全 文 ：第 50 卷 第 8 期
2 0 1 4 年 8 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 50，No. 8
Aug．，2 0 1 4
doi:10．11707 / j．1001-7488．20140821
收稿日期: 2013 － 07 － 09; 修回日期: 2013 － 11 － 28。
基金项目: 国家自然科学基金项目(30671657) ; 江苏省研究生培养创新工程项目(CXLX13 － 506) ; 江苏高校优势学科建设项目(PAPD)。
* 尹增芳为通讯作者。
管状分子分化离体培养系统的建立及影响因素*
杜玉梁 刘彩虹 陈 叶 尹增芳
(南京林业大学森林资源与环境学院 南京 210037)
摘 要: 管状分子是植物木质部的主要组成成分，具有复杂的形态学特征，在植物的生长发育过程中发挥重要作
用。在离体培养条件下，植物细胞可以通过分化或转分化的方式形成管状分子，为此建立了百日草、拟南芥、杨树
等离体培养模式系统，用于观测管状分子分化细胞形态结构特征的变化以及相关影响因子的调节作用，并取得较
大的进展。研究资料表明:离体条件下不同植物细胞分化形成管状分子培养条件不同，其中植物激素、木质形成
素、渗透压、Ca2 +、起始细胞密度、pH 等均参与管状分子的分化调控。迄今为止，百日草系统是研究管状分子分化
较为成熟的系统，而杨树系统是研究管状分子分化最具前景的林木模式系统。这些模式系统的建立可为单细胞水
平上研究管状分子的分化提供极好的平台，从而可在分子水平上认识细胞分化进程及其调节机制，最终达到木材
改良的目的。
关键词: 管状分子; 离体培养系统; 细胞分化; 影响因素
中图分类号: S718. 43 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2014)08 － 0146 － 08
Establishment and Influencing Factors of in vitro Culture System
for Tracheary Elements Differentiation
Du Yuliang Liu Caihong Chen Ye Yin Zengfang
(College of Forest Ｒesources and Environment，Nanjing Forestry University Nanjing 210037)
Abstract: Tracheary elements (TEs) are main component in the xylem that are highly specialized for transporting water
and solutes up the plant during plant growth and development，and have complex morphological characteristics． The
mature plant cells can be converted into TEs by processes of differentiation or transdifferentiation in an appropriate vitro
system． Ｒecently constructed of vitro culture systems for Zinnia，Arabidopsis，Populus and other species have been
facilitating our observation of the morphological changes during TEs differentiation and understanding the factors that
influence the differentiation process． Previous researches indicated that TEs differentiation processes vary with plant cells，
and many factors such as phytohormone，xylogen，Ca2 +，osmotic pressure，initial cell population density，pH and so on，
play great roles in regulating TEs differentiation． At present，the Zinnia vitro culture system is the relatively mature system
for observing TEs differentiation while Populus system is the most promising system for woody plant． These model systems
provide an excellent platform for study of TEs differentiation at single cell level，and greatly advance our understanding of
TEs differentiation process and its control mechanism at the molecular level for ultimate goals of wood improvement．
Key words: tracheary element; in vitro culture system; cell differentiation; influencing factors
管状分子( tracheary elements，TEs)是高度特化
的细胞，在形态结构、生化和分子组成、发育及生理
功能上都具有明显的特点，是植物解剖学、发育生物
学和细胞生物学的研究热点之一。管状分子包括导
管和管胞 2 种类型，导管经端壁分化形成穿孔板再
融合构成导管，管胞则通过细胞壁上的纹孔进行细
胞间物质的转运，从而实现植物体内横向、纵向运输
水分与矿物质的功能以及机械支撑等重要作用。形
成层细胞经过细胞扩增、次生壁沉积、胞内物质自
溶、形成端壁穿孔等步骤形成管状分子 ( Turner et
al．，2007; Yin et al．，2009)。多年来，学者们建立了
整体试验系统和离体试验系统，对维管系统进行一
定的解剖学和生理学观察检测，并初步研究维管组
织发育的分子机制与调控机制 (尹增芳等，2000;
第 8 期 杜玉梁等: 管状分子分化离体培养系统的建立及影响因素
王洁华等，2009)，其中利用草本植物和木本植物建
立了细胞分化离体试验系统，如百日草 ( Zinnia
elegans)(Fukuda et al．，1980; Church et al．，1988a;
Church et al．，1989; Ｒoberts et al．，1992; Twumasi et
al．，2010)、拟南芥 ( Arabidopsis thaliana) ( Encina et
