 50 s，72 ℃延伸 1
min，循环 35 次; 72 ℃延伸 10 min。取 5 μl PCＲ 产
物经 2%琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像系统进行
观察分析。
1． 5 多重 ＲT-PCＲ及体系优化
多重 ＲT-PCＲ 分 4 重和 2 重 2 个反应。4 重和
2 重 ＲT反应体系:加入混合提取的 4 种和 2 种病毒
的总 ＲNA( H4 和 H2) 各 3. 0 μl，同时将 1. 0 μl oli-
godT18 的反转录引物加入同一反应管中，其他条件
与单重 ＲT相同。多重 PCＲ 体系在上述 25. 0 μl 单
重 PCＲ标准反应体系基础上，4 重 PCＲ的 4 对引物
混合物为 4. 00 μl ［WMV 和 CMV 上下游引物各
0. 60 μl，ZYMV 和 CGMMV 上下游引物各 0. 40 μl
( 各 10 μmol /L) ］，2 重 PCＲ 的 2 对引物混合物为
2. 00 μl［TMV和 PＲSV上下游引物各 0. 5 μl( 各 10
μmol /L) ］，PCＲ 反应程序参数同上。取 5 μl PCＲ
产物进行 2%琼脂糖凝胶电泳。
在有效 mＲT-PCＲ条件下，考察影响 mPCＲ的主
要因素，对某一因素进行考察时，其他因素不变。在
试验过程中对 Taq DNA 聚合酶浓度分别设 0. 02
U /μl、0. 04 U /μl、0. 06 U /μl、0. 08 U /μl、0. 10 U /μl
和 0. 12 U /μl 6 个处理，Mg2 + 浓度分别设 1. 0
mmol /L、2. 0 mmol /L、3. 0 mmol /L、4. 0 mmol /L、5. 0
mmol /L和 6. 0 mmol /L 6 个处理，dNTPs浓度分别设
0. 10 mmol /L、0. 25 mmol /L、0. 40 mmol /L、0. 55
mmol /L、0. 70 mmol /L和 0. 85 mmol /L 6 个处理，退
火温度分别设 48 ℃、51 ℃、53 ℃、56 ℃、58 ℃和 60
℃，延伸时间分别设 50 s、60 s、70 s、80 s、90 s和 100
s，循环次数设 20、25、30、35、40 和 45，进行多重 ＲT-
PCＲ体系优化。
857 江 苏 农 业 学 报 2015 年 第 31 卷 第 4 期
1． 6 多重 ＲT-PCＲ产物的克隆和测序
多重 ＲT-PCＲ 扩增 DNA 靶片段采用 Axygen 柱
式胶回收试剂盒( 上海生工生物工程技术服务有限
公司) 回收，回收 DNA 溶于 30 μl 的溶解液中。回
收产物与 pMD18-T 载体连接 ( 参照 pMD18-T 试剂
盒说明书) 。连接产物转化大肠杆菌 DH5ɑ 感受态
细胞，碱裂解法提取质粒，经 PCＲ 及酶切鉴定筛选
重组质粒。每个分离物挑选 2 个阳性克隆进行测
序，测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完
成。
1． 7 多重 ＲT-PCＲ的灵敏度测定
取混合样品 H4 和 H2 提取的病毒总 ＲNA 各 5
μl，用 BioPhotometer plus核酸蛋白检测仪测定 OD260
和 OD280，计算各自总 ＲNA浓度。分别以 10
0、10 －1、
10 －2、10 －3、10 －4和 10 －5的倍数进行稀释，用建立的
4 重和 2 重 ＲT-PCＲ方法进行检测，观察结果，分析
2 种多重 ＲT-PCＲ方法检测的灵敏度。
1． 8 多重 ＲT-PCＲ的检测应用
