全 文 ：第 49 卷 第 11 期
2 0 1 3 年 11 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 49，No. 11
Nov．，2 0 1 3
doi:10．11707 / j．1001-7488．20131127
收稿日期: 2012 － 11 － 16; 修回日期: 2013 － 04 － 07。
基金项目: 国家自然科学基金面上项目(31070561) ; 辽宁省百千万人才资助项目(2009921071)。
PEG分级沉淀法分析天女木兰种子的低丰度蛋白
陆秀君1，3 张晓林1，2，3 刘广林1 李天来2，3
(1．沈阳农业大学林学院 沈阳 110866; 2. 沈阳农业大学园艺学院 沈阳 110866;
3. 沈阳农业大学设施园艺省部共建教育部重点实验室 沈阳 110866)
关键词: 天女木兰; 种子; 蛋白质提取; PEG 分级沉淀法
中图分类号: S718. 43 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2013)11 － 0189 － 06
Polyethylene Glycol Fractionation Analysis of Low-Abundant
Proteins in Magnolia sieboldii Seeds
Lu Xiujun1，3 Zhang Xiaolin1，2，3 Liu Guanglin1 Li Tianlai2，3
(1 ． College of Forestry，Shenyang Agricultural University Shenyang 110866;
2 ． College of Horticulture，Shenyang Agricultural University Shenyang 110866;
3 ． Key Laboratory of Protected Horticulture of Ministry of Education，Shenyang Agricultural University Shenyang 110866)
Abstract: Magnolia sieboldii seeds store large amount of proteins that would interfere with determination of low
abundance proteins by the electrophoresis pattern． In this study，a plant leaf protein extraction method was employed，that
is，enriching high-abundance protein Rubisco by PEG． The PEG fractionation method was compared with TCA-acetone
extract method in 2-DE analysis of protein samples． The result showed that the two methods had good reproducibility for
extracting proteins． High-abundant proteins were precipitated predominantly in the 8% and 16% PEG fraction． With this
protocol，a total 1 770 protein spots were detected，among which 50% of proteins were undetectable with the TCA-acetone
method． With the PEG fractionation method，low-abundance protein detection rate increased significantly，and the PEG
