全 文 ：第 !" 卷 第 " 期
# $ % $ 年 " 月
林 业 科 学
&’()*+(, &(-.,) &(*(’,)
./01!"!*/1"
2345!# $ % $
落叶松扦插生根过程 &&P文库构建及
部分基因的表达分析!
冯6健%!#6齐力旺%6孙晓梅%6张守攻%
"%1中国林业科学研究院林业研究所细胞生物学实验室6北京 %$$$7%# #1辽宁省林业科学研究院6沈阳 %%$$=#$
摘6要!6为研究落叶松在扦插生根过程中基因的表达情况!以落叶松扦插生根率存在显著差异的 # 个全同胞无
性系为材料构建差异表达YC*,文库!获得正’反 # 个消减文库% 随机挑取正库和反库各 <$$ 个克隆进行测序% 将
测序结果整理后!正库得到 #8# 个m4H)&+!反库得到 #!7 个m4H)&+% 经生物信息学分析表明!这些m4H)&+分别属
于新陈代谢’信号途径’物质运输’抗性相关’生长发育等类别基因!这些基因可能在扦插生根过程中具有重要作
用% 选择部分有代表性的基因!运用半定量d’N技术对这些基因在落叶松不同器官’不同扦插阶段的表达情况及
对(B,的响应进行检测% 检测结果表明激素在落叶松扦插生根过程中发挥重要作用!除激素类基因外!小I蛋白’
,B’转运蛋白类’因伤诱导物质等相关基因也参与落叶松扦插生根的过程%
关键词&6落叶松# &&P文库# 扦插# 生长素
中图分类号! &8%91!"666文献标识码!,666文章编号!%$$% A8!99"#$%$#$" A$$#8 A$9
收稿日期& #$$7 A$" A#7# 修回日期& #$$7 A$7 A#7%
基金项目& )9"=*计划)高产优质多抗林木花草分子与细胞高效育种技术及品种创制*"#$$",,%$$%$7$和国家转基因与产业化专项)优
质’杂种落叶松抗旱基因工程育种研究*"2#$$# ABA$$<$%
!张守攻为通讯作者%
!($’*170*,($()+7221&’’,($+7>*1#0*,<&3/>1,4,Z#*,($[,>1#1/ #$4NL21&’’,($
.#*&1$()# 6&@:&$&’K$<(-<&4,$;((*,$% ()3*’14 !7*,$%’
gM4F2HE4%!#6JH-HZE4F%6&34 @HE/OMH%6fLE4F&L/3F/4F%
"%"K’/.E/0I’$$%7$3?-/3/45! #$%$&’() *+%,-,.,$/01/’$%,’5! 7816?$-@-+4 %$$$7%# #":-&/+-+4 8(&6$=5/01/’$%,’56>)$+5&+4 %%$$=#$
=>’*1#0*&6(4 /UVMUW/H4[MKWHFEWMWLMM_\UMKKH/4 \EWMU4 /TFM4MKV3UH4FU//WH4F/T:&’-GY3WH4FK!WZ/VHTMUM4WHE0XM_\UMKKMV
YC*,0H^UEUHMKZMUMY/4KWU3YWMV ^X3KH4FWZ/:&’-GY0/4MKZL/KMUEWMK/TU//WH4FEUMKHF4HTHYE4W0XVHTMUM4W5)EYL <$$ Y0/4MK!
KW/YLEKWHYE0XKM0MYWMV TU/O\/KHWH[ME4V 4MFEWH[M0H^UEUX! ZMUMKMR3M4YMV5,TWMUKMR3M4YH4FE4V EKKMO^0H4F! ZM/^WEH4MV <#%
m4H)&+"#8# TU/O\/KHWH[M0H^UEUXE4V #!7 TU/O4MFEWH[M0H^UEUX$5+LMm4H)&+H4Y03VMV WLMFM4MKUM0EWMV W/OMWE^/0HKO!KHF4E0
\EWLZEX!WUE4K\/UW!UMKHKWE4YM! VM[M0/\OM4WE4V YM0KWU3YW3UM5+LMUMK30WK3FFMKWMV WLEWWLMKMFM4MKOHFLWLE[MWLMT34YWH/4
V3UH4FU//WH4F/T:&’-GY3WH4FK5+LMUM\UMKM4WEWH/4E0FM4MKZMUMKM0MYWMV E4V T3UWLMUVMWMYWMV ^X3KH4FKMOH]R3E4WHWEWH[MN+]
d’NW/34VMUKWE4V WLMHUM_\UMKKH/4 \EWMU4KH4 U//WK!KWMOK!0ME[MKE4V EWVHTMUM4WKWEFMK/TU//WH4F/T:&’-GY3WH4FK5+LMUMK30W
H4VHYEWMV WLEWL/UO/4MK\0EXMV \H[/WE0U/0MKH4 U//WH4F/T:&’-GY3WH4FK5BMKHVMKFM4MKUM0EWMV W/L/UO/4MK! KOE0I\U/WMH4
FM4MK!,+d^H4VH4FYEKKMWMWUE4K\/UWMUKFM4MKE4V SN’KFM4MKZMUME0H4[/0[MV H4 WLMU//WH4F\U/YMV3UM5
?&/ @(14’&6:&’-G# &&P0H^UEUX# Y3WH4F# E3_H4
66落叶松":&’-G$是我国北方地区主要造林树种%
扦插繁殖是落叶松今后实现无性系化的主要方式%
但是!落叶松是难生根树种!其生根能力差成为其无
性系化的瓶颈"杨书文等!%77!$% 为解决此问题!
