全 文 ：第 50 卷 第 3 期
2 0 1 4 年 3 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 50，No. 3
Mar．，2 0 1 4
doi:10．11707 / j．1001-7488．20140305
收稿日期: 2013 － 11 － 12; 修回日期: 2013 － 11 － 22。
基金项目: 国家高技术研究发展计划(863 计划)课题(2011AA100201)。
* 苏晓华为通讯作者。
欧美杨锌指蛋白转录因子基因(ZxZF)
的遗传转化及抗旱性初步分析*
张伟溪1 刘浡洋2 丁昌俊1 张冰玉1 黄秦军1 褚延广1 苏晓华1
(1． 林木遗传育种国家重点实验室 国家林业局林木培育重点实验室 中国林业科学研究院林业研究所 北京 100091;
2． 北京林业大学 北京 100083)
摘 要: C2H2 型锌指蛋白转录因子在激活胁迫相关基因、增强植物抗逆性方面具有重要的作用。以来自极端
抗逆木本植物霸王 C2H2 型锌指蛋白转录因子基因(ZxZF)为外源基因，利用农杆菌介导法对欧美杨‘渤丰 1 号’进
行遗传转化。经卡那霉素筛选获得 80 株抗性植株，通过 PCR 检测获得 17 株呈阳性植株，Southern 印记杂交检测证
实外源基因以单拷贝方式整合到 5 个转基因株系体内，RT-PCR 及 qRT-PCR 分子检测表明，外源基因在 4 个转基因
株系中成功表达。PEG 模拟干旱胁迫试验结果初步表明，转基因株系叶片相对含水量和脯氨酸含量均显著高于非
转基因植株 10%以上，转基因株系抗旱性得到一定程度提高。研究表明 ZxZF 转录因子基因对提高转基因杨树抗
旱能力具有重要作用，在培育抗旱林木优良品种中具有重要育种价值。
关键词: 欧美杨; 锌指蛋白基因; 遗传转化; 抗旱性
中图分类号: S718. 46; S722. 3 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2014)03 － 0031 － 07
Transformation of Zinc Finger Protein Transcription Factor Gene (ZxZF) and
Preliminary Evaluation of Drought Tolerance in Populus × euramericana
Zhang Weixi1 Liu Boyang2 Ding Changjun1 Zhang Bingyu1 Huang Qinjun1 Chu Yanguang1 Su Xiaohua1
(1 ． State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation of State Forestry Administration
Research Institute of Forestry，Chinese Academy of Forestry Beijing 100091; 2 ． Beijing Forestry University Beijing 100083)
Abstract: The C2H2 zinc finger protein transcription factor plays an important role in the activation of stress-related
genes，and increase in plant resistance． In this study，an C2H2 zinc finger protein transcription factor (ZxZF) from shrub
Sarcozygium xanthoxylon with strong drought tolerance was used as exogenous gene，and the Agrobacterium-mediated
method was applied for transgenic transformation to an elite hybrid clone of Populus × euramericana cl．‘Bofeng1’． A
total 80 resistant plants were gained via strict selection by kanamycin． Among them 17 positive transgenic plants were