应用建立的 2 种多重 ＲT-PCＲ 方法对 2014 年
采自江苏省 13 个市县的 210 份葫芦科作物发病样
品进行检测，并随机挑选 15 个样品用单重 ＲT-PCＲ
方法进行验证，分析江苏省葫芦科作物病毒病的种
类及分布状况。
2 结果与分析
2． 1 多重 ＲT-PCＲ的特异性
用单重、4 重和 2 重 ＲT-PCＲ 法分别从 6 种病
毒单独侵染、4 种病毒混合侵染( H4 ) 、2 种病毒混
合侵染( H2 ) 的组织中扩增出单一、4 条或 2 条特
异性目标条带，大小约为 390 bp、480 bp、670 bp、
1 200 bp、330 bp 和 400 bp，扩增条带的大小与待
检 6 种病毒基因预期条带大小基本一致; 阴性对
照没有扩增出任何条带，且均未出现非特异性条
带( 图 1 ) 。结果表明: 4 重和 2 重 ＲT-PCＲ 具有较
高的特异性，在 4 重 ＲT-PCＲ 中检测到 CMV、
WMV、CGMMV 和 ZYMV，在 2 重 ＲT-PCＲ 中检测
到 TMV和 PＲSV，且两步反应中的各条带大小间
有差异，可以明显地进行区分。
2． 2 多重 ＲT-PCＲ主要影响因素的优化
2． 2． 1 多重 ＲT-PCＲ 反应体系的优化 为了摸索
出既高效又经济的多重 ＲT-PCＲ扩增体系，在保证 2
个反应体系中都有足够量的 r-Taq DNA 聚合酶和
M: 100 bp Marker; 1: 阴性对照; 2 ～ 5: 单重 ＲT-PCＲ 分别单独扩
增 CMV、WMV、CGMMV 和 ZYMV; 6: 多重 ＲT-PCＲ 扩增 CMV、
WMV、CGMMV和 ZYMV 4 种病毒混合样; 7、8: 单重 ＲT-PCＲ 分
别单独扩增 TMV和 PＲSV; 9:多重 ＲT-PCＲ扩增 TMV和 PＲSV 2
种病毒混合样。
图 1 多重 ＲT-PCＲ的特异性
Fig． 1 Specificity of multiple ＲT-PCＲ
dNTPs的基础上，设置 dNTPs、r-Taq DNA 聚合酶、
Mg2 +的浓度梯度。结果( 图 2 ) 表明: 当 dNTPs 浓度
在 0． 25 ～ 0. 85 mmol /L时，4 重和 2 重 PCＲ 都能产
生较好的条带; 当 r-Taq DNA 聚合酶浓度为 0． 10 ～
0. 12 U /μl时，4 重 PCＲ 能扩增出 4 条带，2 重 PCＲ
能扩增出 2 条带，浓度越高条带越亮; 当 Mg2 +浓度
达到 3. 0 mmol /L时，4 重和 2 重 PCＲ都能分别较好
地扩增出 4 条和 2 条特异性条带，随浓度增加条带
变亮，但 4 重 PCＲ中浓度增加到一定值后反而减弱
了 mＲT-PCＲ的扩增效果。因此优化后的 4 重和 2
重反应体系各参数最终都确定为: dNTPs 浓度 0. 25
mmol /L，r-Taq DNA 聚合酶浓度为 0. 10 U /μl，Mg2 +
浓度 3. 0 mmol /L。
2 ． 2 ． 2 多重 ＲT-PCＲ 反应条件的优化 对 4 重
和 2 重 PCＲ 的退火温度、循环次数和延伸时间都
进行了优化。结果( 图 3 ) 显示，4 重 PCＲ 的退火
温度从 53 ℃到 58 ℃都能获得理想的条带，但 61
℃时扩增效果变弱 ; 循环数在 30 ～ 40 次时扩增
的条带都较清晰，延伸时间 80 s 时 PCＲ 条带的
亮度最为合适。2 重 PCＲ 的退火温度从 53 ℃到
61 ℃时条带都较为清晰 ; 循环数 25 ～ 35 次时均
能获得特异而清晰的目的条带 ; 延伸时间从 50 s