很多学者从解剖学和生理学角度分析落叶松扦插生
根的过程!并提出解决办法"敖红等!#$$## 杜继煜
等!#$$!# 黄卓烈等!#$$## 刘桂丰等!%77#$% 这些
办法在一定程度上提高了落叶松扦插生根率!但是
并未探明落叶松扦插生根的机制!使得生产上带有
一定的盲目性% 为了解落叶松扦插生根过程中基因
表达谱!探明落叶松扦插生根机制!解决落叶松扦插
生根 率 低 的 问 题! 本 文 利 用 抑 制 消 减 杂 交
"K3\\UMKKH/4 K3^WUEYWH[MLX^UHVHaEWH/4!&&P$技术!分
别以扦插生根率存在显著差异的 # 个落叶松全同胞
无性系为试验材料!构建落叶松消减文库!并对部分
重要的差异表达基因进行表达分析% 获得这些基因
及其表达模式可为落叶松提高扦插生根率及遗传改
良提供理论支持和基因资源%
林 业 科 学 !" 卷6
%6材料与方法
CBCD材料
试验材料为杂种落叶松 " :&’-G3$E,/3$E-%j:"
/34$+%-%$"日永 9< j长 !’$=%]" 和 %<]! 两个全同胞
无性系!其中无性系 =%]" 的生根率 >7$:!无性系
%<]! 的生根率 ?#$:% 均取自辽宁大孤家国营林
场!取样时间为 #$$"+#$$8 年% 插穗经(B,处理后
进行扦插试验% 取材分 = 个时期!分别为插穗茎段’
插穗形成愈伤组织且有根原基形成’不定根生长初
期!其中插穗茎段分 (B,处理前和处理后!处理的
方法为 # j%$ A! O/0.-A% (B,处理 =$ OH4!" L 后取
材% 上述材料为建库和半定量 d’N部分材料% 另
外取 % 个 %!]%# 全同胞无性系"日永 9< j长 !’$"其
生根率为 !<: ;<<:$根’茎’叶作为半定量 d’N
材料使用% 取材后迅速液氮冷冻!带回实验室后
A8$ c保存%
CBAD方法
%1#1%6落叶松 ON*,分离6总 N*,提取参照
&Y/W2U等 "%779$的方法# ON*,分离纯化采用
JHEFM4 ON*,分离试剂盒提供的方法%
%1#1#6YC*,消减文库构建6获得足量 ON*,后!
按照 ’0/4WMYL d’N]&M0MYW+Q YC*,&3^WUEYWH/4 DHW操
作手册获得 YC*,片断% 获得的 YC*,片断与
+]MEKX载体连接# 然后转化大肠杆菌菌株 CP<’!构
建落叶松YC*,消减文库% 正库构建以无性系=%]"
插穗茎段经(B,处理前和处理后’插穗形成愈伤组
织且有根原基形成’不定根生长初期 ! 个时期的总
N*,等量混合后反转录成 YC*,为 +MKWMU# 以无性
系 %<]! 插穗茎段经(B,处理前和处理后’插穗形成
愈伤组织且有根原基形成’不定根生长初期 ! 个时
期的总N*,等量混合后反转录成 YC*,为 CUH[MU#
反库构建所用 +MKWMU和 CUH[MU为正库构建所用的
+MKWMU和CUH[MU互换%
细菌培养参考,分子克隆实验指南-"萨姆布鲁
克!#$$#$的方法进行% 随机挑取% $$$个克隆!委托
上海生工生物工程技术服务有限公司进行 =i端单
向序列测定%
%1#1=6生物信息学分析6采用 *’B(的 B-,&+软
件对所测序列与 IM4BE4‘ 中的非冗余数据库"4/4]
UMV34VE4WVEWE^EKM!*N$’V^)&+库比对%
%1#1!6半定量d’N分析6选择 7个差异表达基因!