al．，2001; Ｒichard et al．，2001; Alonso et al．，2003;
Motose et al．， 2004; Oda et al．， 2005 )、杨 树
(Populus ) ( Ohlsson et al．，2006; 马清滢，2011;
Yamagishi et al．， 2013 )、花 旗 松 ( Pseudostuga
menziesii)(Pillai et al．，2011)等模式系统，在研究细
胞分化的形态发育过程、生理生化与分子机制等工
作上取得一定的进展。本文就近 20 年来管状分子
分化离体培养系统的建立及影响因素进行概括总
结，并对今后这一领域的研究提出一些战略性设想。
1 管状分子分化的离体培养模式系统
在诱导管状分子分化的多种离体培养系统(表
1)中，百日草叶肉细胞离体培养系统是目前分化效
果最好的试验系统。该系统开创性地展现了离体条
件下管状分子分化的基本过程，为进一步了解管状
分子分化的生理及分子机制奠定基础。此后，众多
学者相继改进培养条件，使百日草系统管状分子分
化率进一步提高。目前已经确定多种参与管状分子
分化的基因(表 2)。利用百日草离体系统，Pesquet
等(2005)通过抑制性消减杂交( SSH)构建后期木
质部发生文库 ( LXL)。 LXL 包含 236 个非重复
cDNA，在 TE 分化过程中有 77%的 cDNA 编码与已
知表达序列标签不同的新序列，极大地丰富了管状
分子分化后期特定表达的基因类型。另外，还从百
日草系统培养液中获得一种管状分子分化抑制因子
(TDIF)，对管状分子的分化具有一定的抑制作用
( Ito et al．，2006)。
拟南芥具有相对较小的基因组、丰富的突变体
资源，使其成为植物发育生物学研究模式植物
(Encina et al．，2001; Ｒichard et al．，2001; Alonso et
al．，2003)。与百日草系统相比，拟南芥系统没有实
现管状分子的高分化率和高同步性，但是它也有自
身的优点，比如系统简单，可重复利用反复继代过的
悬浮培养细胞，无需从完整植株中重复获取新鲜的
细胞进行悬浮培养(Oda et al．，2005)，所以拟南芥
系统是除了百日草系统之外可用于研究管状分子分
化的又一草本植物离体培养系统。
杨树作为林木研究的模式植物，其基因组测序
已经完成(Tuskan et al．，2006)，利用转基因技术可
以实现快速转基因(Busov et al．，2005)，其解剖学背
景研究较详细(尹增芳等，2000; Yin et al．，2009)，
是林木发育生物学功能基因验证极好的平台。目前
利用‘南林 895 杨’(Populus × euramericana‘Nanlin
895’)、欧美杂种山杨(P． tremula × P． tremuloides)
的愈伤组织为试验材料，建立了游离细胞悬浮培养
系统，证实在离体培养条件下可以实现杨树单细胞
诱导分化形成管状分子的目标 (马清滢，2011;
Ohlsson et al．，2006)，但是分化的同步性不如百日
草系 统。此 外，杂 交 黑 杨 ( P． sieboldii × P．
grandidentata)叶柄愈伤组织也可体外诱导形成管
状分子 (Yamagishi et al．，2013)。
花旗松愈伤组织离体培养系统，可作为研究裸
子植物松柏科植物初生壁、次生壁形成过程中管状
分子分化的模式系统。Pillai 等(2011)利用花旗松
枝条形成层诱导的愈伤组织，分别建立了管状分子
分化的固体培养和液体悬浮培养系统。花旗松的培
养细胞在形成管状分子过程中，随着细胞分化程度
的提高，木糖和甘露糖含量升高，木糖和甘露糖参与
次生壁的构成(Fengel et al．，1989)。类似的结果也
在樟子松(Pinus sylvestris var． mongolica)和辐射松
(Pinus radiata)管状分子分化进程中加以证实，其
细胞壁单糖组分中葡萄糖、木糖、甘露糖含量均有所
上升(Mller et al．，2003)。
2 管状分子分化中的影响因素
管状分子分化过程中受多种因素的调节控制，
植物激素、木质形成素、Ca2 +、渗透压、起始细胞密
度及 pH 等多种信号分子均参与其中，信号分子之
间相互作用，每种因素既不独立存在，所起的作用也
不能被单独看待。采用上述草本、木本离体培养系
统等研究方法，在揭示管状分子分化过程中所涉及
的影响因子及其调控作用等方面取得了一定的进展
(表 3)。
2. 1 植物激素
植物激素及生长调节剂几乎都参与了管状分子
的分化。通常认为生长素是管状分子分化的一个基
础性诱导因子，在百日草细胞分化系统中生长素不
可或缺 ( Fukuda et al．，1980; 1988a; Church et al．，
1988b; Milioni et al．，2001)。Fukuda 等(1980)认为
植物激素对管状分子的形成是必需的，在其最先建立
的百日草叶肉细胞离体培养系统含有 0. 1 mg·L － 1
NAA 和 1 mg·L － 1 6-BA，最终实现 30%左右的分化
率。Church 等(1988b)研究了生长素和细胞分裂素
不同浓度组合对管状分子分化的诱导效果，发现
0. 5 μmol·L － 1 NAA 和 0. 5 μmol·L － 1 6-BA 搭配
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林 业 科 学 50 卷
表 1 管状分子分化离体培养模式系统
Tab. 1 TEs differentiation culture system in vitro
离体培养模式系统
In vitro culture model system
培养材料
Materials
研究成果
Ｒesults
参考文献
Ｒeferences
草本植物
Herbaceous
plant
百日草
Zinnia elegans
拟南芥
Arabidopsis
thaliana
离体叶肉细胞
Isolated
mesophyll cells
首次建立管状分子分化离体培养系统，分化率为 30%
Established the TEs differentiation culture system in vitro
firstly ． The highest differentiation rate of TEs was about to 30%
Fukuda
et al．，1980
离体叶肉细胞
Isolated
mesophyll cells
对百日草系统进行简化，得到与 Fukuda 初始培养系统相当
甚至略高的管状分子分化率
Fukuda’s system was optimized． The differentiation rate of TEs
is similar or even higher
Ｒoberts
et al．，1992
离体叶肉细胞
Isolated
mesophyll cells
改进百日草系统培养基成分，最大分化率为 76%，且试验
结果稳定、可重复
Application of this improved culture method resulted in stable