fractionation method，as a new method for proteomics study of M． sieboldii seeds，would be able to satisfy the follow-up
test in screening the seed germination associated protein needs． The PEG fractionation method would also provide a
reference for other plant seed proteins extraction．
Key words: Magnolia sieboldii; seed; protein extraction; polyethylene glycol fractionation
蛋白质组学研究的瓶颈问题之一是低丰度蛋白
的检测，这些低丰度蛋白往往发挥多种重要的生理
功能，如细胞防御、基因表达调节、信号传导等，因此
低丰度蛋白的检测尤为重要。在双向电泳试验时，
有 2 个因素限制了低丰度蛋白的检测: 第一，IPG 胶
条的上样量有限; 第二，高丰度蛋白的位置效应(王
旭，2007)。例如，植物叶片中高丰度蛋白 Rubisco
含量超过 50% (Gutteridge et al．，1995)，这些高丰度
蛋白的存在影响低丰度蛋白的分析。应用 PEG 分
级提取法对水稻(Oryza sativa)叶片蛋白提取发现，
叶片中的 Rubisco 酶被有效富集在 15% PEG 组分中
(Kim et al．，2001; 2003; 2004; Lee et al．，2007a;
2007b; 2011; Zhang et al．，2010)。目前 PEG 分级
提取法主要应用在草本植物中，并且不同植物的蛋
白提取采用不同的 PEG 浓度配置。例如，拟南芥
(Arabidopsis thaliana) 叶片蛋白提取采用 16% 的
PEG 浓度 (Xi et al．，2006);Aryal 等 (2012)进一步
证明在 5%，10%，15% 3 个 PEG 浓度都有 Rubisco
酶富 集。目 前 在 番 茄 ( Lycopersicon esculentum )
(Ahsan et al．，2007)、洋蓟(Cynara cardunculus var．
scolymus ) ( Acquadro et al．， 2009 )、向 日 葵
(Helianthus annuus) (Walliwalagedara et al．，2010)、
水稻叶鞘 (王莹等，2011)、黄瓜 ( Cucumis sativus)
(任丽萍等，2011)、甜瓜(Cucumis melon) (钟俐等，
2012 )、大 豆 ( Glycine max )、芒 草 ( Miscanthus
sinensis)、卷心菜(Brassica oleracea var． capitata)、花
林 业 科 学 49 卷
生(Arachis hypogaea) (Alam et al．，2013)叶片蛋白
提取中均有报道。木本植物中，目前只发现在野茶
树(Camellia sinensis)叶片蛋白提取中应用 PEG 分
级提取法，PEG 浓度采用 15% (Alam et al．，2013)，
而在其他木本植物研究中还鲜有报道。
在天女木兰(Magnolia sieboldii)种子蛋白双向
电泳体系建立过程中发现，在电泳图谱的 30 kDa 和
50 kDa 附近有 2 条明显的高丰度蛋白条带，推测这
2 条高丰度蛋白条带为天女木兰种子储藏蛋白，在
高丰度蛋白干扰下，使得对低丰度蛋白的检测以及
深入分析研究变得非常困难。因此，本研究以天女
木兰种子为材料，根据 PEG 分子与蛋白分子之间的
空间排查作用，设置不同的 PEG 浓度梯度，对种子
蛋白进行分级分离，将高丰度蛋白富集在单一组分
中，提高对低丰度蛋白的检测，增加电泳图谱的分辨
率，建立适用于天女木兰种子蛋白质高通量分析的
提取方法。
1 材料与方法
1. 1 材料 供试天女木兰种子采摘于沈阳农业大
学植物园。
1. 2 主要仪器和试剂 Manifold 胶条槽、Ettan
IPGphorⅢ等点聚焦仪、SE 600 Ruby 垂直电泳仪、