设计特异性引物!落叶松 (]EYWH4 作为内参照物"表
%$% 以落叶松根’茎’叶’插穗茎段经(B,处理前和处
理后’插穗形成愈伤组织且有根原基形成的插穗基
部’不定根生长初期为试验材料!取等量的总N*,为
模板合成第 % 链YC*,!进行N+]d’N分析% 反应体
系为& 模板 % )-!V*+d$1! )-!%$ jd’N反应缓冲液
# )-!上游基因特异引物 $1! )-!下游基因特异引物
$1! )-!酶 $1# )-!d’N级无菌水%<1" )-!合计 #$
)-% 反应循环参数为 7! c预变性 = OH4# 7! c变性
=$ K!<< c退火 =$ K!8# c延伸 =$ K!%9 ;=< 个循环
"不同的基因!循环数不同!但每个基因在所有参试样
品中的循环数是固定的$# 8# c延伸 %$ OH4# ! c保
存% 所有的d’N产物在 %1#:的琼脂糖凝胶上进行
电泳!每个基因至少重复 =次%
表 CD半定量;95.!;上下游引物
9#>ICD.1,J&1’&S7&$0&’7’&4,$’&J,5S7#$*,*#*,<&;95.!;
YC*,66 上游引物 m\KWUMEOdUHOMUK66 下游引物 C/Z4KWUMEOdUHOMUK66 片段大小 &HaMe^*88L:V *88L:W A87L: K8WXL: #K8L: 8#1L: #87L: 8?7L: dMU/_HVEKMFM4M $Y&(,-+ #6结果与分析
ABCD落叶松0QW=消减文库构建
经过总 N*,和 ON*,质量’接头连接效率’
消减效率’阳性率检测表明!各项指标均符合试
验要求% 获得的 )&+大小在 <$$ ^\ 左右!消减
效率明显!阳性率达到 9<:以上% 上述结果表
明!以落叶松扦插生根率存在显著差异的 # 个全
同胞优良无性系为材料成功构建了YC*,消减文
库%
9#
6第 " 期 冯6健等& 落叶松扦插生根过程 &&P文库构建及部分基因的表达分析
ABAD落叶松0QW=消减文库N+9功能分类
在构建的正’反 # 个YC*,消减文库中!随机挑
取各 <$$ 个克隆进行单项序列测定% 对测序结果进
行整理后!正库得到 #8# 个 m4H)&+!反库得到 #!7
个m4H)&+% 将以上获得的 <#% 条序列和 *’B(的
*N库’V^)&+库进行序列比对!正库中有 %"% 条序
列!反库中有 %9# 条序列与数据库中的序列具有同
源性"分值"9$!相似性"89:!同源序列长 %$$ ^以上$% 所获得的 <#% 条序列分别属于不同的类
别!具体统计情况如表 # 所示%
分类结果"表 #$显示!在正库所获得的 #8# 个
m4H)&+中!有同源性的序列中!以信号途径占的比
例最大!达到 %<1$8:!其次是生长发育和抗性相
关!分别达到 %$1"":和 717=:# 无同源序列的
m4H)&+占 =718$:!加上功能尚未确定的序列!占到
所获得 m4H)&+的 !818$:% 在反库所获得的 #!7
个m4H)&+中!有同源性的序列中!新陈代谢类序列
占的比例最大!达到 #"1<%:!其次是信号途径’抗
性相关’生长发育类序列# 无同源序列的m4H)&+占
#91%%:!加上功能尚未确定的序列!占到所获得
m4H)&+的 =91%<:%
表 AD落叶松扦插生根过程差异表达0QW=文库
所获得的\$,N+9分类
9#>IAD9"&’(1*()\$,N+9(>*#,$&4)1(J*"&4,)&1&$*,#-/
&L21&’’&40QW=-,>1#1/ ()3*’14 ,$07*,$%
基因类别
&/UWK/TFM4MK
正库序列个数
m4H)&+H4
\/KHWH[M0H^UEUX
反库序列个数
m4H)&+H4
4MFEWH[M0H^UEUX
新陈代谢 QMWE^/0HKO #< ""
信号途径 &HF4E0\EWLZEXK !% ==
物质运输 +UE4K\/UW %< 8
抗性相关 NMKHKWE4YM #8 #=
生长发育 CM[M0/\OM4WE0\U/YMKKMK #7 #$
亚细胞组成 -/YE0HaEWH/4 < !
功能未知 m4‘4/Z4 \U/WMH4K ## #"
无比对结果 */LHWKT/34V %$9 8$
合计 +/WE0 #8# #!7
ABED激素类基因表达分析
#1=1%6*88:LV基因表达分析6如图 % 所示!*88L:V
基因在根’茎’叶中均表达!叶中表达量最高!茎中表
达量最低% 无论是生根率高的落叶松无性系"=%]"!
-%$还是生根率低的落叶松无性系"%<]!!-#$!(B,
处理后!*88L:V基因表达量均增加% 表明*88L:V 基
因受生长素的调控% 在-% 中!各个时期均有*88L:V
基因表达!且在不定根生长初期表达量较高% 在 -#
中!各个时期均有*88L:V基因表达!但是在插穗不定
根根原基形成和不定根生长初期 # 个时期表达量很
低% 上述结果表明!*88L:V 基因是生长素早期响应
基因!其在落叶松扦插生根过程中可能具有促进不定
根和侧根形成和生长发育的作用%
#1=1#6*88:LW 基因表达分析6如图 % 所示!
*88L:W 基因在根’叶和茎中均表达!茎中表达量高!
叶中表达量最低% (B,处理后!*88L:W 基因在 -#
中表达量明显升高!而在 -% 中表达量升高不明显%
表明*88L:W 基因受生长素的调控!但不同落叶松无
性系间!其表达量变化不同% 在 -# 中!各个时期均
有*88L:W 基因表达!且在 (B,处理后表达量最高%
在-% 中!*88L:W 基因表达均很低% 以上结果表明!
*88L:W 基因是生长素早期响应基因!其在落叶松扦
插生根过程中的作用有待进一步研究%
#1=1=6A87:L基因表达分析6如图 % 所示!