and reproducible amounts of TEs as high as 76%
Twumasi
et al．，2009
叶片组织
Leaf disks
只有部分叶肉细胞分化为管状分子，同步性及分化率不高
Only part of the mesophyll cells differentiated into TEs．
Induced differentiation in leaf disks is thus less synchronous
than in suspension culture of Zinnia mesophyll cells
Church
et al．，1989
离体叶肉细胞
Isolated
mesophyll cells
培养 72 h 后叶肉细胞次生壁开始形成，管状分子达最高分化率
约为 30%
The secondary walls were simultaneously observed in a 72 h-cultured
cell． The highest differentiation rate of TEs was about to 30%
Oda et al．，
2005
木本植物
Ligneous
plants
‘南林 895 杨’
P． euramericana
‘Nanlin895’
茎段诱导的愈伤
Callus derived
from stem cutting
适宜的初始细胞密度、培养液成分与渗透压，可以实现杨树
单细胞诱导分化形成管状分子的目标
TEs could be induced from single mesophyll cells of Populus with
suitable cell density，medium composition and osmotic pressure
马清滢，2011
杂交黑杨
P． sieboldii ×
P． grandidentata
叶柄诱导的愈伤
Callus derived
from petioles
诱导获得的管状分子中一部分类似初生木质部管状分子，
另一部分类似次生木质部管状分子
The TEs induced were partly similar to TEs of second xylem and
other TEs induced were partly similar to TEs of primary xylem
Yamagishi
et al．，2013
欧美杂种山杨
Populus tremula ×
P． tremuloides
茎段诱导的愈伤
Callus derived from
stem cutting
悬浮培养细胞的稳定增长期观测到管状分子的分化
The TEs were observed in their stationary phase through
inspection of the cell suspension cultures
Ohlsson
et al．，2006
花旗松
Pseudostuga
mensziesii
枝条形成层诱导的
愈伤
Callus derived from
cambial tissue isolated
from branches
建立木本植物管状分子分化的固体培养和液体悬浮培养系
统，65%的细胞分化形成管状分子类似细胞
This research successfully established solid and liquid culture
system of woody TEs differentiation． Approximately 65% of the
callus cells differentiated to TE like cells
Pillai
et al．，2011
使用，培养 3 天后可实现 53%的最大管状分子分化
率。Sato 等(2011)在含有 0. 1 μmol·L － 1 NAA 和
0. 2 μmol·L － 1 6-BA 的培养液中，观察发现有 25%
～ 40%的百日草叶肉细胞分化为管状分子。Milioni
等(2001)证实刚分离的百日草叶肉单细胞，在不含
有任何植物激素的基本培养基中培育时间即将达到
48 h 时，转移至含有1 mg·L － 1生长素和细胞分裂素
的培养液中处理 5 ～ 10 min，96 h之后足以诱导管状
分子的同步分化，但是在只有生长素或细胞分裂素
的培养液内培养的细胞则不会有相应的分化效果。
这一现象表明适宜浓度的生长素、细胞分裂素，对于
管状分子形成的某一关键阶段必不可缺，而且细胞
分裂素需要结合生长素才能在管状分子分化过程中
促进其分化 ( Fukuda，1997; 2004; Turner et al．，
2007; Ohashi-Ito et al．， 2010; Hirakawa et al．，
2011)。
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第 8 期 杜玉梁等: 管状分子分化离体培养系统的建立及影响因素
表 2 百日草叶肉细胞管状分子离体分化过程中的特异性表达基因
Tab. 2 Specific expressed genes during TEs differentiation of Zinnia mesophyll cells in vitro
分化进程
Differentiation
process
特异性表达基因
Specific
expressed genes
基因功能与表达状况
Gene function
and expression
参考文献
Ｒeferences
时期Ⅰ
StageⅠ
(0 ～ 24 h)
ZePI － 1，ZePI － 2，
ZePAL1，ZePAL2，
ZePAL3
ZePI － 1 /2 编码蛋白酶抑制剂; ZePAL1 － 3 编码损伤刺激诱导的基因
ZePI － 1 and ZePI － 2 encode protease inhibitors． ZePAL1，ZePAL2，ZePAL3
encode genes which injury induced
Fukuda，1996;
1997; 2000
时期Ⅱ
Stage Ⅱ
(24 ～ 48 h)
TED2
TED4
TED3
TED2，TED4，TED3 依次表达于原形成层细胞、分化中或即将分化的木
质部细胞、正在分化或具有分化潜能的 TEs，分别编码疏水蛋白、脂质
转运蛋白、细胞壁蛋白
TED2， TED4， TED3 expressed specifically in procambial cells，
differentiating or upcoming differentiation xylem cells，differentiating TEs or
TEs with differentiation potential， respectively． These genes encode
hydrophobic protein，lipid transfer protein，cell wall proteins，respectively
Demura et al．，1993; 1994
时期Ⅲ
Stage Ⅲ
(48 ～ 96 h)
ZePAL1，ZePAL2，
ZePAL3，ZEN1，
