全 文 ：·
1 1 12
.
第 二 军 医 大 学 学 报
Ae a d J S
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M il M
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d U n i v
2 0 0 3 Oe t; 2 41 (0 )
· 论 著 ·
药用植物商陆毛状根培养系统的建立
许铁峰 ` , 3 , 张 磊 ` , 张汉 明 ` , 易杨华 2 , 郭美丽 ` ,董 听` ,唐克轩 3 “
(1
. 第二军医大学药学院生药学教研室 , 上海 2 0 0 4 3 3 ; 2 . 药学院海洋药物研究中心 ; 3 . 复旦 一上海交通大学一诺丁汉植物生物
技术研 发中心 ,上海交通大学植物生物技术研究中心 , 上海 2。。。 3 0)
[摘要」 目 的 : 建立 药用植物商陆 (尸勺 t ol 、 c 。 。 ` ion sa R o x b . )的毛状根离体培养系统 。 方 法 : 分别用发根农杆菌 A 4 、 R 1 60 、
C 5 8C 1 3 个 菌株感染商陆 的子 叶外植体 , 获得毛状根 ,并筛选 了优 质株系 ;考察 了影响毛状根 生长 的因素 ;测定 了毛状根 的生
长 曲线 ;利用 P C R 和高压纸 电泳法对毛状根进行 t D N A 转化的检测 。 结 果 : 利用发根农杆菌 A 4 、 R 16 0 、 C 5 8 C 1 3 种菌株成功
地从商陆中诱导 出毛状根 ; 以水解酪蛋 白为 氮源 、 以麦芽糖为碳源最有利于商陆毛状根 的生长 ; 毛状根 的生长 曲线呈 ` ,S ” 形 ,
2 4 d 时质量达到最大 (增长 18 倍 ) ; P c R 及高压纸电泳检测结果表 明 iR 质粒的 t DN A 已整合进毛状根 中。 结 击 : 成功建立 了
商陆毛状根 离体培养系统 , 为进 一步进行药用成分的工 业化生产和引入 外源基 因改良性状奠定 了基础 。
[关键词」 发根农杆菌 ;毛状根 ;商陆 ;离体培养系统
[中图分类号二 5 5 6 7 「文献标识码二 A [文章编号】 0 2 5 8二8 7 9X ( 2 0 0 3 ) 1 0一 1 1 1 2一 0 4
E s t a b l i s hm e n t o f P匆 t o l a e e a a e i n o s a R o x b h a i r y r o o t i n v i t r o e u l t u r i n g s y s t e m
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, 3 ,
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a i J ia o t o n g U n i v e r s i t y
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a n g h a i 2 0 0 0 3 0 )
[A B S T R A e T 〕 o b j e e t i v e : T 。 。 s t a b l is h a e u lt u r e s y s t e m f o r h a ir y r o o t o f p勺 t o l a c c a a c i n o s a R o x b . M e t h o d s : T h e e o t y l e d o n
e x p l
a n t s o f P 梅 t o la c e a a c i n o s a w e r e i n f e e t e d w i t h A g r o b a e t e r i u m r h i z o g e n e , s t r a in s A 4 , R 1 6 OO a n d C 5 8C I a n d t h e h a ir y r o o t
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e b e t t e r l in e s w e r e s e l e e t e d
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e u r v e w a s s u r v e y e d a n d e x t r i n s ie f a e t o r s a f f e e t in g
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a ir y r o o t s w e r e in v e s t ig a t e d
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T h e t r a n s f o r m a t io n o f R i t D N A w a s e x a m i n e d t h r o u g h P C R a n d h ig h v o lt a g e p a
