全 文 ：第 50 卷 第 12 期
2 0 1 4 年 12 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 50，No. 12
Dec．，2 0 1 4
doi:10．11707 / j．1001-7488．20141213
收稿日期: 2014 － 02 － 15; 修回日期: 2014 － 07 － 31。
基金项目: 国家林业公益性行业科研专项(201001014)。
* 周国英为通讯作者。
杉木炭疽病拮抗菌 HY32 的发酵条件优化*
李红军1 周国英1 路宗岩1 谭益民1 段爱国2
(1． 中南林业科技大学林学院 长沙 410004; 2． 中国林业科学研究院林业研究所 北京 100091)
摘 要: 采用单因素试验法和响应面法，探讨杉木炭疽病拮抗菌 HY32 发酵培养基及发酵条件的优化途径。结
果表明:该菌株最佳发酵培养基的最适碳源为葡萄糖，最适氮源为酵母膏和蛋白胨; 最佳培养基配方为葡萄糖
19. 80 g·L － 1、酵母膏 12. 16 g·L － 1、蛋白胨 4. 22 g·L － 1、NaCl13. 13 g·L － 1。该菌株最佳发酵培养条件为培养温度
30. 52 ℃、初始 pH8. 09、摇床转速 184. 67 r·min － 1。验证结果表明采用响应面法优化菌株 HY32 的发酵培养基及发
酵条件是可行的。
关键词: 杉木; 拮抗菌 HY32; 发酵条件; 响应面法
中图分类号: S763. 15 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2014)12 － 0094 － 07
Optimization of Fermentation Medium Formula and Culture Conditions for the
Antagonistic Bacterium HY32 against Colletotrichum gloeosporioides
Li Hongjun1 Zhou Guoying1 Lu Zongyan1 Tan Yimin1 Duan Aiguo2
(1 ． College of Forestry，Central South University of Forestry and Technology Changsha 410004;
2 ． Ｒesearch Institute of Forestry，CAF Beijing 100091)
Abstract: Bacterium HY32 was identified as an antagonistic strain against Colletotrichum gloeosporioides previously．
Both the fermentation medium formula and culture conditions for the antagonistic bacterium HY32 were optimized by using
a single factor test and a response surface methodology (ＲSM) in this study． The test results indicated that the optimized
carbon source was glucose，nitrogen source was yeast extract and peptone，and inorganic salt was NaCl． Based on the
single facfor test，the optimized concentration of these four major media components was determined． The OD600 ( optical
density at 600 nm) value of cultures after 48 h fermentation was measured to assess the fermentation rate． The analyzed
data indicated that the optimal medium was as the following: glucose 19. 80 g·L － 1，yeast extract 12. 16 g·L － 1，peptone
4. 22 g·L － 1 and NaCl 13. 13 g·L － 1 ． With this optimal medium，we found that the actual OD600 value of HY32 culture was
able to reach a high level of 1. 743 after 48 h fermentation． Single factor test results also showed that the initial pH value，
culture temperature and rotation speed were key factors to influence the bacterial growth and inhibitory rate． The best
culture conditions were determined as the following: culture temperature 30. 52 ℃，pH 8. 09 and rotation speed 184. 67
r·min － 1 respectively．