到 80 s均能同时出现 2 条带，但在 60s 时条带最
清晰。因此最终确定多重 ＲT-PCＲ 反应的条件
为 : 4 重 PCＲ 的退火温度为 53 ℃，循环次数 35
次，延伸时间 80 s; 2 重 PCＲ 的退火温度为 56
℃，循环次数 30 次，延伸时间 60 s。
957任春梅等:江苏省葫芦科作物 6 种病毒的多重 ＲT-PCＲ方法及应用
A、B、C: 4 重 ＲT-PCＲ; D、E、F: 2 重 ＲT-PCＲ。M: 100 bp Marker; 1、8、15: 阴性对照; 2 ～ 7: 不同 dNTPs 浓度，依次为 0． 10 mmol /L、0． 25
mmol /L、0． 40 mmol /L、0． 55 mmol /L、0． 70 mmol /L、0． 85 mmol /L; 9 ～ 14: 不同 r-Taq DNA 聚合酶量，依次为 0． 02 U /μl、0． 04 U /μl、0． 06
U /μl、0． 08 U /μl、0． 10 U /μl、0． 12 U /μl; 16 ～ 21:不同 Mg2 +浓度，依次为 1． 0 mmol /L、2． 0 mmol /L、3． 0 mmol /L、4． 0 mmol /L、5． 0 mmol /L、6．
0 mmol /L。
图 2 多重 ＲT-PCＲ反应体系的优化
Fig． 2 Optimization for the reaction conditions of mＲT-PCＲ
A、B、C: 4 重 ＲT-PCＲ; D、E、F: 2 重 ＲT-PCＲ。M: 100 bp Marker; 1、8、15:阴性对照; 2 ～ 7:不同退火温度，依次为 48 ℃、51 ℃、53 ℃、56 ℃、58
℃、61 ℃ ; 9 ～ 14:不同循环次数，依次为 20、25、30、35、40、45; 16 ～ 21:不同延伸时间，依次为 50 s、60 s、70 s、80 s、90 s、100 s。
图 3 多重 ＲT-PCＲ反应条件参数的优化
Fig． 3 Optimization for the reaction conditions of mＲT-PCＲ
2． 3 多重 ＲT-PCＲ产物的序列分析
4 重和 2 重 ＲT-PCＲ 扩增产物经割胶回收，分
别与 pMD 18-T vector 进行体外连接，挑取阳性克
隆，提取质粒测序。测序结果表明，ZYMV、WMV、
CMV、CGMMV、TMV和 PＲSV 的扩增产物序列分别
由 1 180、485、389、660、410 和 325 个核苷酸组成，与
设计的 PCＲ 产物大小相同，分别为 ZYMV-cp 基因、
WMV-cp 基因、CMV-复制酶基因、CGMMV-cp 基因、
TMV-cp 基因和 PＲSV-cp 基因的部分序列。序列同
源性分析结果表明，所得序列与 GenBank 中参考序
列的同源性分别达到 98. 25% 、99. 01%、99. 93%、
98. 22%、97. 33%和 99. 32%，证明了 2 种多重 ＲT-
PCＲ检测结果的可靠性。
2． 4 多重 ＲT-PCＲ的灵敏度
经核酸蛋白检测仪测定 H4 和 H2 的 ＲNA 浓
度分别为 35. 60 μg /μl和 19. 33 μg /μl。灵敏度检
测结果( 图 4 ) 显示，4 重 ＲT-PCＲ中 ＲNA稀释倍数
为 10 － 2后有些病毒的条带微弱或消失，这可能与
组织中病毒含量的过低有关，所以能够同时检测
到 4 条清晰条带的最大稀释倍数为 10 － 2，也即该
体系中 4 重 ＲT-PCＲ 的 ＲNA 检测浓度为 0. 356
μg /μl; 2 重 ＲT-PCＲ中 ＲNA稀释倍数为 10 － 3时能