A87L:基因在根’茎’叶中均表达!且表达量无明显
差别% (B,处理后!A87L: 基因表达量在 -% 和 -#
中均增加% 表明A87L:基因受生长素的调控!且为
生长素早期响应基因% 在落叶松扦插生根各个时
期!A87L:基因在-% 中表达量均高于其在 -# 中表
达量% 这一结果表明!A87L: 基因可能具有促进落
叶松插穗形成不定根或侧根的作用%
#1=1!6K8WXL: 基因表达分析6如图 % 所示!
K8WXL:基因在根’茎’叶中均表达!且茎中表达量
高于根和叶中表达量% (B,处理后!K8WXL: 基因在
-# 中表达量变化不明显# 而其在 -% 中表达量明显
增加% 在落叶松扦插生根各个时期!K8WXL: 基因
在-# 中表达量均低于其在-% 中的表达量!并且!在
-% 中!K8WXL:基因在 (B,处理后和不定根根原基
形成 # 个时期表达量高于其他 # 个时期%
#1=1<6#K8L:基因表达分析6如图 % 所示!#K8L:
基因在根’茎’叶中均表达!且茎中表达量高于根和
叶中表达量% (B,处理后! #K8L: 基因表达量在
-% 中无明显变化!在 -# 中有增加的趋势% 在落叶
松扦插生根各个时期!#K8L: 基因在 -# 中表达量
均高于该基因在-% 中表达量%
ABOD信号转导类基因’’’小 :蛋白基因的表达
分析
#1!1%6#87L:基因表达分析6如图 # 所示!#87L:
基因在根’茎’叶中均表达!其中茎中的表达量略高
于根和叶中的表达量% (B,处理后!8#1L: 基因表
达量在-% 和 -# 中均明显增加% 在扦插生根过程
中!该基因在-# 中的表达量均低于其在 -% 中的表
达量% 在-# 中!该基因在根生长初期表达量极低%
在-% 中!该基因在激素处理后和不定根根原基形成
# 个时期的表达量明显高于其他时期% 上述结果表
7#
林 业 科 学 !" 卷6
图 %6*88L:V!*88L:W!A87L:!K8WXL:和#K8L:基因表达模式
gHF5%6+LMM_\UMKKH/4 /T*88L:V!*88L:W!A87L:!K8WXL: E4V #K8L:
%1根# #1叶# =1茎# ! A81*88L:V!*88L:W!A87L:!K8WXL:和#K8L:基因在生根率高的落叶松无性系"=%]"$中不同生根时期的表达#
9 A%%1*88L:V!*88L:W!A87L:!K8WXL:和#K8L:基因在生根率低的落叶松无性系"%<]!$中不同生根时期的表达% !!91插穗# %$ A! O/0.-A% (B,处理的插穗# "!%$1插穗不定根根原基形成# 8!%%1不定根生长初期%
%1N//W# #1-MET# =1&WMO# ! A81+LMM_\UMKKH/4 /T*88L:V!*88L:W!A87L:!K8WXL: E4V #K8L: V3UH4FU//WH4F/T:&’-GY3WH4FZLHYL LEKLHFL UEWM
/TU//WH4F# 9 A%%& +LMM_\UMKKH/4 /T*88L:V!*88L:W!A87L:!K8WXL: E4V #K8L: V3UH4FU//WH4F/T:&’-GY3WH4FZLHYL LEK0/ZUEWM/TU//WH4F5
!!91’3WH4FK# EV[M4WHWH/3KU//W5
明!#87L:基因的表达量可能受生长素的调控% 该
基因在落叶松扦插形成不定根的关键时期表达量较
高!表明其可能参与生长素作用的信号途径%
#1!1#68#1L:基因表达分析6如图 # 所示!8#1L:
基因在根’茎’叶中均表达!且根中的表达量略高于
茎和叶中的表达量% (B,处理后!8#1L: 基因表达
量在-% 和 -# 中均增加!但增加不明显% 在扦插
生根的各个时期!8#1L:基因在-%的不定根生长初
期表达量最低!在不定根根原基形成过程中表达量
最高% 8#1L:基因在-# 中茎段和不定根生长初期
表达量低!在不定根根原基形成过程中为高表达%
在形成愈伤组织且有根原基形成时期!8#1L: 基因
在-% 中表达量明显高于该基因在-# 中表达量% 上
述结果表明!8#1L: 基因表达量是否受生长素的调
控不能确定% 该基因可能具有促进落叶松扦插形成
不定根的作用%
图 #6#87L:! 8#1L:! 8?7L:和dMU/_HVEKM基因表达模式
gHF5#6+LMM_\UMKKH/4 /T#87L:!8#1L:!8?7L: E4V dMU/_HVEKM
%1根# #1叶# =1茎# ! A81#87L:!8#1L:!8?7L: 和 dMU/_HVEKM基因在生根率高的落叶松无性系"=%]"$中不同生根时期的表达# 9 A