Key words: Cunninghamia lanceolata; antagonistic bacterium HY32; culture conditions; response surface methodology
杉木 ( Cunninghamia lanceolata)是我国南方最
重要的工业用材树种，人工林面积达 853. 86 万
hm2，蓄积 62 036. 45 万 m3，分别占全国人工乔木林
主要树种的 21. 35% 和 31. 64% (贾治邦，2009 )。
杉木炭疽病是杉木栽培区的主要病害，几乎有杉木
的地区就有炭疽病发生 (曾大鹏等，1981; Babu et
al．，2007)。病轻时杉木幼苗的针叶或嫩梢变褐枯
萎，严重时幼林成片变黄、枯死，导致毁灭性的损害
(王军等，1996)。杉木炭疽病的防治方法大多是营
林防治和化学防治，然而化学药剂只有预防而无治
疗作用(许彦君等，2011)，且长期使用会破坏杉木
林生态系统，因此，目前防治杉木炭疽病更加趋向于
研制开发一种高效安全的新型杀菌剂 (李雪娇，
2011)。
路宗岩等(2013)发现一种杉木炭疽病拮抗菌
(地衣芽孢杆菌 HY32)，该菌对杉木炭疽病的防治
第 12 期 李红军等: 杉木炭疽病拮抗菌 HY32 的发酵条件优化
效果明显。但炭疽病拮抗菌的培养常存在着发酵周
期长、芽孢形成率低、成本高等问题，为此许多学者
对地衣芽孢杆菌的发酵条件进行了研究，以提高该
菌的产量并降低生产成本 (丰贵鹏等，2009; 谷春
涛等，2003; 刘莹等，2006; Anja et al．，2013; Tola
et al．，2014)。发酵培养基的营养组成成分和发酵
培养条件均直接影响微生物发酵液中的含菌量与代
谢产物 (谷春涛，2004; 唐娟，2008; 纪明山等，
2011)。一般情况，优化芽孢杆菌液体发酵培养基
会采用单因子试验和正交设计的方法，当考察的因
素比较多时，使用此方法不仅要求的试验次数多，并
且还可能导致不可靠的结论。响应面法可同时对影
响生物产量的各因子水平及其交互作用进行优化与
评价，可快速有效地确定多因子系统的最佳条件
(万芳芳，2012; 郝聚喜，2011)。为此，本研究采用
响应面试验设计法对菌株 HY32 的发酵培养基及培
养条件进行研究，以期获得能产生较高活菌含量的
培养基配方及培养条件。
1 材料与方法
1. 1 材料
杉木炭疽病的病原菌由中南林业科技大学经济
林培育与保护教育部重点实验室分离，保藏于该实
验室的菌种保藏中心，编号为 CSUFTCC F0101。经
鉴定，该 菌 为 杉 木 胶 孢 炭 疽 菌 ( Colletotrichum
gloeosporioides)。供 试 拮 抗 菌 为 地 衣 芽 孢 杆 菌
(Bacillus licheniformis) HY32，经分离、筛选及鉴定，
保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为 CCTCC
No． M2012273(路宗岩等，2013)。
1. 2 方法
1. 2. 1 菌种活化 将保存的 HY32 菌株移入新鲜
的斜面培养基，28 ℃恒温培养 1 天。
1. 2. 2 种子悬液制备 将斜面上生长良好的
HY32 菌株接种到 40 mL NB 培养液的三角瓶中
(100 mL)，于 28 ℃、160 r·min － 1振荡培养 24 h 后，
再按照 5%的比例接种到 20 mL NB 培养液的三角
瓶中(100 mL)，于 28 ℃、160 r·min － 1，振荡培养 24
h 后制成种子液。
1. 2. 3 菌体浓度的测定 取 HY32 菌株发酵液，空
白培养液作为对照，在 722S 可见分光光度计上测
600 nm 时菌液的 OD( optical density)值，以 OD 值的
大小来表示菌体的浓度(乔军，1996)。
1. 2. 4 拮抗活性的测定 吸取 50 μL HY32 菌株
发酵液滴于 PDA 平板中央，均匀涂布后，将直径为
6 mm的病原菌菌饼放于平板中央，然后于 28 ℃恒
温培养 5 天。以不接拮抗菌、只接病原菌的平板为
对照。测量菌落直径，计算抑菌率:抑菌率 = (对照
组直径 －处理组直径) /对照组直径 × 100%。
1. 2. 5 发酵培养基的优化 碳源: 以蔗糖、葡萄
糖、乳糖、丙三醇、淀粉各 2 g·L － 1，作为原基础发酵
培养基中的碳源，在 28 ℃、160 r·min － 1条件下发酵
培养 48 h 后，测定样品的 OD600值及其抑菌活性。
氮源: 用 1%的酵母膏、牛肉膏、硝酸钾、硝酸钾 +
蛋白胨(1∶ 1)，酵母膏 +蛋白胨 +硫酸铵(2 ∶ 2 ∶ 1)，
酵母膏 +蛋白胨 +硝酸钾(2 ∶ 2 ∶ 1)替代基础发酵培
养基中的氮源，在 28 ℃、160 r·min － 1条件下发酵培
养 48 h 后，测定样品的 OD600值及其抑菌活性。
响应面试验设计: 采用 Box-Behnken(B-B)法，
每个因素取 3 个水平，以( － 1，0，l)编码，根据相应
的试验设计表进行试验后，通过对试验数据进行二
次回归拟合，得到拟合因素与响应值之间的二次方
程(包括一次项、平方项和交互项)，分析各因素的
主效应及交互效应，最后在一定水平范围内求取最
佳值。
1. 2. 6 发酵培养条件的优化 培养温度: 将 HY32
菌株按 2%的比例接种于 20 mL(100 mL 三角瓶)筛
出的最适培养基(初始 pH7. 0 ± 0. 2)中，分别在 26，
28，30，32，34 ℃ 5 种培养温度下，于 160 r·min － 1培
养 48 h 后，测定样品的 OD600值及其抑菌活性。
初始 pH: 在筛选确定的最适培养基中，分别用
1 mol·L － 1 NaOH 和 4 mol·L － 1 HCl 溶液将其 pH 值
调至 5. 0，6. 0，7. 0，8. 0，9. 0。按照接种量为 2%、装