ZＲNaseI
ZCP4，p48h － 17
ZPO-C
ZePAL1 － 3 编码与木质素合成相关酶; ZEN1，ZＲNase1 编码核酸酶;
ZCP4，p48h － 17 编码半胱氨酸蛋白酶; ZPO-C 编码过氧化物酶。
上述基因表达后，诱导次生壁沉积和细胞程序性死亡，完成 TEs 分化
ZePAL1，ZePAL2，ZePAL3 encode enzymes for lignin biosynthesis． ZEN1
and ZＲNase1 encode a nuclease and an ＲNase． ZCP4 and p48h － 17 encode
a cysteine protease． ZPO-C encodes a peroxidase． After the above
expression，induced secondary wall deposition and programmed cell death
and completed the TEs differentiation
Fukuda et al．，1982;
Fukuda，1996; 1997;
2000
芸苔素内酯在培养的百日草细胞及其培养液之
间起媒介作用。芸苔素内酯生物合成过程中的许多
中间产物在管状分子形态建成之前急剧增多，说明
百日草系统中初始的植物激素(生长素和细胞分裂
素)可以引起芸苔素内酯的合成 ( Iwasaki et al．，
1991)。对菊芋 ( Jerusalem artichoke)块茎培养的研
究发现，外源芸苔素内酯可以加快管状分子的分化，
并认为芸苔素内酯在分化的后期阶段发挥作用
(Clouse，1996)。将芸苔素内酯的一种生物合成抑
制剂烯效唑添加到百日草细胞培养液内，管状分子
分化受到抑制，而添加外源芸苔素内酯则可以克服
这一抑制现象(Yamamoto et al．，1997; Turner et al．，
2007); 芸苔素唑也可以抑制木质部分化，这一现象
同样可以通过外施油菜素甾醇类物质得以恢复
(Asami et al．，2000)。此外，Yamagishi 等(2013)认
为在拟南芥细胞悬浮培养系统中，细胞培养在含有
1 μmol·L － 1芸苔素内酯、不含生长素的培养基中，管
状分子分化率可达 30%。
除了生长素、细胞分裂素、芸苔素内酯之外，在
整体培养系统中通过转基因植株表达性状分析，已
了解到其他植物激素 (如乙烯、赤霉素、脱落酸、茉
莉酸)均参与管状分子分化 (Eriksson et al．，2000;
Pesquet et al．，2011)，但是在离体培养系统中并没有
进行具体分析，调节机制不十分清楚。
2. 2 木质形成素
利用生物化学方法从培养的百日草正在转分化
的叶肉细胞中，分离获得一个被称之为木质形成素
( xylogen)的复合物，目前认为其是木质部发育过程
中新的调节因子，这一蛋白质(ZeXYP1)包含 1 个 N
端糖基位点、1 个信号肽、1 个假定的糖基磷脂酰肌
醇位点，这些结构均符合阿拉伯半乳聚糖蛋白
(AGPs ) 的特点 ( Motose et al．，2004 )。从 烟 草
(Nicotiana tabacum)细胞中分离获得的木质形成素，
可以在百日草细胞培养系统中促进管状分子分化
(Motose et al．，2004)。在百日草系统中，木质形成
素从已发生木质化的细胞分泌至未发生木质化的细
胞中，引起原形成层细胞分化的连续性，提升木质部
组织的连通性(Hirakawa et al．，2011)。
关于木质形成素在管状分子分化中的作用，可
经下述假说进一步解释: 由于木质形成素的出现，
邻近的细胞被吸引、诱导至管状分子分化的路径中，
与此同时这些细胞又产生更多的木质形成素，如此
往复形成一个积极的反馈调节机制 ( Fukuda，
2004)。木质形成素效应可能依赖于与细胞极性相
关的信号路径或者其他不明确的路径(Motose et al．，
2004)。
2. 3 Ca2 +
在百日草系统中，Ca2 +由游离状态变为束缚状
态时伴随着管状分子细胞壁的加厚(Ｒoberts et al．，
1989)。Ｒoberts 等(1990)发现将培养液中 CaCl2 浓
度由 1 mmol·L － 1降至 0. 2 mmol·L － 1时，管状分子平
均分化率下降 20%，培养液无 CaCl2 的情况下，管状
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林 业 科 学 50 卷
分子平均分化率下降 78%，继续添加 CaCl2 至
1 mmol·L － 1，管状分子分化停止下降并转为上升，分
化率可由 13. 8%上升至 21. 8%。上述试验说明，胞
外 Ca2 +的吸收对于百日草系统管状分子的分化是
必需的。由于培养液中还含有 Mg2 +，Mn2 + 等可以
阻塞 Ca2 +通道的物质，所以该系统培养基成分中
Ca2 +含量一般相对较高。Ca2 + 对‘南林 895 杨’管
状分子分化作用的研究也得出类似的结果，一定浓
度的 Ca2 +对‘南林 895 杨’悬浮培养细胞管状分子
分化的诱导起到促进作用，而且不同来源的悬浮培
养细胞所需的外源 Ca2 + 浓度也有所不同，添加
1 mmol·L － 1 CaCl2 培养 6 天后，来自于愈伤组织的
悬浮细胞管状分子分化率高达 53. 18% ; 添加
0. 25 mmol·L － 1 CaCl2 培养 8 天后，来自‘南林 895
杨’叶肉细胞的管状分子分化率可达到最高，约为
24. 57% (马清滢，2011)。
2. 4 渗透压
在管状分子分化离体细胞悬浮培养系统内，不
同类型的游离单细胞在管状分子分化进程中需要适
宜的渗透压以保持细胞活力。‘南林 895 杨’愈伤
组织游离单细胞在甘露醇浓度 0. 1 ～ 0. 15 mol·L － 1
时，培养 96 h 后细胞活力仍保持最大，而叶肉单细
胞在甘露醇浓度 0. 01 ～ 0. 02 mol·L － 1时培养活力最
大(马清滢，2011)。在不添加甘露醇的条件下培养
百日草叶肉单细胞，管状分子的分化会被抑制
(Fukuda et al．，1980)。由于胞内渗透压的影响，百
日草游离叶肉细胞培养过程中会出现不同的管状分
子分化率，说明适宜的渗透压是管状分子分化良好
的前提条件(Lee et al．，2004)。
植物材料的渗透压也会影响离体培养时管状分
子的产量和形态。13 ～ 15 天龄百日草的第 1 枚完
全伸展的叶片，在光强从 50 μmol·m － 2 s － 1增至 100
μmol·m － 2 s － 1时，叶片渗透压增加 17%，使得最终管
状分子分化率增加 116%。此外，百日草根系环境
电导率为 4 dS·m － 1时，培养后叶肉细胞管状分子分
化率高达 75% ( Twumasi et al．，2010)。因此，光强
和根系环境的电导率能够影响百日草植株的叶片渗
透压，具有不同渗透压的叶片又会影响离体培养进
程中管状分子的发育及形态。
与甘露醇的作用类似，蔗糖也可用于管状分子
分化的渗透压调节。蔗糖不仅提供了细胞生长所必
需的碳源，而且还能保持培养液适当的渗透压。浓
度过低，不仅得不到充足的碳源保证，而且会发生营
养物质外渗现象，最终导致细胞死亡; 浓度过高，也