verified by PCR analysis，and five transgenic plants were finally confirmed with one copy of the exogenous gene by
Southern blot analysis． Four of these clones were verified over-expression of ZxZF by RT-PCR and qRT-PCR analysis．
Under the drought stress conditions，transgenic clones showed more than 10% significantly higher of relative water content
(RWC) and accumulation of proline content，compared with non-transgenic control plants． These results showed an
improved tolerance to drought stress in transgenic poplar． Our study suggested that ZxZF transcription factor played a
crucial role in transgene poplar response to drought stress and was useful in developing trees with enhanced tolerance to
drought．
Key words: Populus × euramericana; zinc-finger protein gene; genetic transformation; drought resistance
我国干旱、半干旱地区约占国土总面积的 1 /2，
再加上林木基因资源和木本植物自身生物学特性的
限制，能够用于困难地造林的林木品种十分缺乏，严
重限制了当地的生态建设及经济建设的发展。因
此，培育林木抗逆新品种已成林木良种选育的重要
趋势。杨树(Populus)生长快、适应性强、木材用途
林 业 科 学 50 卷
广，在水土保持和维护生态环境方面发挥着重要作
用，是我国绿化、造林和工业用材的重要树种，但现
有大多数杨树品种抗旱性较差，难以在干旱地区发
挥其高产潜力。相对于常规育种途径，基因工程育
种不仅可以缩短育种周期，又可在基因水平上改造
林木抗性遗传物质，提高了育种的目的性和可操作
性，是加速林木改良的一个重要途径 (苏晓华等，
2003)。有关转抗逆基因杨树方面的研究已有一些
报道，例如，转抗旱基因 ( SacB)杨树 (张冰玉等，
2005; 李义良等，2007)、转耐盐基因 ( JERF 基因
等)杨树(Li et al．，2009)及转耐寒基因(PtFAD3)杨
树(Zhu et al．，2013; Zou et al．，2008)等，并在一定
程度上提高了杨树的抗旱、耐盐及耐寒性。
转录因子( transcription factor，TF)在抗逆基因表
达调控中起着重要的作用。锌指蛋白 ( zinc finger
protein)是真核生物基因组中最丰富的一类转录因
子，参与调控一些重要的生理过程，如花的发育、光形
态建成以及对胁迫的响应等方面(Takatsuji，1998)。
在农作物及拟南芥上众多研究表明，一些锌指蛋白的
过表达可以提高植物的耐非生物胁迫能力，如对拟南
芥(Arabidopsis thaliana)锌指蛋白基因 STZ(Sakamoto
et al．，2000; 2004)、ZAT7(Mittler et al．，2006)、ZAT12
(Davletova et al．，2005; Vogel et al．，2005)及 ThZF1
(Xu et al．，2007)等研究表明，这些基因的过表达可明
显提高转基因植株对干旱、高盐或低温等非生物胁迫
抗性。Kim 等(2001)把大豆(Glycine max)锌指蛋白
基 因 SCOF-1 转 入 拟 南 芥 和 烟 草 ( Nicotiana
tabacum)，使转基因植株的抗寒能力显著增强; 转锌
指蛋白基因 ZPT2-3 矮牵牛(Petunia hybrida)的抗旱
能力得到增强 ( Sugano et al．，2003); 水稻 (Oryza
sativa)锌指蛋白 OSISAP1 的过表达可以增强转基因