%%1#87L:!8#1L:!8?7L:和dMU/_HVEKM基因在生根率低的落叶松无性系"%<]!$中不同生根时期的表达% !!91插穗# -A% (B,处理的插穗# "!%$1插穗不定根根原基形成# 8!%%1不定根生长初期%
%1N//W# #1-MET# =1&WMO# ! A81+LMM_\UMKKH/4 /T#87L:!8#1L:!8?7L: E4V dMU/_HVEKMV3UH4FU//WH4F/T:&’-GY3WH4FZLHYL LEKLHFL UEWM/T
U//WH4F# 9 A%%5+LMM_\UMKKH/4 /T#87L:!8#1L:!8?7L: E4V dMU/_HVEKMV3UH4FU//WH4F/T:&’-GY3WH4FZLHYL LEK0/ZUEWM/TU//WH4F5!!91’3WH4FK#
$=
6第 " 期 冯6健等& 落叶松扦插生根过程 &&P文库构建及部分基因的表达分析
ABPD转运蛋白基因表达分析
如图 # 所示!8?7L: 基因在根’茎’叶中均表
达% (B,处理后!8#1L:基因在 -% 和 -# 中表达量
均无明显变化% 在 -% 和 -# 中!该基因在扦插生根
的各个时期均表达% 不定根根原基形成和根生长初
期!该基因在-# 中的表达量明显低于该基因在 -%
中的表达量% 另外!在不定根根原基形成时期!该基
因表达量明显高于其他时期!表明该基因可能在不
定根形成中发挥作用%
ABUD因伤诱导物质相关基因’’’过氧化物酶基因
表达分析
如图 # 所示!落叶松过氧化物酶基因在根’茎’
叶中均表达!且表达量无明显差别% (B,处理后!落
叶松过氧化物酶基因表达量在 -# 和 -% 中均增加!
但-% 增加量高于-# 增加量% 在落叶松扦插生根的
各个时期!落叶松过氧化物酶基因在-# 中的表达量
均低于该基因在 -% 中的表达量% 在 -% 中!落叶松
过氧化物酶基因在 (B,处理后和不定根根原基形
成 # 个时期表达量明显高于该基因在其他时期的表
达量% 上述结果表明!在落叶松扦插生根的过程中
伴随着大量酶类基因的表达!这些基因的表达产生
大量创伤相关物质!这些物质同外援 (B,共同作
用!在落叶松扦插生根过程中促进不定根或侧根的
形成和生长发育%
=6讨论
构建一个好的差异表达 YC*,文库对起始
ON*,的完整性和纯度要求非常高% 本试验的结果
表明!试验获得的总N*,含量高!完整性好!#9& 与
%9&带型亮度比达到 #p%% ON*,的完整性和纯度
也完全达到文库构建要求% 在本文抑制消减杂交试
验中!从反转录合成YC*,的监控’加接头后的接头
连接效率分析到差减YC*,片段的差减效率分析试
验!都随时监控着各个试验环节!保证最终获得高质
量的差异表达 YC*,文库% 单菌落 d’N扩增电泳
图谱呈现很好的多态性!点杂交试验结果为阳性率
在 9<:以上% 这些结果直接说明获得了高质量的
正’反 # 个差异表达YC*,文库%
通过生物信息学分析!正库获得的 #8# 个
m4H)&+中! 以信号途径占的比例最大! 达到
%<1$8:!其次是生长发育和抗性相关!分别达到
%$1"":和 717=:# 无同源序列的 m4H)&+占
!$19%:!加上功能尚未确定的序列!占到所获得
m4H)&+的 !818$:% 这些结果表明!在落叶松扦插
生根过程中!与生长发育和新陈代谢相关的基因大
量表达!这些基因的表达产生相应的蛋白和信号!最
终促使插穗形成不定根根原基并最终发育成不定
根% 反库获得的 #!7 个m4H)&+中!新陈代谢类序列
占的比例最大!达到 #"1<%:!其次是信号途径’抗
性相关’生长发育类序列# 无同源序列的m4H)&+占
#91%%:!加上功能尚未确定的序列!占到所获得
m4H)&+的 =91%<:# 这些结果表明!在生根能力弱
的落叶松无性系插穗中大量表达新陈代谢类基因%
这些基因的表达会在插穗中产生大量次生代谢物!
这些物质的产生是否影响插穗生根!有待进一步
研究%
EBCD激素相关基因对落叶松扦插生根能力的影响
8.GZ*88基因家族是生长素早期响应基因之
一!该基因的功能获得性突变体在根的生长发育中
表现出生长素敏感性降低!并表现出十分明显的与
生长素相关的发育缺陷!如 &G’WZ-&&[ 突变体
"*EF\E0$,&35!#$$$# SH0K/4 $,&35!%77$$!&G’\Z-&&V[
突变体 "N/3KM$,&35! %779 $ 和 &G’]Z-&&V 突变体
"GE4F$,&35!#$$!$向地性和顶端优势改变!-&&W^ 突
变体"N/FF$,&35!#$$%$和 %3’Z-&&V_ 突变体"g3‘E‘H
$,&35!#$$#$严重的侧根缺陷!%)5WZ-&&\"JH4F$,&35!