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o r e s i s e o n f i r m e d t h e t r a n s f o r m a t io n o f 士D N A f r o m R i p l a s m id t o t h e h a ir y r o o t
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C o n e l u s i o n
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a i r y r o o t o f P勺 t o l a c c a a e io o sa l a y s a f o u n d a t io n f o r t h e m a s s p r o d u e t io n o f a e t iv e c o m p o n e n t s a n d i n t r o d u e t i o n o f f o r e ig n
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·
仁K E Y W O R D s 〕 A g or 占a ` t e r i u 二 二入i z o g e n e 、 ; h a i r y r o o t ; 尹hy t o za c c a a e i n o s a ; in v i tor C u l t u r i n g 、 y s t e m
仁A e a d J S e C M il M e d U n iv , 2 0 0 3 , 2 4 ( 1 0 ) : 2 1 1 2 一 1 2 1 5 ]
发根农杆菌 ( A g or bac t er 爪m hr i z o ge 二 es ) iR 质
粒是植物基因工程理想的载体 , 以 iR 质粒为载体可
将抗虫 、 抗病基 因或其他有用的 目的基因转人植物
用毛状根进行次生代谢物质的生产打下了基础 。
l 材料和方法
基因组并得到表达 ,从而达到改 良植物性状 、 提高品 .1 1 发根农杆 菌的 活 化 发根农杆菌 菌株 A 4 、
质的目的川 。 近年来 , 利用发根农杆菌 iR 质粒转化
植物产生的毛状根建立离体培养系统 , 实现次生代
谢物质的工业化生产 , 以解决中药资源的短缺问题
越来越受到人们的重视 。 相对于常规细胞培养和组
织培养 ,毛状根培养系统具有生长快速 、 不需外源植
物激素 、 合成次生代谢物质能力强而且稳定 ,并能向
培养液释放部分代谢产物等优点川 。 通过改变培养
条件 , 毛状根甚至可以合成比原来植物中高出数倍
的活性物质陈 `〕 。 本课题组利用发根农杆菌 iR 质粒
首次成功地从商陆中诱导 出毛状根 ,筛选出了快速
生长的优质株系 ,建立了毛状根离体培养系统 ,为利
R 1 60 0
、
c 5 8C I 由中国科学院遗传学研究所惠赠 。 将
3 种 发 根 农 杆 菌 菌 株 A 4 、 R场 0 、 C 58 C I 保 存
在一 20 `C 灭 菌甘 油 中 , 用 前 于 Y E B 固体 培养 基
25
`
C 活化 3 次 ,然后转至 Y E B 培养液 (培养液 中加
人 20 0 m g / L 卡那霉素 )于黑暗 、 25 ’ C 、 1 0 r /m in 振
荡培养 , 约 12 h 后测定菌液在 6 0 n m 的光密度值
[基金项 目」 国家 “ 十五 ” 重大攻关专项基金 ( 2。。 2 A A 2 2 32 1 0) .
仁作者简介皿 许铁峰 ( 1 971 ~ ) ,男 (汉族 ) ,博士 ,讲师 .
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第 01 期 . 许铁峰 ,等 . 药用植物商陆毛状根培养系统的建立 · 1 1 1 3 ·
( D
6。。
)
, 当刀 。。。为 0 . 8 时 , 用于感染外植体仁z ] 。
1
.
2 植物材料 商陆 (尸勺 t o za c c a a c i n o s a R o x b . )
种子采 自陕西省略阳县 , 并经本室张汉明教授鉴定 。
取商陆种子 , 用浓硫酸浸泡 Z h 后用清水洗净 , 在
7 5% 乙醇中浸泡 l m in , 用清水冲净乙醇 ,再用 0 . 1%
H g 1C
2 消毒 15 m in ,无菌水冲洗 5 次 , 置于 M S 培养
基上 , 2 5 C ,光照 1 2 h / d ,光强度 2 0 0 0 l x , 1 5 d 后萌
发 。 取生长 . 7 d 左右的无菌苗的子叶和胚轴作为外植
体 ,于 M S 培养基上预培养 24 h 后用于转化 。
1
.
3 外植体的转化 将上述预培养 的外植体分别
浸人 D 6。。 为 0 . 8 的发根农杆 菌 A 4 、 R 1 6 0 0 、 C 5 8 C I
菌液中 , 在黑暗条件下 1 20 r /m in 振摇 10 m in , 取
出 ,用无菌滤纸吸干多余的菌液 , 在暗处 、 M S 培养
基上共培养 24 h 后移至含 3 0 m g / L 头抱嚷脂钠的
M S 固体培养基上培养川 , 25 ` C ,光照 12 h d/ , 光强
度 2 O 0 0 lx ,并 以未经感染的子叶和胚轴作对照 。
1
.