烟草对高盐、干旱及低温的抵抗能力(Mukhopadhyay
et al．，2004)。在木本植物研究中目前虽有锌指蛋白
转录因子相关报道，但多数集中在基因克隆和表达阶
段，如胡杨(Populus euphratica)(王俊英等，2005)、刚
毛柽柳 (Tamarix hispida) (An et al．，2011)、橡胶树
(Hevea brasiliensis ) (朱家 红 等，2006 ) 及 麻 疯 树
(Jatropha curcas)(严安心等，2012)。对抗逆木本植
物新品系培育而言，利用木本植物自身的基因进行遗
传转化，比外源基因具有更高的安全性和遗传稳定
性。因此，抗逆木本植物的优良抗逆基因资源还有待
于 进 一 步 开 发 与 利 用。霸 王 ( Sarcozygium
xanthoxylon)，蒺藜科(Zygophyllaceae)，是一种强旱生
小灌木，是我国西北和蒙古荒漠草原上的主要植被之
一(中国科学院中国植物志编辑委员会，1998)。本
研究利用农杆菌(Agrobacterium tumefacien)介导法将
受诱导型启动子驱动的源于霸王转录因子基因———
锌指蛋白基因 ( ZxZF) 转入欧美杨‘渤丰 1 号’
(Populus × euramericana cl． ‘Bofeng1’)中，获得转
基因欧美杨植株，并对其进行抗旱性研究，以期筛选
出抗旱转基因欧美杨株系，为我国干旱、半干旱地区
培育杨树优良新品种奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
‘渤丰 1 号’属聚合型杂种欧美杨，母本为美洲
黑杨种内聚合杂种 65 号杨 ( Populus deltoides cl．
‘55 /65’ × P． deltoides cl． ‘2KEN8’)，父本为欧洲
黑杨种内聚合杂种 ( P． nigra ‘Brummen’ × P．
nigra‘Piccarolo’)。它由中国林业科学研究院林业
研究所培育，并于 2008 年获得国家林业局植物新品
种保护权，于 2011 年被国家林业局林木品种审定委
员会审定为林木良种。将‘渤丰 1 号’在中国林业
科学研究院科研温室进行扦插繁殖，取其健康幼嫩
叶片进行农杆菌侵染。
1. 2 外源基因植物表达载体质粒及农杆菌
锌指蛋白转录因子基因 ZxZF 是从我国西部极
端抗旱木本植物霸王中克隆分离出的具有自主知识
产权转录因子(专利号: ZL 200610090934. 4)，属于
锌指蛋白 C2H2 亚类。植物表达载体质粒 pBZxZF
(由本实验室构建并保存，见图 1)应用液氮冻融法
转化农杆菌 GV3101，获得转基因供体农杆菌。
图 1 植物表达载体 pBZxZF 的结构示意
Fig． 1 The structural drawing of ZxZF in expression vector
1. 3 欧美杨‘渤丰 1 号’再生体系及卡那霉素选
择压
用本实验室前期建立的高效再生体系及卡那霉
素选择压 (崔旭东等，2012 )。叶片再生培养基:
MS + 6-BA 0. 4 mg·L － 1 + NAA0. 04 mg·L － 1; 不定芽
生根培养基: 1 /2MS + IBA0. 05 mg·L － 1 + NAA
0. 02 mg·L － 1。叶片分化卡那霉素 ( Km)选择压为
30 mg·L － 1; 不定芽生根 Km 选择压为20 mg·L － 1。
1. 4 遗传转化与转基因植株获得
将消毒好的无菌叶片切成 1 cm × 1 cm 的叶盘，
23
第 3 期 张伟溪等: 欧美杨锌指蛋白转录因子基因(ZxZF)的遗传转化及抗旱性初步分析
放入叶片诱导培养基中，预培养 3 ～ 6 天; 同时制备
农杆菌侵染液，使其 OD600 = 1. 0 ～ 1. 5，取出预培养
叶盘浸入转化菌液中，轻微震荡，侵染 5 ～ 15 min;
取出叶盘，在无菌滤纸上吸干，接种到叶片再生培养
基上，27 ℃、黑暗条件下共培养 2 ～ 3 天。将共培养
后的叶盘用含有 300 mg·L － 1头孢霉素(Cef)的无菌
水冲洗后，在无菌滤纸上吸干，转移到附加 Cef 300
mg·L － 1的筛选分化培养基上筛选，每 20 天左右更
换 1 次培养基，直至长出不定芽。切取再生的 Km
抗性芽(1. 0 ～ 1. 5 cm)，转入附加 Cef 400 mg·L － 1的
筛选生根培养基上培养诱导生根，进一步培养成为
完整的植株。
1. 5 转基因植株的分子检测