会因为细胞内水分外渗而出现生理性缺水现象(李
建安等，2006 )。蔗糖可以影响洋丁香 ( Syringa
vulgaris)组织培养过程中维管组织的发生，培养基
内蔗糖浓度为 1%时，愈伤组织中木质部数量很少;
蔗糖浓度为 2% 时，木质部形成，韧皮部不能形成;
浓度为 2. 5% ～ 3. 5% 时，木质部和韧皮部都能形
成; 蔗糖浓度为 4%时，韧皮部形成，木质部不能形
成(Wetmore et al．，1955)。这说明蔗糖浓度可能是
通过调节渗透压来影响所培养细胞的生长、发育和
分化。
2. 5 起始细胞密度
细胞培养起始密度对叶肉细胞的分化也有较大
影响。悬浮培养系统中细胞生长具有群聚效应，细
胞密度太低，生长缓慢，死亡率高; 细胞密度过高，
容易积累有害分泌物。适宜的起始细胞密度应该是
既能使细胞达到最佳生长速率，又不会引起养分的
过渡消耗和有害物质的积累(吴晓玲等，2002)。在
众多的管状分子离体培养系统中，均严格控制起始
细胞密度，一般情况下 105 个·mL － 1是起始细胞密
度的最佳选择。如 Fukuda 等(1980)建立的百日草
悬浮培养系统，起始细胞密度为 0. 4 × 105 ～ 3. 3 ×
105 个·mL － 1时管状分子分化较好，并且同步性较
高，起始细胞密度降低，管状分子分化率随之降低。
Twumasi 等(2009)采用 105 个·mL － 1的起始细胞密
度，管状分子分化率高达 76% ; Church 等(1988a)
采用起始细胞密度 1. 5 × 105 个·mL － 1，观察叶肉细
胞转分化的动态进程效果较好; 马清滢(2011)试验
证明，‘南林 895 杨’叶肉细胞起始密度在 5 × 105 ～
5 × 106 个·mL － 1之间时，细胞分散均匀，且活力保存
的时间较长。
2. 6 pH
通常情况下，百日草系统培养液 pH 设定为
5. 5，随着培养时间的延长，pH 会在 4. 8 ～ 5. 6 之间
变动，在出现细胞次生壁加厚之前，培养液 pH 降至
最低。较高的 pH 会抑制管状分子分化，但会引起
细胞体积扩增(Ｒoberts et al．，1994)。不同 pH 对新
疆紫草( Arnebia euchroma)悬浮培养细胞生长有所
影响，适合紫草细胞生长的 pH 在 7. 25 ～ 9. 5 之间
(Malik et al．，2011)。因此，pH 对悬浮培养细胞的
生理、生化活性影响显著，从而决定细胞生长状况与
分化进程。
一般地，通过改变培养体系中营养状况、植物激
素水平以及其他化学因子等成分，可以获得相对较
高的管状分子分化率。不同植物材料离体培养系统
管状分子分化的稳定性及高效性不同。在细胞离体
培养过程中，植物材料选择是首要的条件，保持一定
051
第 8 期 杜玉梁等: 管状分子分化离体培养系统的建立及影响因素
的细胞起始密度，维系一定的渗透压，保持一定的
pH 水平，是管状分子分化培养的先决条件，而实现
植物激素及其他生长调节物质的合理配比则是管状
分子分化的必要条件。因此只有在各个因素综合平
衡的条件下，才能完成体外管状分子分化的分化
进程。
表 3 管状分子分化过程的影响因素
Tab. 3 Influencing factors of TEs Differentiation
影响因素
Influencing factors
TE 分化效应
TE differentiation effect
参考文献
Ｒeferences
植物激素和
植物生长调
节剂
Plant hormones
and plant growth
regulator
生长素
Auxin
不可或缺
Indispensable
细胞分裂素
Cytokinin
单独使用无效，与生长素协同作用可达到较高的管状分
子分化率
Cytokinin alone is invalid and must combine with auxin． The
appropriate combination of pretreatment concentrations can
achieve a higher rate of TEs differentiation
芸苔素内酯
Brassinolide
作用于 TE 分化后期，促进 TE 分化，其生物合成抑制剂
可抑制 TE 分化，添加外源芸苔素内酯则恢复 TE 分化
Brassinolides are required for the later stages of TEs
differentiation and promote TEs differentiation． The addition
of inhibitor of BＲs blocks the transdifferentiation of TE and
the addition of exogenous BＲs can eliminate the inhibition
乙烯、赤霉素、脱
落酸、茉莉酸
Ethylene，
Gibberelline，
abscisic acid，
jasmonic acid
均参与 TE 分化，大都需要结合生长素使用
They are involved in TEs differentiation，but they need to
combine with auxin
Fukuda et al．，1980; Church et al．，1988a;
1988b; Milioni et al．， 2001; Sato et
al．，2011
Clouse，1996; Asami et al．，2000; Milioni
et al．，2001; Yamagishi et al．，2013
Eriksson et al．，2000; Pesquet et al．，2011
木质形成素
Xylogen
由已发生木质化的细胞分泌，促进未发生木质化的细胞
分化形成 TE
Xylogen derives from lignified cells and accelerates
TE differentiation
Fukuda， 2004; Motose et al．， 2004;
Hirakawa et al．，2011
Ca2 +
TE 分化所必需的，作用于 TE 分化过程中次生壁的沉
积，一定范围内，随 Ca2 + 浓度的升高，TE 分化率升高
Calcium ion accompanies the onset of cell wall thickening in
TEs developing． TEs differentiation rate increases with
increasing calcium ion concentration within a certain range
Ｒoberts et al．，1990; 马清滢，2011
渗透压
Osmotic
pressure
甘露醇
Mannitol
蔗糖
Sucrose
调节渗透压
Ｒegulate the osmotic pressure
Twumasi et al．，2010; 马清滢，2011
Wetmore et al．，1955; 李建安等，2006
起始细胞密度
Initial cell
density