4 毛状根的除菌 将感染后长 出的毛状根剪下
移到新的含 30 0 m g / L 头抱嚓脂钠的 M S 固体培养
基上培养 , 每 7 d 转接 1 次 , 转接 4 次以后 ,将毛状
根转至 39 . 5 ` C的恒温箱中培养 48 h , 随后转人不含
抗生素的 M S 培养基上 6[] 。
1
.
5 毛状根优质株 系的 筛选 将 M S 培养基上的
毛状根逐一分开 ,挑取长 2 c m 左右者移人 1 2/ M S
培养液中 , 50 m l 三角锥瓶中置 35 m l 培养液和毛状
根 1 根 , 20 d 后观察生长情况 , 挑选生长迅速的株系
进行继代培养 。
1
.
6 P C R 及 高压纸 电泳检 测 按文献「7」方 法提
取毛状根的 D N A 。 or lB 及 。 lC 基因是发根农杆菌
中与转化有关的关键基因 。 本研究根据文献巨8」合成
了 , ol B 及 or ZC 基 因 的 引 物 : or l B 基 因 5忆 G C T
C T T G C A G T G C T A G A T T T
一
3 ` , 5 ’ 一 G A A G G T
G C A A G C T A C C T C T C
一
3 ` ,预期产物长度为 4 23
b p ; or ZC 基 因 5 ` 一C T C C T G A C A T C A A A C T C G
T C
一
3`
,
5 ` 一 T G C T T C G A G T T A T G G G T A C A
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3
` ,
6 2 6 b p
。
P C R 反应体系为 2 5 拜l ( 5 0 n g 基 因组
D N A
,
5 0 m m o l / L K C I
,
1 0 m m o l / I
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H C I ( p H
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3 )
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1
.
5 m m o l / L M g C I
: , 2 0 0 拼m o l / L d N T P s ,
1
,
2 5 u 了’ a 、 D N A 聚合酶 , 2 5 p m o l 引物 ) 。 反应条
件为 94 C 变性 3 m in , 35 个循环 ( 94 C 变性 40 5 ,
5
’
C 退火 40 5 , 72 C 延伸 l m in) ,最后 72 `C 延伸 7
m in
。
P C R 产物在 1%的琼脂糖凝胶上电泳 ( 80 V 电
压 , 40 m i n) 后 , 在 U V P 成像 系统上观察 D N A 条带
并拍照 。 以相应的农杆菌菌株为阳性对照 , 以未转化
的商陆根为阴性对照 。
取商陆毛状根 1 0 m 只 , 按文献 [ 6 ]的方法进行
进行高压纸电泳 ( h ig h v o l t a g e p a p e : e l e e t r o p h o r e -
5 15
,
H V P E ) 分析 , 以甘露碱标准品 (1 m g /m l) 为阳
性对照 , 以未转化的商陆根为阴性对照 , 。
1
.
7 毛状根 生长 曲线的测 定 取毛状根的优质株
系在 1/ 2 M S 培养液 中进行测定 , 每 50 m l 三角锥
瓶 35 m l 培养液 ,共 50 瓶 ,每 4 d 测 1 次干质量 , 每
次测 5 瓶 , 以平均干质量为指标绘制生长曲线 。 干质
量系 60 ` C烘 24 h 至恒质量后测得 。
1
.
8 毛状根生长条件的优化 分别配制以蔗糖 、 葡
萄 糖 、 果糖 和麦芽糖 (浓度均为 30 9 / L ) 为碳源 的
1 / Z M S 培养液 和 以 N H 4N O 3 ( 1 / Z M S 浓度 ) 和牛
肉浸膏 、 酵母浸膏 、 蛋 白陈和水解酪蛋 白 (质量浓度
均为 1 9 / L )为氮源的 1/ 2 M S 培养液 , 按上述条件
培养毛状根 , 24 〔 l 后测定干质量 。
2 结 果
2
.