1. 5. 1 PCR 检测 采用 CTAB 法提取转基因植株
及对照植株叶片 DNA(Lodhi et al．，1994)，根据已知
ZxZF 基因特异序列设计引物，上海英俊生物公司
合成。上 游 引 物 序 列: 5’-CCTCATCAAGGTTCT
GGGAGT-3’; 下游引物序列: 5’-AAACATCAAT
TTTGGGTCGG-3’; 其产物大小: 726 bp。扩增反应
体系 25 μL: DNA 模板1 μL，上游引物(10 μmol·
L － 1 )0. 5 μL，下游引物(10 μmol·L － 1)0. 5 μL，10 ×
Taq Buffer 2. 5 μL，dNTP Mixture ( 2. 5 mol·L － 1 ) 1
μL，Taq 酶(5 U·μL － 1)0. 13 μL，超纯水补足 25 μL。
扩增反应条件: 94 ℃ 预变性 5 min; 94 ℃ 变性 1
min，57 ℃退火30 s，72 ℃复性 1 min，40 个循环; 72
℃延伸 7 min，4 ℃保存。
1. 5. 2 Southern 印记杂交检测 采用放射性同位
素法进行 Southern 杂交试验。使用经过 RNaseA 处
理并抽提再沉淀后的 DNA 进行酶切，体系如下:
DNA 30 ～ 40 μg，限制性内切酶 SacⅠ10 μL，10 ×
Buffer 10 μL，超纯水补足 25 μL，37 ℃ 酶切过夜。
酶切完毕的 DNA 用 0. 8%凝胶电泳，随后进行真空
转膜(Olszewska et al．，1988)。根据 Random Primer
DNA Labeling Kit Ver． 2. 0(Takara 公司)说明书，使
用32 P 同位素进行探针标记。参考《分子克隆试验
指南》(萨姆布鲁克等，2002)进行杂交和检测。
1. 5. 3 qRT-PCR 检测 使用 RNeasy Plant Mini Kit
(Qiagen)试剂盒提取转基因欧美杨叶片总 RNA，
2 μg总 RNA 用于 cDNA 合成。首先去除残留 DNA，
反应体系如下: 10 × RQ1 RNase-free DNase Reaction
Buffer 1. 5 μL，RQ1 RNase-free DNase (1 U·μg － 1 )
2 μL，RNA 2 μg，超纯水补足 15 μL，37 ℃下反应
30 min; 反应结束后立即加入 1 μL RQ1 DNase Stop
Solution，65 ℃ 10 min，终止反应; 向上述离心管中
加 Oligo(dT)15 Primer 1 μL，70 ℃变性 5 min，迅速
置于冰上; 向管内加入 M-MLV 5 × Reaction Buffer
5 μL，dNTP Mixture ( 2. 5 mmol·L － 1 ) 1. 25 μL，
Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor
0. 625 μL，M-MLV 1. 0 μL，超纯水补足 25 μL，混匀
后37 ℃下反应 1 h; 65 ℃ 10 min 终止反应，4 ℃
∞，－ 20 ℃保存。
ZxZF 基因特异序列，上游引物: 5’-CTCCAAA
CTCCTCTGCAAGCTT-3’; 下游: 5’-GATTGCCGCC
AGTTAATTGTG-3’; 产物大小150 bp。以 UBQ 为内
对照基因 ( ubiquitin，BU879229 )，上游引物: 5’-
GTTGATTTTTGCTGGGAAGC-3’; 下游: 5’- GATC
TTGGCCTTCACGTTGT -3’; 产物大小 193 bp。以稀
释 20 倍的反转录产物为模板，参照 SYBR Premix Ex
Taq 试剂盒 ( Takara 公司)说明配制 qRT-PCR 反应
体系: cDNA 模板 2 μL，2 × SYBR Premix Ex TaqⅡ
10 μL，50 × ROX Reference DyeⅡ 0. 4 μL，上游引物
(10 μmol·L － 1 ) 0. 6 μL，下游引物(10 μmol·L － 1 )
0. 6 μL，Nulease free water 6. 4 μL。使用 ABI 7500
型荧光定量 PCR 仪，选用两步法扩增，单独运行溶
解曲线。
1. 6 转基因植株的抗旱性检测
首先选取 ZxZF 基因成功表达的 4 个转基因欧
美杨植株的健康叶片进行组培再生，将所得再生芽