105 个·mL － 1为最佳的起始细胞密度
The best initial cell density is 105 cells·mL － 1
Fukuda et al．，1980; Twumasi et al．，2009;
马清滢，2011
pH
5. 5 为最适 pH
The optimum pH value is 5. 5
Ｒoberts et al．，1994
3 展望
综上所述，管状分子分化离体培养系统的研究
在草本、木本植物中已广泛展开，这些系统为诱导和
促进管状分子分化的研究建立了有效的平台，并获
得了一定数目的关键基因和调节因子，初步揭示管
状分子分化的分子机制，使得在单细胞水平上认识
细胞分化与转分化路径、分化过程影响因素的作用
成为可能，但复杂、精确的分子机制的构建仍需要进
行深入探索。管状分子分化具有复杂的时空特异
性，具备庞大的综合调控网络，尽管植物激素中生长
素、细胞分裂素作为管状分子分化的基本调节因素，
开展了大量的研究并取得一定成果，但其他几种激
素如赤霉素、乙烯和脱落酸等作用效果研究资料极
少，植物激素作用机制的研究尚未明确。在所有离
体培养模式系统中，百日草系统研究较为成熟，管状
151
林 业 科 学 50 卷
分子分化率及同步性较高，其他植物系统管状分子
分化的诱导和促进效果均有待于进一步提升，尤其
是作为木本植物模式物种的杨树，进一步改进优化
其游离单细胞的离体培养方法、确定管状分子分化
最佳条件、提高管状分子分化率及其同步性具有重
要意义，在此基础上识别参与调节管状分子分化的
相关的基因及蛋白质，掌握不同影响因素的分子机
制及信号转导网络，进而为木本植物管状分子发育，
特别是木材形成的内在分子机制提供基本理论资
料。此外，利用先进的技术手段，综合分子生物学、
细胞生物学、生物信息学及系统生物学研究方法，多
学科、多角度展开研究工作，更全面地了解管状分子
分化的动态过程和调节机制，可以在分子水平上实
现人为调控管状分子发育过程，达到改良木材材性
的最终目标。
参 考 文 献
李建安，胡芳名 ． 2006． 拟南芥悬浮细胞生长特性及其继代培养条
件 ． 经济林研究，24 (1) : 26 － 29．
马清滢 ． 2011． 南林‘895 杨’管状分子分化离体培养体系的构建 ．
南京:南京林业大学硕士学位论文 ．
王洁华，卢孟柱 ． 2009． 木本植物次生维管系统形态建成的基因调
控与信号转导研究进展 ． 林业科学，45 (11) :127 － 134．
吴晓玲，邓光存，丁向真 ． 2002． 植物细胞次级代谢产物生产条件的
调控 ． 生物学通报，37 (12) : 56 － 58．
尹增芳，樊汝汶 ． 2000． 杨树维管组织细胞生物学研究进展 ． 南京林
业大学学报，24 (6) : 83 － 88．
Alonso J M，Stepanova A N，Leisse T J， et al． 2003． Genome-wide
insertional mutagenesis of Arabidopsis Thaliana． Science， 301
(5633) : 653 － 657．
Asami T，Min Y K，Nagata N， et al． 2000． Characterization of
brassinazole，a triazole-type brassinosteroid biosynthesis inhibitor．
Plant Physiol，123(1) : 93 － 100．
Busov V B，Brunner A M，Meilan Ｒ， et al． 2005． Genetic
Transformation: A powerful tool for dissection of adaptive traits in
trees． New Phytol，167(1) : 9 － 18．
Church D L，Galston A W． 1988a． Kinetics of determination in the
differentiation of isolated mesophyll cells of Zinnia elegans to
tracheary elements． Plant Physiol，88(1) : 92 － 96．
Church D L，Galston A W． 1988b． Hormonal induction and antihormonal
inhibition of tracheary element differentiation in Zinnia cell cultures．
Phytochemistry，27 (8) : 2435 － 2439．
Church D L，Galston A W． 1989． Hormonal induction of vascular
differentiation in cultured Zinnia leaf disks． Plant Cell physiol，
30(1) : 73 － 78．
Clouse S D． 1996． Molecular genetic studies confirm the role of
brassinosteroids in plant growth and development． The Plant
Journal，10(1) :1 － 8．
Demura T，Fukuda H． 1993． Molecular cloning and characterization of
cDNAs associated with tracheary element differentiation in cultured
Zinnia cells． Plant Physiol，103(3) : 815 － 821．
Demura T，Fukuda H． 1994． Novel vascular cell-specific genes whose
expression is regulated temporally and spatially during vascular
system development． The Plant Cell，6(7) : 967 － 981．
Encina C L，Constantin M，Botella J． 2001． An easy and reliable method
for establishment and maintenance of leaf and root cell cultures of
Arabidopsis thaliana． Plant Molecular Biology Ｒeporter，19 ( 3 ) :
245 － 248．
Eriksson M E，Israelsson M，Olsson O，et al． 2000． Increased gibberellin
biosynthesis in transgenic trees promotes growth，biomass production
and xylem fiber length． Nature Biotechnol，18(7) : 784 － 788．