%777# &/L $,&35!%777$光形态建成缺陷!=%4WZ-&&V‘
突变体"+EWMOEWK3 $,&35!#$$!$下胚轴向性缺陷% 这
些结果说明!8.GZ*88基因在不定根和侧根生长发
育中发挥重要作用% 本研究通过 N+]d’N结果表
明!在使用 (B,处理后!所获得的 # 个落叶松 8.GZ
*88基因表达量均增加!说明 *88L:V 和 *88L:W 基
因均受生长素的调控!为生长素响应基因% 在 -%
中!在扦插生根的各个时期均有 *88L:V 基因表达!
且均高于其在 -# 中的表达量% 上述结果说明!
*88L:V 基因伴随着落叶松扦插生根的各个过程!其
在落叶松扦插生根过程中具有促进不定根形成和生
长发育的作用% 然而!(B,处理后!*88L:W 基因在
-# 中的表达量明显高于其在 -% 中表达量% 在落叶
松扦插生根的各个过程中!*88L:W 基因在 -% 中表
达量均低于其在-# 中表达量!因此!*88L:W 基因对
不定根和侧根的发生具有促进还是抑制作用有待进
一步探讨%
A87K是一个植物中特有的基因家族!在植物发
育过程中起作用% 在根中首次发现该基因家族成员
是A87V% A87V 在根尖’子叶和叶子中都有表达!
但以根中的表达最为活跃% 通过对 A87V 检测!其
同样具有转录因子的作用% A87V 参与生长素信号
转导途径!过量表达将促进侧根的发生% 同时!
A87V 控制着D?!和 8*#\ 两个生长素相关基因的
%=
林 业 科 学 !" 卷6
表达% 这表明A87V 参与了生长素调控的侧根发生
过程"JH$,&35!#$$$$% 半定量分析表明!本研究中
A87L:基因受生长素的调控% 在扦插生根各个时
期!A87L:基因均在-% 中表达量高于其在 -# 中表
达量% 这表明A87L: 基因可能在落叶松扦插生根
过程中具有促进不定根和侧根生长发育的作用%
上述生长素响应基因的表达分析结果表明!在
落叶松扦插生根过程中伴随着一系列生长素相关基
因的表达% 这些基因的表达最终促进不定根和侧根
的形成与生长发育% 这些生长素响应基因的发现!
从分子水平上证明!生长素在落叶松扦插生根过程
中发挥重要作用% 这一结果同以往从生理角度研究
落叶松扦插生根的结果相一致"敖红等!#$$#$%
赤霉素对根生长发育影响的报道不多!在落叶
松扦插试验中!I,! 促进插穗愈伤组织形成和不定
根产生% 另外!研究表明赤霉素通过减少C)--,蛋
白在细胞核内浓度从而降低 C)--,蛋白的生长抑
制效应% 在赤霉素的合成过程中赤霉素 #$ A氧化
酶发挥重要作用!参与催化多步氧化的过程!使
’#$ AI,K氧化掉 % 个碳原子转化成 ’%7 AI,K% 本
研究结果表明!K8WXL: 基因表达量在 -% 和 -# 中
存在明显差异!且该基因受生长素的影响% (B,处
理后和形成愈伤组织且有根原基形成 # 个时期!
K8WXL:基因在 -% 中表达量明显高于其在 -# 中表
达量% 这些结果表明!生根能力强的落叶松无性系
在扦插生根过程中合成的赤霉素多!相反!生根能力
弱的落叶松无性系在扦插生根过程中合成的赤霉素
少% 另外!本研究还获得 % 个 #K8基因!该基因编
码一种 C)--,蛋白!C)--,蛋白具有抑制植物生
长发育的作用!但是在生长素促进下赤霉素可以减
少C)--,蛋白的浓度!从而降低其对生长发育的抑
制作用% 半定量分析表明!在落叶松扦插生根各个
时期!#K8L: 基因在 -# 中表达量均高于该基因在
-% 中表达量% 在生根能力弱的无性系中!#K8L: 基
因大量表达产生C)--,蛋白!从而抑制落叶松扦插
过程中不定根的生长发育% 而在生根能力强的落叶
松无性系中!一方面 #K8L: 基因表达量低!产生的
C)--,蛋白少!另一方面!大量合成赤霉素降解
C)--,蛋白% 这两方面的综合作用!使得 C)--,
蛋白的抑制生长作用大大降低!从而使插穗具有较
强的生根能力%
EBAD其他基因对落叶松扦插生根能力的影响
=1#1%6小I蛋白对落叶松扦插生根的影响6小 I
蛋白家族成员是单体蛋白!分子质量较小!大约
#$ ;=$ ‘3!为了与异三聚体 I蛋白区别!通常称之
为小I蛋白% 小I蛋白家族成员结构保守!一般包
括 ! 个鸟核苷酸结合区和 % 个效应器分子结合区
"GE4F!#$$#$% 小 I蛋白虽然结构保守!但其功能
却具有多样性% 许多植物特有的信号途径和功能均
需要小I蛋白参与完成% NEK家族在酵母和哺乳动
物中调节细胞分化过程# NL/家族成员调控肌动蛋
白重组过程和参与Q,d激酶的细胞信号转导过程#
NE^家族在膜转运过程中起着重要作用# 而 NE4 家
族在核孔位置调节着蛋白和N*,分子的运输过程%
,UT和 ,UTI)g"F3E4H4M43Y0M/WHVMM_YLE4FMTEYW/U$