转入生根培养基中生根，至生根 5 ～ 8 条时，选择苗
高 7 ～ 8 cm、5 ～ 7 片叶子的幼苗，移至温室内水培培
养(环境温度为 22 ～ 24 ℃ )。培养液为 Hoagland 溶
液(pH6. 0)，培养液每隔 3 天更换 1 次，待幼苗长至
15 cm 以上时，选择生长一致的植株进行 PEG 模拟
干旱处理。处理浓度为 0%，5%，10% 和 15% (W /
V)4 个梯度，处理时间为 8 h，每个处理每个株系 8
次重复。处理结束后，参照《植物生理生化实验原
理和技术》(李合生，2007)取各株系叶片，测定叶
片相对含水量(RWC)、脯氨酸含量，各指标均设置
3 次重复。
2 结果与分析
2. 1 转基因欧美杨植株获得
欧美杨‘渤丰 1 号’无菌叶片经农杆菌侵染后，
在附加 Cef 300 mg·L － 1的分化筛选培养基中培养 30
天左右后，抗性芽长至 0. 2 ～ 0. 5 cm，60 天左右抗性
芽伸长的长度可达 1. 0 ～ 2. 0 cm。同时会淘汰出一
些假阳性植株。当抗性芽长至 1. 0 ～ 1. 5 cm 时，转
入附加 Cef 400 mg·L － 1的生根筛选培养基中，30 天
以后可长出 3 ～ 4 条根，根长可达 4. 0 ～ 8. 0 cm，苗
高可达 3. 0 ～ 6. 0 cm，而假阳性植株却未能生根，苗
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林 业 科 学 50 卷
黄化死去。当转基因抗性植株的苗高为 3. 0 ～ 6. 0
cm 时，移栽至温室进行脱菌生长，共获得 80 株具有
卡那霉素抗性的转基因植株。
2. 2 转基因欧美杨植株分子检测
2. 2. 1 转基因植株 PCR 分析 选择在温室生长较
好的转基因卡那霉素抗性植株，提取 DNA，并用目
的基因 ZxZF 引物扩增，以含有锌指蛋白基因的
pBI121 质粒作为阳性对照，以非转基因植株作为阴
性对照，进行 PCR 扩增，部分扩增结果见图 2。转
ZxZF 基因的植株在约 726 bp 处出现 1 条特征条
带，与预期扩增结果一致，而在阴性对照的泳道上未
发现该特征带，这初步证明 ZxZF 基因已成功整合
到‘渤丰 1 号’基因组中，并获得转 ZxZF 基因欧美
杨 17 株。
图 2 转基因欧美杨扩增 ZxZF 基因的 PCR 检测
Fig． 2 Detection of ZxZF from Km-resistant transgenic plants of P． × euramericana by PCR
Ck + : 阳性对照 Positive control; H: ddH2 O; WT: 非转基因植株 Non-transgenic plant; 1 － 21: 转基因
卡那霉素抗性植株 Kan-resistance transgenic plant; M: D2000．
2. 2. 2 转基因植株 Southern 印记杂交检测 经过
SacⅠ单酶切后的基因组 DNA 被用来进行 Southern
杂交试验，使用标记有 P32 -dCTP 放射性同位素的
NPTⅡ片段(产物大小: 505 bp)作为探针，杂交结
果(图 3)显示阳性对照及部分阳性转基因株系出现
了明显的杂交条带(2，3，4，5，6)，非转基因植株没
有杂交条带。证明外源基因 ZxZF 已经成功整合至
植物基因组中，且为单个拷贝。
图 3 Southern 杂交印记杂交检测结果
Fig． 3 The result of Southern blotting
Ck + 1: 质粒阳性对照 Plasmid，positive control; Ck + 2:
PCR 阳性对照 PCR positive control; WT: 非转基因植株
Non-transgenic plant; 1 － 9: PCR 阳性转基因株系 PCR
positive transgenic plants．
2. 2. 3 转基因植株 qRT-PCR 检测 为了检测
ZxZF 基因在转基因欧美杨中的转录表达情况，使
用转基因植株(L1，L2，L3，L4，L5)和非转基因植株
(WT)总 RNA 为模板反转录获得的 cDNA 进行 RT-
PCR 及 qRT-PCR 检测。经 UBQ 基因特异引物扩增
确定 RNA 浓度后，进行 ZxZF 基因的 RT-PCR 检测，
对照植株没有扩增出相应条带，转基因株系 L1 － L4
均扩增出 1 条清晰的特征条带(150 bp)，而转基因