Fengel D，Wegener G． 1989． Wood-chemistry，ultrastructure，reactions．
New York: Walter de Gruyter．
Fukuda H． 1996． Xylogenesis: initiation，progression，and cell death．
Annu Ｒev Plant Physiol Plant Mol Biol，47: 299 － 325．
Fukuda H． 1997． Tracheary element differentiation． Plant Cell，9(7) :
1147 － 1156．
Fukuda H． 2000． Programmed cell death of tracheary elements as a
paradigm in plants． Plant Molecular Biology，44(3) : 245 － 253．
Fukuda H． 2004． Signals that control plant vascular cell differentiation．
Nature Ｒeviews Molecular Cell Biology，5(5) : 379 － 391．
Fukuda H，Komamine A． 1980． Establishment of an experimental system
for the study of tracheary element different from single cells isolated
from the mesophyll of Zinnia elegans． Plant Physiol， 65(1) :
57 － 60．
Fukuda H，Komamine A． 1982． Lignin synthesis and its related enzymes
as markers of tracheary element differentiation in single cells isolated
from the mesophyll of Zinnia elegans． Planta，155(5) : 423 － 430．
Hirakawa Y，Kondo Y，Fukuda H． 2011． Establishment and maintenance
of vascular cell communities through local signaling． Current
Opinion In Biology，14(1) : 17 － 23．
Ito Y，Nakanomyo I，Motose H，et al． 2006． Dodeca-cle peptides as
suppressors of plant stem cell differentiation． Science，313 (5788) :
842 － 845．
Iwasaki T，Shibaoka H． 1991． Brassinosteroids act as regulators of
tracheary-element differentiation in isolated Zinnia mesophyll cells．
Plant and Cell Physiology，32 (7) : 1007 － 1014．
Lee S，Ｒoberts A W． 2004． Tracheary element differentiation is
correlated with inhibition of cell expansion in xylogenic mesophyll
suspension cultures． Plant Physiol Biochem，42 (1) : 43 － 48．
Malik S，Bhushan S，Sharma M，et al． 2011． Physico-chemical factors
influencing the shikonin derivatives production in cell suspension
cultures of Arnebia euchroma ( Ｒoyle ) Johnston， a Medicinally
important plant species． Cell Biol Int，35 (2) : 153 － 158．
Milioni D，Sado P，Stacey N J，et al． 2001． Differential expression of cell-
wall-related genes during the formation of tracheary elements in the
Zinnia mesophyll cell sestem． Plant Mol Biol，47(1 /2): 221 －238．
Mller Ｒ，McDonald A G，Walter C，et al． 2003． Cell differentiation，
secondary cell-wall formation and transformation of callus tissue of
Pinus radiat D． Don． Planta，217 (5) : 736 － 747．
Motose H，Sugiyama M，Fukuda H． 2004． A proteoglycan mediates
inductive interaction during plant vascular development． Nature，
429(6994) : 873 － 878．
251
第 8 期 杜玉梁等: 管状分子分化离体培养系统的建立及影响因素
Oda Y，Mimura T，Hasezawa S． 2005． Ｒegulation of secondary cell wall
development by cortical microtubules during tracheary element
differentiation in arabidopsis cell suspensions． Plant Physiology，
137(3) : 1027 － 1036．
Ohashi-Ito K，Hiroo F． 2010． Transcriptional regulation of vascular cell
fates． Current Opinion in Plant Biology，13 (6) : 670 － 676．
Ohlsson A B，Djerbi S，Winzell A，et al． 2006． Cell suspension cultures
of Populus tremula × P． tremuloides exhibit a high level of cellulose
synthase gene expression that coincides with increased in vitro
cellulose synthase activity． Protoplasma，228(4) : 221 － 229．
Pesquet E，Ｒanocha P，Legay S， et al． 2005． Novel markers of