对d(*% 的极性定位有很重要的作用% 在调控质膜
和胞质之间的蛋白运输中!d(*% 可能充当了植物激
素的运出载体"IM0V4MU$,&35!#$$%# GE4F!#$$#$%
Nod是植物小I蛋白中参与信号转导的唯一家族%
Nod在调控根毛的发育中起到重要的作用% 通过
对#L!_ 抗体和 K1!Y#L!W 的定位研究表明!Nod
位于拟南芥"8’&;-6/E%-%,)&3-&+&$伸长的根毛尖端%
#L!W 调控了根毛的发生和尖端的生长!拟南芥
#L!W 超表达植株增加了根毛的数量和密度!78Y
’/EW!78Y’/E_ 或78Y’/Ea 能引起根毛尖端各向同性
生长或延长根毛的长度!而 DAY’/EW 则抑制根毛尖
端的生长"BE03K‘E$,&35!#$$$# S3 $,&35!#$$%# 2/4MK
$,&35!#$$## Q/0M4V3‘ $,&35!#$$%# 吕品等!#$$<$%
另外!Nod介导了,B,应答途径的负调控% 拟南芥
DAY’/EW 和78Y’/EW 分别促进和抑制 ,B,抑制的种
子萌发过程% 对某些功能缺失突变体研究表明&
#L!‘ 和#L!VX 是,B,反应的负调控子% #L!‘ 或
#L!VX 突变体中!,B,对种子萌发’变绿以及根生
长的抑制作用都微弱增强了!而#X3!VXZ#X3!‘ 双突
变体显著增强了,B,在这些方面的反应"dMH$,&35!
%779# fLM4F$,&35!#$$#$% Nod除了介导,B,应答
途径的负调控外!还可能调控其他激素的功能和发
育的过程!如转 \]>b78Y’/EW植株表型上类似于生长
素或油菜素内酯过量表达的植株% 与此相反!转
\]>bDAY’/EW植株表型上类似于缺乏生长素或油菜
素内酯的植株% 推测不同的 #L!基因参与不同的
生长素或油菜素内酯反应或积累调控!从而调控植
物的形态建成"-H!#$$%$% 本研究获得的#87L: 基
因在扦插生根率高的落叶松无性系扦插生根的各个
时期均有表达!且在生长素处理后和形成愈伤组织
且有根原基形成时期表达量高于其他时期% 同时!
与-# 相比!该基因表达量在 -% 的扦插生根各个时
期表达量均较高% 这些结果表明!该基因可能在落
叶松扦插生根过程中具有促进不定根发生发育的作
用% 因该基因在生长素处理后表达量明显增加!其
#=
6第 " 期 冯6健等& 落叶松扦插生根过程 &&P文库构建及部分基因的表达分析
作用机制可能参与生长素的信号转导途径% 本研究
获得的8#1L:基因在落叶松扦插最关键的不定根
根原基形成时期表达量最高!且该基因在-% 中表达
量明显高于其在-# 中的表达量% 表明该基因在落
叶松扦插形成不定根过程中具有促进不定根形成的
作用% 其作用机制有待进一步探讨% 可以肯定的是
在落叶松扦插形成不定根’侧根和根毛过程中!小I
蛋白具有一定的促进作用%
=1#1#6转运蛋白对落叶松扦插生根能力的影响6
自然界生物体中普遍存在着 # 大家族的初级和次级
转运体& ,+d结合盒式蛋白 ",+d]^H4VH4FYEKKMWM
WUE4K\/UWMU!,B’$转运体超家族和主要易化转运体
"OEh/UTEYH0HWEW/UK3\MUTEOH0X! Qg&$超家族% ,B’家
族主要是初级主动转运体!通过 ,+d水解释放能量
而运输大小分子化合物!包括离子’氨基酸’核苷酸’
多糖’多肽甚至蛋白质等% ,B’蛋白除了运输环境
胁迫过程中积累的细胞毒素物质到细胞质中以外!
还参与调控植物体内的离子运输和植物的生长过
程% 在拟南芥中!由 8,F#!] 编码的 ,B’转运蛋白
是有机阳离子的运载体!主要在植物的维管束核表
皮表达!此基因的缺失!引起根生长减慢!侧根增加!
生长素含量升高!由此认为 8,F#!] 可能为生长素
结合运输载体"*HY/0E$,&35!#$$%$% 在落叶松扦插
生根的各个时期!-% 中 8?7L: 基因的表达量均明
显高于-# 中该基因的表达量% 在 -% 中!8?7L: 基
因在不定根根原基形成时期表达量特别高% 这表
明!8?7L: 基因的表达量同落叶松扦插形成不定根
或侧根的能力成一定的正相关% 其在落叶松扦插形
成不定根和侧根的过程中可能具有促进作用%
=1#1=6创伤相关物质对落叶松扦插生根能力的影
响6植物在受到创伤时!会产生一些与伤害有关的
物质及代谢酶类!如葡聚糖酶’过氧化物酶’磷脂酶
和脂氧化酶等% 国内外很多研究表明!一些种类的
酶与不定根的发生有关% &aE^/0YK等"#$$#$测定了
马缨丹":&+,&+& (&=&’&$’南美天芥菜"H$3-/,’/E-.=
&’;/’$%($+%$’斯托卡蜡菊"H$3-()’5%.=%,/$()&%$扦插
生根过程中的过氧化物酶"\MU/_HVEKM$的动态变化!