株系 L5 条带不清晰 (图 4A)。随后对转基因株系
L1 － L4 进行 qRT-PCR 检测，定量结果 (图 4B)显
示: 转基因株系 L1 － L4 中 ZxZF 基因均正常转录
表达，其中，ZxZF 基因在转基因无性系 L1，L2 体内
表达量显著高于转基因株系 L3，L4。该结果与
RT-PCR结果一致，说明外源基因 ZxZF 已经成功整
合进入了植物基因组中，并且能够正常表达。
图 4 转基因欧美杨株系 RT-PCR 及 qRT-PCR 检测
Fig． 4 RT-PCR and qRT-PCR analysis of transgenic
P． × euramericana lines
A． 转基因植株 RT-PCR 检测 RT-PCR analysis of transgenic
plants; B． 转基因植株 qRT-PCR 检测 qRT-PCR analysis of
transgenic plants． Ck + : 阳性对照 Positive control; WT: 非转
基因 植 株 Non-transgenic plants; L1 － L5: 转 基 因 植 株
Transgenic plants．下同。The same below．
43
第 3 期 张伟溪等: 欧美杨锌指蛋白转录因子基因(ZxZF)的遗传转化及抗旱性初步分析
2. 3 转基因欧美杨植株抗旱性分析
2. 3. 1 模拟干旱胁迫对转基因株系生长的影响
向培养液中加入不同浓度 PEG 处理 8 h 后，转基因
株系与非转基因株系发生明显变化(图 5)。在 5%
PEG 处理组中，转基因株系与非转基因株系少量叶
片开始变黄，但二者差异不明显 (图 5A，B); 在
10% PEG 处理组中，转基因株系和非转基因株系开
始发生萎蔫现象，非转基因株系叶片变黄面积明显
大于转基因无性系，茎顶端开始弯曲(图 5A，B); 在
15% PEG 处理组中，非转基因株系叶片失水严重，
开始下垂，转基因株系部分植株叶片失水，少量变
黄，生长情况要明显好于非转基因植株(图 5C)。
图 5 不同 PEG 处理间欧美杨植株生长表型变化
Fig． 5 P． × euramericana in varied concentration of PEG
A．不同 PEG 浓 度 非 转 基 因 株 系 生 长 情 况 Effect of PEG
concentration on non-transgenic plants;B．不同 PEG 浓度转基因 L3
株系生长情况 Effect of PEG concentration on L3;C． 15% PEG 处
理组各植株生长情况 P． × euramericana in 15% PEG ．
2. 3. 2 模拟干旱胁迫对转基因株系叶片相对含水
率的影响 叶片相对含水量(RWC)是显示植物水
分状态的一个有效指标( Sinclair et al．，1986)。由图
6 可以看出: 随着 PEG 浓度加大，各株系叶片相对
含水率均呈下降趋势，其中非转基因植株降幅较大，
各浓度梯度之间差异极显著; 转基因株系相对含水
量在 5% PEG 处理组中降幅较小，与对照组差异不
显著; 在 10%和 15% PEG 处理组中各转基因株系
相对含水量显著低于对照组，均高于非转基因株系，
其中转基因株系 L1 和 L2 叶片相对含水量分别显著
高于非转基因株系 10. 34% 和 18. 93% (10% 处理
组)及 20. 27%和 17. 24% (15%处理组)，L3 叶片相
对含水量在 10% PEG 处理组中显著高于非转基因
株系 9. 59%。说明转基因株系在干旱模拟胁迫条
件下，叶片保水能力高于非转基因株系，这可能有助
于提高转基因株系的抗旱能力。
图 6 不同 PEG 处理下欧美杨转基因株
系叶片相对含水率变化
Fig． 6 Effect of varied concentration of PEG on relative water
content(RWC) of transgenic P． × euramericana lines
* : 与 WT 存在显著差异 ( P ＜ 0. 05) Significant differences from
the WT at P ＜ 0. 05．
2. 3. 3 模拟干旱胁迫对转基因植株脯氨酸含量的
影响 脯氨酸(proline，Pro)在植物组织内是作为一
种理想的渗调物质和防脱水剂，能通过调节降低细
胞水势并保持膨压(Nanjo et al．，1999)。如图 7 所