够同时检测到 2 条清晰的条带，所以该体系中 2 重
ＲT-PCＲ的 ＲNA检测浓度为 19. 33 ng /μl。
067 江 苏 农 业 学 报 2015 年 第 31 卷 第 4 期
A: 4 重 PCＲ; B: 2 重 PCＲ。M: 100 bp Marker; N:阴性对照。
图 4 2 个多重 ＲT-PCＲ的灵敏度
Fig． 4 The sensitivities of two mＲT-PCＲ techniques
2． 5 多重 ＲT-PCＲ的检测应用
应用建立的 2 种多重 ＲT-PCＲ方法对采自江苏
省 13 个市县 210 份葫芦科作物病样进行检测。首
先随机选出 15 个病样分别进行单重 ＲT-PCＲ检测，
再进行 2 种多重 ＲT-PCＲ检测( 图 5) 。将检测图谱
进行比较，结果显示各样品多重 ＲT-PCＲ 检测结果
与单重 ＲT-PCＲ 结果相一致，说明建立的 2 种多重
ＲT-PCＲ方法可应用于田间样品的检测。田间样品
检测结果( 表 2 ) 表明，210 份检测样品中单独侵染
率仅为 24. 76%，复合侵染率达 75. 24%，其中有 3
个病样为 6 种病毒的复合侵染。进一步分析发现江
苏省 13 个市县葫芦科作物病毒的种类以 ZYMV 和
CGMMV为主，主要分布在西瓜、南瓜、葫芦、甜瓜等
作物上，WMV 和 CMV 次之，主要分布在黄瓜、甜
瓜、南瓜等作物上，TMV 和 PＲSV 只在极少数作物
上检测到，主要在丝瓜、南瓜等上。6 种病毒没有明
显的地域分布倾向，究其原因可能与这几种病毒的
传播途径有关。
表 2 田间 210 份葫芦科作物病样多重 ＲT-PCＲ检测结果
Table 2 Detection results of 210 naturally infected samples collected from fields by multiplex ＲT-PCＲ
采集地点 样品数
阳性样品数
6 种病毒 5 种病毒 4 种病毒 3 种病毒 2 种病毒 1 种病毒
江苏南京 33 0 2 7 10 9 5
江苏宿迁 20 1 1 3 6 2 7
江苏徐州 15 0 1 2 5 3 4
江苏泰州 18 0 1 3 5 8 1
江苏盐都 10 0 0 1 2 3 4
江苏洪泽 17 0 2 1 5 6 3
江苏高邮 15 0 0 2 3 5 5
江苏兴化 10 0 0 1 2 4 3
江苏常州 10 0 1 2 2 1 4
江苏金坛 10 0 0 1 4 2 3
江苏姜堰 20 2 2 4 6 3 3
江苏东台 20 0 1 4 3 7 5
江苏东海 12 0 1 1 3 2 5
共计 210 3 12 32 56 55 52
167任春梅等:江苏省葫芦科作物 6 种病毒的多重 ＲT-PCＲ方法及应用
A: 4 重 ＲT-PCＲ; B: 2 重 ＲT-PCＲ。M: 100 bp Marker; 1:阴性对照; 2 ～ 16: 田间采集的葫芦科作物部分病样。
图 5 多重 ＲT-PCＲ的检测应用
Fig． 5 The detection of six viruses in Cucurbit crops by mＲT-PCＲ
3 讨 论
江苏省是农业大省，近年来设施农业迅猛发展，
据统计近几年江苏省葫芦科作物的种植面积每年稳
定在400 000 hm2左右，其中西瓜和甜瓜种植面积约
130 000 hm2，已经成为江苏省农业的支柱产业之
一。设施农业的发展，使病毒及其传毒蚜虫在棚内
顺利越冬后，在早春即散布于棚外并大量复制和繁
殖，从而导致病害的提前发生和生长季节早期病毒
累积量的偏高，形成恶性循环。以上因素加大了病