Multi TempⅢ温度控制仪，均为 GE Healthcare 公司
产品;UMAX Power look 2100XL 扫描仪购自 UMAX
公司。
双向电泳常规试剂参照张晓林等(2012)方法，
PEG 分级主要试剂: 聚乙二醇( PEG4000)、乙基苯
基聚乙二醇(NP-40)。所有溶液均用超纯水配置。
1. 3 样品制备 1) TCA －丙酮法 参照 Damerval
等(1986)的方法并略有改进。取 3 g 天女木兰种
子，去掉外种皮液氮冷冻研磨，加入 30 mL 预冷的丙
酮溶液(含质量分数 10% 的三氯乙酸和体积分数
0. 07%的 β －巯基乙醇)，－ 20 ℃静置 2 h 或沉淀过
夜，于 4 ℃、15 000 × g 离心 30 min，弃上清，沉淀用
5 倍体积预冷的体积分数 80% 丙酮 (含体积分数
0. 07%的 β － 巯基乙醇)溶液清洗，于 － 20 ℃静置
30 min，4 ℃、15 000 × g 离心 30 min，弃上清，重复 6
次，最后沉淀即为全蛋白，冷冻干燥后放 － 70 ℃
保存。
2) 蛋白质 PEG 分级提取法 参照 Kim 等
(2001)方法并略有改进。操作步骤如图 1，具体方
法如下: 取 10 g 天女木兰种子去掉外种皮，液氮冷
冻研磨。加入 4 倍体积 4 ℃预冷的 Mg /NP-40 蛋白
提取液，充分混匀后 4 ℃、13 000 × g 离心15 min，
图 1 PEG 分级法提取种子全蛋白质样品流程
Fig． 1 Flowchart of PEG classification method to
extract the seed protein sample
收集上清，沉淀用 Mg /NP-40 提取液洗涤 1 次，同样
参数离心，上清液与前一步上清液混合，沉淀部分经
检测蛋白含量很少，故舍弃; 向上清液中加入 50%
PEG 溶液，使其浓度达到8%，冰浴30 min。4 ℃、
2 000 × g 离心 10 min，所得沉淀部分为 F1; 上清液
继续加入 50% PEG 溶液，使其浓度达到 14%，冰浴
30 min。4 ℃、13 000 × g 离心15 min，所得沉淀部分
为 F2; 上清液继续加入 50% PEG 储备液，使其浓度
达到 20%，冰浴 30 min。4 ℃、13 000 × g 离心 15
min，所得沉淀部分为 F3; 最后的上清液加入 4 倍体
积预冷的丙酮溶液(含质量分数 10%的三氯乙酸和
体积分数 0. 07%的 β －巯基乙醇)，－ 20 ℃静置 2 h
或过夜，4 ℃、15 000 × g 离心 15 min，得到的沉淀
部分为 F4; F1，F2，F3，F4 分别加入 5 倍体积预冷的
丙酮溶液(含质量分数 10%的三氯乙酸和体积分数
0. 07%的 β －巯基乙醇)，－ 20 ℃静置 2 h 或过夜，4
℃、15 000 × g 离心30 min，弃上清，加入 5 倍体积预
冷的 80%丙酮 (含体积分数 0. 07% 的 β － 巯基乙
醇)清洗， － 20 ℃静置 30 min，4 ℃、15 000 × g 离
心 30 min，弃上清，重复6 次; 冷冻冻干后于 － 70 ℃
保存。
1. 4 各组分蛋白质样品的 SDS-PAGE 电泳 采用
垂直板 SDS-PAGE 分析各分级蛋白质组分，凝胶面
积 7 cm × 7 cm，厚度 1 mm，浓缩胶为 3%，分离胶
12. 5%。样品上样量 3 μg，电泳参数为 60 V /胶
30 min 和 130 V /胶 1. 5 h。
1. 5 蛋白质裂解及定量 分别称取 5 mg 蛋白干粉
091
第 11 期 陆秀君等: PEG 分级沉淀法分析天女木兰种子的低丰度蛋白
至 500 μL 裂解缓冲液(9 mol·L － 1尿素，2 mol·L － 1
硫脲，质量分数 0. 001% 溴酚蓝，体积分数 2% IPG
Buffer，质量分数 4% CHAPS，体积分数 1% TBP，质
量分数 1% DTT，体积分数 1%鸡尾酒)中，30 ℃水
浴裂解 3 h，13 000 × g 常温离心 10 min，弃沉淀，
Bradford 法测定蛋白浓度。