示，各转基因株系在不同浓度 PEG 处理后，脯氨酸
含量呈现不同程度积累，转基因株系 L1，L2 呈现先
升高后降低趋势，L3，L4 持续增高; 非转基因株系
呈现先降低后升高趋势; 在各处理组中(对照组除
外)各转基因株系脯氨酸含量均高于非转基因株
系，L2 分 别 显 著 高 于 非 转 基 因 株 系 12. 91%
(5% PEG)及 41. 82% (10% PEG)，L3 显著高于非转
基因株系 53. 34% (15% PEG)，L4 显著高于非转基
因株系53. 08% (5% PEG)。说明转基因株系在模拟
干旱条件下，各株系脯氨酸积累能力不同，但转基因
株系脯氨酸积累能力要高于非转基因株系，从而推
断转基因株系抗脱水能力强于非转基因株系。
3 结论与讨论
锌指蛋白是植物体内重要的转录因子，具有调
控植物生长发育、耐逆性等多种功能(Englbrecht et
53
林 业 科 学 50 卷
图 7 不同 PEG 处理对欧美杨转基因株系
脯氨酸含量的影响
Fig． 7 Effect of concentration of PEG on proline content of
transgenic P． × euramericana lines
* : 与 WT 存在显著性差异(P ＜ 0. 05) Significant differences
from the WT at P ＜ 0. 05．
al．，2004)。在农作物上已有研究报道锌指蛋白基
因的过量表达或导入可以显著增加植株 (水稻、烟
草)抗旱能力(Huang et al．，2009; Yang et al．，2008;
Jain et al．，2008)。本研究将从极端抗旱木本植物
霸王中获得的锌指蛋白转录因子导入欧美杨‘渤丰
1 号’中，通过 PCR、Southern 印记杂交、RT-PCR 及
qRT-PCR 分子检测，证实 ZxZF 基因已经成功以单
拷贝形式整合到转基因欧美杨体内，且在部分转基
因欧美杨中已经成功表达。本研究中使用的是干旱
诱导型启动子 RD29A，这个启动子没有器官专一
性，在逆境(如干旱、高盐和低温)时可驱动靶基因
大量 表 达，从 而 提 高 转 基 因 植 物 的 抗 逆 性
(Yamaguchi-Shinozaki et al．，1994)，可以避免 35S 强
启动子对转基因植株带来的不良影响，如矮化现象
(Hsieh et al．，2002a; 2002b)。
利用聚乙二醇( PEG)、甘露醇和蔗糖等高渗溶
液模拟干旱胁迫处理是作物抗旱性室内鉴定的常用
方法，其中高渗溶液中以 PEG-6000 较为理想，能使
植物组织和细胞处于类似于干旱的水分胁迫之中，
而不会引起质壁分离伤害植物( Ravikumar et al．，
2003)。本研究通过对转基因欧美杨植株的 PEG 干
旱模拟胁迫试验显示，转基因株系与非转基因株系
在经 PEG 胁迫处理后，转基因株系从生长形态上到
生理指标(相对含水量、脯氨酸含量)上均表现出一
定的优势。在干旱胁迫下，相对含水量的高低与其
抗脱水能力一致(Castonguay et al．，1992)，脯氨酸
的积累可以通过渗透调节保护亚细胞结构免受损害
(Nanjo et al．，1999)，因此，转基因杨树抗脱水能力
和渗透调节能力提高，进而抗旱性增强。此外，
C2H2 类转录因子(ZFP245)可通过调节脯氨酸合成
相关基因表达，促进转基因植物脯氨酸的积累，增强
转基因植物抗旱、耐盐能力 (Huang et al．，2009)。
推测本研究中，ZxZF 转录因子的导入可能是通过
间接调节脯氨酸合成及代谢相关基因的表达，来增
强转基因株系的渗透调节能力。而各转基因株系间
某些生理指标变化存在差异，可能与转基因株系中
外源基因插入位点和转录后调控等因素有关(杨金
水等，1995)。
杨树，作为我国第一大造林树种和林木基因工
程的模式树种，在林木遗传改良、培育林木优良品种
中具有重要作用。本研究将来自极端抗旱木本植物
霸王 ZxZF 转录因子基因成功导入欧美杨中，通过
胁迫试验验证，转基因欧美杨的抗旱能力得到提高，
表明 ZxZF 转录因子基因对提高杨树抗旱能力具有
重要作用，在培育抗旱林木优良品种中具有重要育
种价值。
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(责任编辑 徐 红)
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