1 毛状根 的获得及优质株 系筛选 经发根农杆
菌感染 ,商陆子叶 1 5 d 后有根长 出 , 大多数具有典
型的毛状根特征 :具 白色根毛 ,分支多 , 向上 、 贴瓶壁
向上或沿培养基平长 ,失去向地性 。 对照子叶出根率
低且 向下长人培养基 中 。 25 d 后统计出根率 , 结果
见 表 1 , 可见 C 1 5 8C I 菌株诱导率较其他 两种菌株
高 。 商陆胚轴出根率显著低于 (尸 < 0 . 01 )子叶出根
率 ,所以商陆子叶是合适的外植体 。
在 1/ 2 M S 培养液中培养 20 d 后 ,观察各瓶中
毛状根生长状况 ,选出分枝多 、 生长快速的毛状根的
优质株系 S R n 株 ,来源于 C 58 C I 菌株 。
表 1 3 种发根农杆菌对商陆
不 同外植体 的发根诱导率
T a b 1 R o o t i n d u c i n g r a t e s in d if f e r e n t e x P la n t s
o f P匆 t o l a e e a a e i n o s a i n f e e t e d
b y 3 k i n d s o f A g or b
a e t e ir u m r h iz o g e n e s
C o t y l e d o n H y P o
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关 癸
3 4
钾 若
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苦 苦
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2
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2 毛状根的 P C R 检测 结果 根据设计的两对引
物分别对商陆的毛状根进行 P C R 检测 ,结果均出现
了预期的条带 ( 4 2 3 b p 和 62 6 b p ) ,而未转化 的商陆
根则没有扩增出条带 ,初步说明 t D N A 已整合进毛
状根基 因组 ,见图 1 。
·
1 1 1 4
· 第二军医 大学学报 2。。 3年 10 月 ,第 2 4 卷
2 00 0—
1 00 0—
50 0一
25 0—
图 1 商陆毛状根 P C R 结果
F ig 1 p C R r e s u l t s o f P hy t
o l a e e a a e in o s a h a i r y r 0 0 t s
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e o n t r o i ; N C
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一 4 : P勺 t o al e e a a e i n 。 、 a h a i r y r o o t
2
.
3 毛状根 中甘露碱的检测 高压纸电泳检测结
果 (图 2 )表 明商陆毛状根中含有甘露碱 ,说 明毛状
根中确已含有农杆菌 iR 质粒转人的 t D N A 。 对照正
常根的高压纸电泳图谱无甘露碱斑点 。
响 结果见图 4 。 4种碳源中 , 麦芽糖对商陆毛状根
生长最有利 ( 24 d 干质量增长 23 倍 )( 尸 < 。 . 05 ) ,其
次为蔗糖 ;葡萄糖和果糖不适合商陆毛状根的生长 。
5 种氮源中 , 以水解酪蛋 白最好 ( 2 4 d 干质量增长 2
倍 ) ( P < 。 . 05 ) , 其次为 N H ; N 0 3 ( 1 / 2 M S 浓度 )和
酵母浸膏 (两者无统计学意义上 的差别 ) , 蛋 白膝效
果最差 。 我们以麦芽糖为碳源 , 以水解酪蛋白为氮源
(其余同 12/ M S 培养液 ) 配制了最优化 的培养液 ,
毛状根在此培养液中 24 d 干质量增长了 25 . 5 倍 。
0654仍0201o仓00ǎ比日\￡à祠0ó沙工月J。s的司目西自
图 2 商陆毛状根纸电泳图谱
F i g 2 H i g h v o l t a g e P a P e r e le c t r o P h o r e s i s r e s u l t s
o f P hy t
o l a e e a a e i n o s a h a i r y r o o t s
P C
:
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s 一t i v e e o n t r o l ( rn a n n o p i n e ) ; N C : N e g a t lv e e o n t r o l ;
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P彻 t o l a e c a a c z n o 、 a h a l r y r o o t
S u e G l u F ur M a l N H
; N O 3 B E Y E P C H
2
.