1. 6 双向电泳 本试验采用 11 cm(pH 值 3 ～ 11
NL) IPG 胶条进行等电聚焦，上样量和上样体积分别
为 200 μg 和 200 μL，根据测定的裂解液中蛋白浓度，
向胶条槽中加入含有 200 μg 蛋白样品的裂解液并用
未溶解蛋白的裂解液补齐至 200 μL。将胶条胶面朝
下放入胶条槽中，水平置于 Ettan IPGphorⅢ等点聚焦
仪上，等电聚焦电泳参数: 50 V(12 h)，100 V(3 h)，
250 V(3 h)，500 V(3 h)，1 000 V(1 h)，6 000 V 升压
3 h，6 000V 聚焦 30 000 Vh，500 V(24 h)。
IPG 胶条等电聚焦后，采用两步平衡法，在平衡
液Ⅰ(6 mol·L － 1尿素，质量分数 2% SDS，体积分数
20%甘油，0. 05 mol·L － 1 Tris-HCl pH 值 8. 8，质量分
数 2%二硫苏糖醇)和平衡液Ⅱ(6 mol·L － 1尿素，质
量分数 2% SDS，体积分数 20% 甘油，0. 05 mol·L － 1
Tris-HCl pH 值 8. 8，质量分数 2. 5%的碘乙酰胺)中
各振荡平衡 15 min。平衡后进行 SDS-PAGE 电泳，
胶浓度 T = 12. 5%，电泳参数为 5 mA /胶 30 min 和
25 mA /胶 4 h。采用硝酸银染色法对凝胶进行染
色。UMAX Power look 2100XL 扫描仪采集凝胶图
像，PDQuest7. 3. 1software 软件对图像进行分析。
2 结果与分析
2. 1 PEG 分级法与全蛋白提取法比较 为了检验
分级效果，将 4 个分级组分( F1，F2，F3，F4)和全蛋
白样品 NF ( TCA － 丙酮提取法)进行垂直板 SDS-
PAEG 分析(图 2)。结果表明:不同组分间的蛋白
质谱带存在明显差异，表明种子全蛋白经过 PEG 分
级已经得到有效分离。NF 全蛋白组分中有 2 条明
显高丰度蛋白条带(33 kDa 向上箭头和 50 kDa 向
下箭头)，而在 F1，F3 组分中各有一条高丰度蛋白
条带，条带颜色较深，F1 组分中在 33 kDa 附近有 1
条高丰度蛋白条带 (向上箭头)，F3 组分在 50 kDa
附近有 2 条高丰度蛋白条带(向下箭头)。而 F2 和
F4 组分中条带分布比较均匀，在同一区域内条带较
浅，并且 F3 组分中蛋白条带较少，表明全蛋白中的
2 种高丰度蛋白主要富集在 F1 和 F3 组分中。
为了进一步检测蛋白质样品分级效果，对分级
制备的蛋白质各组分与全蛋白进行双向电泳比较，
见图 3。
图 2 PEG 分级各组分(F1 － F4)和
全蛋白(NF)的 SDS-PAGE 分析
Fig． 2 SDS-PAGE analysis of PEG classification of each
component (F1 － F4) and whole protein (NF)
M: 标准蛋白 Standard protein．
从图 3 可以看出，在 TCA －丙酮法制备的全蛋
白质图谱(图 3A)中间区域有 2 个蛋白点(向下箭
头和向上箭头)占整个图谱的面积比较大，独立蛋
白点少，特别是向上箭头指示的高丰度蛋白对低
丰度蛋白遮挡明显。而在 PEG 分级提取法蛋白图
谱(图 3B ～ E)的 2 个高丰度蛋白分别存在于 F1，
F3 组分中，在 F2，F4 组分中高丰度蛋白含量相对
减少，从而使在上样量相同的情况下，F2，F4 中的
低丰度蛋白比例增加，提高了低丰度蛋白的检
测率。
2. 2 PEG 分级组分与全蛋白 (NF)均一性分析
PEG 分级 4 个组分电泳图谱上的蛋白点有一定的重
叠，利用 PDQuest 软件对相邻组分图谱上的蛋白点
进行匹配，计算出蛋白点重叠率，见表 1。不同组分
蛋白点重叠率不同，且在 F2 和 F3 组分间蛋白点重
叠率较高。
表 1 PEG 分级相邻组分间蛋白点的重叠率
Tab． 1 Overlapping rate of PEG graded adjacent
component proteins
相邻组分
Adjacent
components
蛋白点数