毒病的发生频率，提高了流行风险，从而加重了病
害。根据前期我们对江苏省设施大棚中葫芦科作物
病毒病的调查，发现 4 种主要病毒 ( ZYMV、WMV、
CMV、CGMMV) 对葫芦科作物种植业造成的危害日
趋严重，2 种次要病毒( TMV 和 PＲSV) 的危害也不
容忽视。本研究根据江苏省葫芦科作物生产上病毒
病的发生情况，建立了能同时检测这 6 种病毒的多
重 ＲT-PCＲ方法，在葫芦科作物的栽培生产中，能够
既快速、准确，又简便、经济地检测出幼苗带毒情况。
对控制病害在田间的发生，减少经济损失，抗病筛选
和病害流行预测具有十分重要的意义。
考虑到 6 种病毒的特点和数量，将其检测分成
2 个 ＲT-PCＲ反应进行，一个 PCＲ反应中同时检测 4
种主要病毒( WMV、ZYMV、CMV、CGMMV) ，另一个
ＲT-PCＲ反应中同时检测 2 种次要病毒 ( TMV 和
PＲSV) 。该方法的关键因素为特异性引物的选择，
首先使用 DNAMAN5． 0 软件，对 GenBank 中收录的
WMV、ZYMV、CMV、CGMMV、TMV 和 PＲSV 病毒各
株系、各区域分离物全基因组序列进行比对，确定病
毒序列中相对保守区域，在选定的保守区域内使用
Oligo5． 0 软件设计引物，再通过 BLAST 分析确保引
物的特异性，还利用 DNAStar 5． 0 对这 6 对引物进
行了同源性、二级结构分析，以避免 2 个多重 ＲT-
PCＲ反应引物之间形成复杂的二级结构及引物二
聚体而影响扩增效果，最终选择了 G + C 含量为
45% ～60%、退火温度相近、扩增片段大小易区分的
6 对引物。在反转录中选择了 OligodT18 作为其引
物，此引物较为适合植物样品 ＲNA 的反转录，能够
较为完整地保留 cDNA基础含量，特异性较高，而且
只需一次反转录，大大节省了时间和实验材料。在
2 个 ＲT-PCＲ反应中又整合优化了各自体系所需的
引物、Mg2 +、DNA 聚合酶、dNTPs 浓度，以及退火温
度、延伸温度和循环数，对各自 PCＲ 体系的灵敏度
进行了测定，最终建立了 6 种病毒多重 ＲT-PCＲ 的
方法。用此方法对江苏的 210 份葫芦科作物病样进
行检测，结果显示多重 ＲT-PCＲ 和单重 ＲT-PCＲ 检
测结果相当，充分说明了多重 ＲT-PCＲ 方法的实用
性。跟踪监测 2014 年江苏省设施大棚中葫芦科作
物的病毒种类，发现主要以种子传播的 CGMMV 和
ZYMV病毒为主，提示我们此病害的控制应从源头
出发，对种子和幼苗进行早期检测和处理，也体现了
快捷、高效、低成本检测方法研制的必要性。
本研究根据江苏省生产上葫芦科作物易受多种
病毒复合侵染的特点，选择性地对这些病毒进行了
2 种多重 ＲT-PCＲ筛选鉴定，较之单一 ＲT-PCＲ方法
具有能节省时间、降低成本、提高效率等优点。以往
报道的 5 重及以上 ＲT-PCＲ方法［12-16］在实际应用过
程中存在干扰因素多、灵敏度低和检出率低等缺陷，
本方法能够减少污染和反应中的影响因素，提高检
测灵敏度，大大降低漏检几率。在葫芦科作物的生
267 江 苏 农 业 学 报 2015 年 第 31 卷 第 4 期
产上，本方法可实现对病毒病的早期诊断，实现实验
室内对病毒病害种类的快速、高效、低成本、大批量
检测，对病害的流行预测预报具有十分重要的意义。
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( 责任编辑:张震林)
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