4 毛状根生 长速 率测定 结果见 图 3 , 毛状根 的
生长曲线呈 “ S ” 型 , 在培养最初的 s d 内质量增加 比
较缓慢 , 以后质量随时间的延 长而快 速增加 , 24 d
时质量达到最大 , 增长 18 倍 , 以后由于培养基中的
养分已耗尽 ,生长条件恶化使毛状根部分死亡 、 降解
导致质量逐步下降 。
C a r bo n s o u r e e a n d n it r o g e n s o u r e e in l /2 M S m e d一a
图 4 碳源和氮源对毛状根生长的影响
F ig 4 E f f e e t o f e a r b o n s o u r e e a n d n i t r o g e n
s o u r c e o n h a i r y r o o t s g r o w t h
S u c
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S u e r o s e ; G lu
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G l u e o s e ; F r u
: F r u e t o s e ; M
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B E : B
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0 5 刃 ` S u e ,
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r o u p s ; △ P < 0
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0 5 . 5 t h
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3 讨 论
F ig 3 G r o w t h e u r v e o f P勺 t o l a e e a a c in o s a h a i r y r o o t
农杆 菌诱 导获得 的毛状根 中共生 有大量农 杆
菌 , 必须除去农杆菌以使毛状根大量 、 快速生长 。 除
去农杆菌的方法一般是采用抗生素除菌培养 , 但因
为抗生素对毛状根的生长有影响 ,有时还会导致愈
伤组织化 ,所 以有研究采用温度除菌法〔娜」, 即将共
生有农杆菌的毛状根在含 3 0 m g I/ J 头抱嘎肪钠的
M S 培养基上经过 4 次继代培养 ,农杆 菌的生长受
到了抑制 , 而毛状根的生长状态较为良好 ,这时将培
45035210o0n
ǎ日0ǎ切尽定àù0ó西ǐ浏月Jos的川uIO
C u lutr
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(t/ d)
图 3 商陆毛状根生长曲线
2
.
5 培 养液 中的 碳源 和 氮源对毛状根 生 长 的 影
第 10 期 .许铁峰 ,等 . 药用植物商陆毛状根培养系统的建立 · 1 1 1 5 .
养瓶放人 3 9 . S C 的恒温箱 中除菌 48 h ,这种方法简
单有效 ,对毛状根影响不大 。
有研究川认为发根农杆菌的转化只发生在细胞
分裂的 S 期 (即 D N A 合成期 ) , 因此幼嫩的 、 生长旺
盛的组织对农杆菌更敏感 , 这也是我们选择无菌幼
苗的子叶作为外植体 的原因 。 由于一条毛状根起源
于一个细胞口 ,所以我们把获得的毛状根逐一分开 ,
作为单克隆进行培养 ,这样的培养物性能稳定 ,有利
于提供稳定 的次生代谢产物 。
碳源和氮源的形式及浓度能显著地影响毛状根
的生长及次生代谢物的生成 [ `。 , 工月 。 本实验结果表明
麦芽糖为碳源 、 水解酪蛋白为氮源适合商陆毛状根
生长 ,和秘蓝毛状根的生长条件有所不同帅口。
毛状根的产生是 由于发根农杆菌 中的 t D N A
转人植物细胞并表达的结果 , 因此可 以通过 P C R 检
测 t D N A 中的 or ZB 和 厂 ol C 基 因来验证 t D N A 是否
转人 。 另外 , t D N A 上还含有冠瘦碱合成酶基因 , 该
基 因在植物 中表达产生冠瘦碱合成酶 ,使植物能够
合成原来并不存在的冠瘦碱 (。 p in e 户 `〕 。为进一步验
证 t D N A 的转人 , 本实验又采用高压纸电泳法检测
了 t D N A 在植 物细胞 中的表达产 物之一 : 甘 露碱
( nT a n n o p i n e
,冠瘦碱的一种 ) 。 P C R 和高压纸电泳的
结果均为阳性 , 而转化根 的结果为阴性 ,表 明 t D N A
确 已转人商陆毛状根中 。
参?厂1.自
[ 2〕
仁3 ]
考 文 献 ]
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h i n u rn m a 〕u s L . ) p r o d u e e d b y A -
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a e 艺e ,一s: 乙。 ; , , h i z 。 召e n e s t r a n s f o r m a t i o n [ J口. S c : e n t i a H o r t i c u l -
t乙艺7 ’ a e , 1 9 9 8 , 7 6 ( 1 ) : 37一 5 7
王关林 . 发根农杆菌 R i 质粒载体转化 [ A」. 见 : 王关林 ,方宏箔
主 编 . 植 物基 因工程 〔M 〕. 第 2 版 . 北 京 : 科学 出 版社 , 2 。。 .2
2 37一 2 3 8
.
G
I r i A
,
N a r a s u M l
.
T r a n s g e n i e h a i
r y r o o t s : r e e e n t t r e n d s a n d
a p p l i
e a t i o n s [ J ]
.
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