Protein
spots
重叠点数
Overlapping
points
相邻组分间重叠率
Overlapping rate
between adjacent
components(% )
F1 /F2 230 /219 23 10 /10. 5
F2 /F3 219 /486 130 59. 4 /26. 7
F3 /F4 486 /835 110 22. 6 /13. 2
为了进一步评价分级组分和全蛋白质的均一
性，利用软件对分级和全蛋白进行匹配，统计结果见
表 2。由表 2 可知，通过分级后蛋白点数量明显增
多，增加了检测的低丰度蛋白点数。尽管相邻组间
191
林 业 科 学 49 卷
图 3 全蛋白(NF)和 PEG 分级组分的 2-DE 分析
Fig． 3 2-DE analysis of whole protein (NF) and PEG classification of components
A: TCA －丙酮全蛋白提取法;B，C，D，E 为分级组分 F1，F2，F3，F4。
A: TCA-acetone extraction method; B，C，D，E: PEG classification of components F1 － F4．
的蛋白点有一定重叠，但 4 个分级组分的蛋白点总
数超过 1 700 个，而全蛋白提取法有 900 个左右，各
分级组分总蛋白点中平均有 800 个点与全蛋白提取
法重叠，匹配率达到了 90% 以上，表明全蛋白仍然
分布在各分级组分中，说明分级后不仅保证了全蛋
白的完整性，而且大大增加了凝胶蛋白点的检测数
量，检测到的蛋白点数是未分级的 2 倍以上。因此，
PEG 浓度 8%和 20%有利于富集种子中的 2 种高丰
度蛋白，PEG 分级法可以作为天女木兰种子全蛋白
一种有效的提取方法。
为了验证 PEG 分级法对高丰度蛋白的分离效
果，对全蛋白和 PEG 分级组分的蛋白质双向电泳凝
胶进行比较分析，并分别在全蛋白和 F4 凝胶图像中
截取相同区域行进对比，如图 4，分级组分的蛋白点
数明显提高，全蛋白和分级蛋白组分的蛋白点数分
别为 15 和 30，很多在全蛋白质图谱中检测不到的
蛋白点经过分级后清晰可见，而且一些蛋白点的丰
度也有很显著的变化。可见蛋白样品经过分级后，
能明显提高蛋白点的检测数量和低丰度蛋白点的检
测效果。
表 2 PEG 分级检测的总蛋白点数与全蛋白点数量比较
Tab． 2 Number of PEG grading detect points of total
protein and whole protein point
重复次数
Repetitions
PEG 法总
蛋白点数
Protein spots
of the PEG
method
TCA －丙
酮法总蛋
白点数
Protein
spots of the
TCA-acetone
重叠数
Overlap
number
匹配率
Matching
rate(% )
1 1 786 868 780 89. 86
2 1 810 910 827 90. 88
3 1 714 853 812 95. 19
平均 Mean 1 770 877 806 91. 98
3 结论与讨论
蛋白质样品的制备是蛋白质组学的关键步骤，
而植物样品中不同蛋白质的数量差异很大，细胞内
蛋白丰度的动态变化范围可达到 6 个数量级(Grg
et al．，2004)。例如植物叶片中参与光合碳同化的
关键酶 Rubisco，在叶片中的含量超过 50% ; 种子内
储藏物质的重要组分———储藏蛋白，由于其含量大，
也会遮挡低丰度蛋白的检测。因此，应根据样品和
试验目的的不同，采取不同的和有针对性的样品制
291
第 11 期 陆秀君等: PEG 分级沉淀法分析天女木兰种子的低丰度蛋白
图 4 凝胶局部区域 PEG 分级法与 TCA －丙酮法提取蛋白点数目比较
Fig． 4 Number of protein spots of gel local area PEG grading and TCA-acetone extraction
A: TCA －丙酮全蛋白提取法 TCA-acetone extraction method．