生根快的马缨丹和南美天芥菜比生根慢的斯托卡蜡
菊插穗上所有器官内的过氧化物酶活性都要高 %$
倍% 所有插穗上叶片内过氧化物酶活性在生根前均
缓慢下降!过氧化物酶活性自顶部向基部逐渐升高!
在插穗基部愈伤组织形成的过程中达到最高水平%
而最显著的变化是在扦插 8 天后!马缨丹和南美天
芥菜基部的过氧化物酶活性都升高 < 倍!而斯托卡
蜡菊则升高 #$ 倍!不定根发生后!过氧化物酶活性
降低!最终恢复至样本的初始水平% 因此!&aE^/0YK
等"#$$#$认为不定根发生过程中的过氧化物酶活
性与植物生根能力密切相关% 通过测定黑杨
"!/E.3.%+-4’&$’银白杨"!/E.3.%&3;&$’欧洲山杨
"!/E.3.%,’$=.3&$在扦插生根过程中过氧化物酶和
(,,氧化酶活性的动态变化!发现尽管 = 个树种的
插穗生根能力不同!但在根发生或根原基形成过程
中!过氧化物酶活性均上升!没有发现过氧化物酶活
性和生根能力有显著的相关性!因此认为过氧化物
酶活性不影响插穗生根能力和生根率!但对细胞分
裂起作用" &aE^/0YK$,&35!#$$## +/LHW!#$$$# -H3 $,
&35!#$$=# 张肪等!#$$"$% 本研究结果表明! (B,处
理后!落叶松过氧化物酶基因在 -% 和 -# 中的表达
量均升高% 但是该基因的表达量是否跟生长素处理
有关!仍无法确定% 本研究生长素处理后材料是
(B,处理至少 " L后取材的!在这段时间里!由于插
穗已造成切口!因此与产生因伤诱导物质相关的基
因已开始表达% 在落叶松扦插生根各个时期!过氧
化物酶基因在 -% 中表达量均高于其在 -# 中表达
量% 在-% 中!过氧化物酶基因在生长素处理后和不
定根根原基形成 # 个时期的表达量明显高于其他时
期该基因的表达量% 这些结果说明!该基因的表达
量与落叶松生根能力存在正相关!且在落叶松扦插
生根的关键时期表达量增高% 据此表明!落叶松过
氧化物酶基因可能有促进落叶松扦插形成不定根和
侧根的作用%
参 考 文 献
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其与扦插生根的关系5植物研究! ##"#$& %7$ A%7<5
杜继煜! 白6岩! 白宝璋5#$$!5植物的插条繁殖生理5农业与技
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黄卓烈! 李6明! 谭绍满!等5#$$#5萘乙酸处理桉树插条后过氧化
物酶活性及其同工酶变化与插条生根的关系研究5植物研究!
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&/L Q&! P/4F& P! DHOB’! $,&35%7775NMF30EWH/4 /T^/WL 0HFLW]
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FU/ZWL UMK\/4KMK/TLX\/Y/WX0KE4V T/UOEWH/4 /T0EWMUE0U//WKH4
8’&;-6/E%-%,)&3-&+&"d0E4W’M0! %" & =87 A=7=5
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SH0K/4 ,D!dHY‘MWgB!+3U4MU2’!$,&35%77$5,V/OH4E4WO3WEWH/4
H4 8’&;-6/E%-%Y/4TMUKUMKHKWE4YMW/E3_H4! MWLX0M4M! E4V E^KYHKHY
EYHV5Q/0MY30EUE4V IM4MUE0IM4MWHYK! ###& =88 A=9=5
S3 I3E4F! I3 GH4F! -H&L34VEH! $,&35#$$%5,FM4/OM]ZHVME4E0XKHK
/T8’&;-6/E%-%N/\]H4WMUEYWH[M’N(BO/WHT]Y/4WEH4H4F\U/WMH4KWLEW
EYWEKN/\ I+dEKMWEUFMWK5d0E4W’M0! %=& #9!% A#9<"5
GE4F@! -MM&! &/2P! $,&35#$$!5+LM(,,% \U/WMH4 HKM4Y/VMV ^X
8C#< E4V HKEK3^KWUEWM/T&’g+(N(5d0E4W2!!$ & 88# A89#5
GE4FfLM4^HE/5#$$#5&OE0I+dEKM& [MUKEWH0MKHF4E0H4FKZHWYLMKH4
\0E4WK5+LMd0E4W’M0! %!& =8< A=995
fLM4Ff-!*ETHKHQ!+EO,! $,&35#$$#5d0EKOEOMO^UE4M]EKK/YHEWMV
Nod%$ KOE0I+dEKMHKEK\MYHTHY4MFEWH[MUMF30EW/U/TE^KYHKHYEYHV
UMK\/4KMKH4 8’&;-6/E%-%5d0E4W’M0! %!& #898 A#8785
!责任编辑6徐6红"
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