xylogenesis in Zinnia are differentially regulated by auxin and
cytokinin． Plant Physiol，139(4) : 1821 － 1839．
Pesquet E，Tuominen H． 2011． Ethylene Stimulates tracheary element
differentiation in Zinnia elegans cell cultures． New Phytologist，
190(1) :138 － 149．
Pillai K V，McDonald A G，Wagner F G． 2011． Developing a model
system in vitro to understand tracheary element development in
douglas-fir(Pseudostuga menziesii) ． Maderas Ciencia y Techlolgía，
13 (1) : 3 － 18．
Ｒichard C，Granier C，Inze D，et al． 2001． Analysis of cell division
parameters and cell cycle gene expression during the cultivation of
arabidopsis thaliana cell suspensions． Journal of Experimental
Botany，52 (361) : 1625 － 1633．
Ｒoberts A W，Haigler C H． 1989． Ｒise in chlorotetracycline fluorescence
accompanies tracheary element differentiation in suspension cultures
of Zinnia． Protoplasma，152 (1) : 37 － 45．
Ｒoberts A W，Haigler C H． 1990． Tracheary-element differentiation in
suspension-cultured cells of Zinnia requires uptake of extracellular
Ca2 + ． Planta，180(4) : 502 － 509．
Ｒoberts A W，Haigler C H． 1994． Cell Expansion and tracheary element
differentiation are regulated by extracellular Ph in mesophyll cultures
of Zinnia elegans L． Plant Physiol，105 (2) : 699 － 706．
Ｒoberts A W，Koonce L T，Haigler C H． 1992． A simplified medium for
in vitro tracheary element differentiation in mesolhyll suspension
cultures from Zinna elegans L． Plant Cell，28(1) : 27 － 35．
Sato Y，Yajima Y，Tokunaga N， et al． 2011． Comparison between
tracheary element lignin formation and extracellular lignin-like
substance formation during the culture of isolated Zinnia elegans
mesophyll cells． Biologia，66 (1) : 88 － 95．
Turner S，Gallois P，Brown D． 2007． Tracheary element differentiation．
Annu Ｒev Plant Biol，58: 407 － 433．
Tuskan G A，Difazio S，Jansson S，et al． 2006． The genome of black
cottonwood，Populus trichocarpa ( Torr． ＆ Gray ) ． Science，313
(5793) : 1596 － 1604．
Twumasi P，Schel J H，Ieperen W V，et al． 2009． Establishment in Vitro
Zinnia elegans cell suspension culture with high tracheary Element
differentiation． Cell Biology International，33 (4) : 524 － 533．
Twumasi P，Schel J，Ieperen W V． 2010． Osmotic potential of Zinnia
Elegans plant material affects the yield and morphology of tracheary
elements produced in vitro． African Journal of Biotechnology，
9(51) : 8712 － 8721．
Wetmore Ｒ H，Sorokin S． 1955． On the differentiation of xylem． Arnold
Arbor，36(1) : 305 － 324．
Yamagishi Y，Yoshimoto J，Uchiyama H，et al． 2013． In vitro induction
of secondary xylem-like tracheary elements in calli of hybrid poplar
(Populus sieboldii × P． grandidentata) ． Planta，237 (4 ) : 1179 －
1185．
Yamamoto Ｒ，Demura T，Fukuda H． 1997． Brassinosteroids induce entry
into the final stage of tracheary element differentiation in cultured
Zinnia cells． Plant and Cell Physiology，38 (8) : 980 － 983．
Yin Z，Fan Ｒ． 2009． Ultrastructural analysis of the differentiation process
of secondary xylem vessel element in Populus deltoides． Frontiers of
Forestry in China，4 (4) : 484 － 488．
(责任编辑 王艳娜)
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