B: PEG 分级 F4 组分 PEG classification of components F4．
备方法。有研究发现，PEG 浓度为 15%时能有效富
集水稻叶片中高丰度蛋白 Rubisco 和种子中的高丰
度蛋白(Kim et al．，2001); PEG 浓度为 16%时能有
效富集拟南芥中的高丰度蛋白 Rubisco ( Xi et al．，
2006); 20% PEG 沉淀适用于灌浆期水稻叶鞘低丰
度蛋白的检测(王莹等，2011); PEG 浓度为 15%时
能富集甜瓜叶片中的大部分 Rubisco 酶 (钟俐等，
2012); PEG 浓度为 24%时能有效富集黄瓜叶片中
的高丰度蛋白 Rubisco(任丽萍等，2011)。大豆、芒
草、卷心菜、花生、野茶树叶片中的 Rubisco 酶主要
富集在 15%的 PEG 组分中(Alam et al．，2013)。
本试验中利用 PEG 分级法将天女木兰种子蛋
白样品分离成 4 个组分，能有效地把种子中的高丰
度蛋白分别富集在单一组分内，提高了低丰度蛋白
的检测率。利用这种方法，4 个组分蛋白点总数超
过 1 770 个，是未分级样品的 2 倍以上，发现许多在
常规提取方法下无法检测到的低丰度蛋白点。本研
究建立了适合天女木兰种子蛋白质样品分级沉淀的
方法，有利于种子蛋白质组学的深入研究。但试验
中 PEG 各分级组分与 TCA － 丙酮法约有 10%的蛋
白点不匹配，可能有以下 3 个方面原因: 1) 蛋白点
在多步骤分级提取过程中造成损失; 2) PEG 分级
沉淀法与 TCA －丙酮法在原理上有一定差异，三氯
乙酸是一种表面活性剂，其沉淀原理是利用蛋白质、
酶和核酸等生物大分子对某些物理或化学因素敏感
性不同，有选择地使之变性沉淀，以达到分离提纯的
目的。聚乙二醇是非离子多聚物，沉淀原理是使生
物大分子在同一液相中，由于被排斥相互凝聚而沉
淀析出(Atha et al．，1981); 3) 多个分级组分同时
等电聚焦，相互干扰，造成聚焦不完全。样品中的杂
质会影响蛋白的溶解和等电聚焦，其中盐含量对聚
焦效果的影响最严重(Rabillod，1996)，本试验是 4
个组分(F1 － F4)同时聚焦，由于不同样品中的盐浓
度不同，必然会影响等电聚焦效果，其中 F4 组分聚
焦效果较差。通过后期大量试验发现，上清(F4)组
分单独进行聚焦时，效果明显好于各组分同时聚焦，
分级组分中上清(F4)对聚焦条件要求较高，因此认
为，2 种提取方法蛋白点不匹配，可能是由于样品中
的盐含量高，同时等电聚焦相互干扰所致。
在试验中可根据需要调整 PEG 浓度和梯度，达
到分离高丰度蛋白的效果。考虑到 F2 组分蛋白点
较少，且 F2 和 F3 蛋白点的重叠率较高，故将 F2，F3
组分合并。在提取天女木兰种子蛋白样品时可选择
PEG 浓度在 8%，20% 2 个浓度梯度和上清液 3 个
组分来进行蛋白样品沉淀。
后期经过质谱鉴定发现，本试验 TCA － 丙酮提
取法电泳图谱中的高丰度蛋白为豆球蛋白，豆球蛋
白是豆科和非豆科植物种子中主要的储藏蛋白。分
级沉淀提取法有效去除了天女木兰种子中高丰度蛋
白对低丰度蛋白的干扰。天女木兰种子萌发过程中
差异蛋白点比较发现，经过 PEG 分级处理后，高丰
度蛋白遮挡位置存在差异蛋白点，经质谱鉴定为丝
氨酸羧肽酶和 S － 腺苷甲硫氨酸合成酶，这 2 种低
丰度蛋白与种子萌发( Lehfeldt et al．，2000)和蛋白
391
林 业 科 学 49 卷
质合成(Tabor et al．，1985)合成代谢相关。试验结
果表明低丰度蛋白很可能是与重要特征或生理功能
相关的调控蛋白，从它们着手更容易找到植物生理
调节机制的突破口，因此，低丰度蛋白的分离和鉴定
尤为重要。
尽管本方法在分级后获得了更多的蛋白质点用
于蛋白质组分析，但需根据试验需要，结合其他方
法，以获得不同类型的蛋白质。
参 考 文 献
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(责任编辑 郭广荣)
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