液量为 20 mL /100 mL，将 HY32 菌株接种于筛出的
最适培养基中，按照得到的培养温度、160 r·min － 1
培养 48 h 后，测样品的 OD600值及其抑菌活性。
接种量: 在筛选确定的最适培养基中，将配制
好的种子悬液分别按 2%，4%，6%，8%，10% 比例
接种至装液量为 20 mL /100 mL 的最适培养基，按照
筛选得到的培养条件、160 r·min － 1培养 48 h 后，测
样品的 OD600值及其抑菌活性。
摇床转速: 在筛选确定的最适培养基中，按照
装液量为 20 mL /100 mL，将 HY32 菌株接种于筛出
的最适培养基中，按照筛选得到的培养条件，于
120，160，180，200，240 r·min － 1培养 48 h 后，测样品
OD600值及其抑菌活性。
培养时间: 在筛选确定的最适培养基中，按照
装液量为 20 mL /100 mL，将 HY32 菌株接种于筛出
的最适培养基中，按照筛选得到的培养条件，于培养
12，24，36，48，60 h，按 1. 2. 3 和 1. 2. 4 所示方法测样
品 OD600值及其抑菌活性。
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林 业 科 学 50 卷
响应面试验设计: 通过上述单因素试验法得到
重要影响因素，然后以 600 nm 时菌液的 OD 值作为
响应目标，利用 响应面方法 ( ＲSM ) 中 的 Box-
Behnken(B-B)法，对单因素试验设计筛出的主要影
响因素进行响应面试验，以期获得最优发酵培养条
件。将得到的数据进行拟合，得到拟合因素与响应
值之间的函数方程，通过对回归方程的分析来得到
适宜的发酵工艺条件，最终确定最优发酵培养条件，
并进行验证。
采用 Design-expert V8. 0 软件对试验数据进行
回归拟合，并对拟合方程做显著性检验和方差分析。
2 结果与分析
2. 1 发酵培养基的优化
2. 1. 1 不同碳源对活菌数及抑菌活性的影响 碳
源是微生物或细胞正常生长、分裂的物质基础。从
表 1 可知，以葡萄糖、蔗糖为碳源的抑菌率和 OD 值
要显著优于乳糖和淀粉，而以乳糖和淀粉为碳源的
抑菌率和 OD 值又显著优于丙三醇。5 种碳源以葡
萄糖为最佳碳源，其产生的抑菌物质和活菌数最多，
抑菌效果最好。
表 1 不同碳源对菌株 HY32 活菌数及抑菌率影响①
Tab. 1 Effect of different carbon sources on viable count and bacteriostatic rate of HY32
指标
Index
乳糖
Lactose
蔗糖
Sucrose
葡萄糖
Glucose
可溶性淀粉
Soluble starch
丙三醇
Glycerol
OD600 1. 12 ± 0. 73b 1. 62 ± 0. 68d 1. 64 ± 0. 46d 1. 43 ± 0. 05c 0. 58 ± 0. 42a
抑菌率 Bacteriostatic rate(% ) 50. 58 ± 0. 02b 66. 72 ± 0. 12d 72. 00 ± 0. 24e 61. 50 ± 0. 09c 56. 65 ± 0. 14a
①表中数据为均值 ±标准差，同行数值后标注的不同字母表示经方差分析处理间有显著性差异( P ＜ 0. 05)，下同。Data are mean ± SD．
Different alphabets mean significant difference in the same row(P ＜ 0. 05) ． The same below．
2. 1. 2 不同氮源对活菌数及抑菌活性的影响 氮
源是构成生物体的蛋白质、核酸及其他氮素化合物
的材料。由表 2 可知，不同的氮源对拮抗菌拮抗活
性的影响比较大，在供试的几种不同氮源组合中，硝
酸钾 +蛋白胨与硫酸铵 + 蛋白胨 2 种组合 OD600值
及抑菌率均显著低于其他组合，表明有机氮源要明
显比无机氮源效果好，当以蛋白胨与酵母膏作为氮
源时，HY32 菌 株 对 病 原 菌 的 抑 制 率 最 高，达
74. 93%以上。因此，蛋白胨和酵母膏可选为最佳氮
源组合。
表 2 不同氮源对菌株 HY32 活菌数及抑菌率影响①
Tab. 2 Effect of different nitrogen sources on viable count and bacteriostatic rate of HY32
指标 Index a b c d e f
OD600 1. 43 ± 0. 09a 1. 75 ± 0. 06b 1. 64 ± 0. 11b 1. 63 ± 0. 90b 1. 64 ± 0. 75b 1. 44 ± 0. 11a
抑菌率 Bacteriostatic
rate(% )
50. 65 ± 0. 03b 74. 93 ± 0. 03c 67. 03 ± 0. 02c 71. 65 ± 0. 03d 71. 00 ± 0. 04cd 44. 33 ± 0. 03a
① a:硝酸钾 + 蛋白胨 Potassium nitrate + peptone; b:酵母膏 + 蛋白胨 Yeast extract + peptone; c:牛肉膏 + 蛋白胨 Beef extract + peptone;
d:酵母膏 +蛋白胨 +硫酸铵 Yeast extract + peptone + ammonium sulphate; e:酵母膏 +蛋白胨 +硝酸钾 Yeast extract + peptone + potassium nitrate;
f:硫酸铵 +蛋白胨 Ammonium sulphate + peptone．
2. 1. 3 响应面试验设计 发酵培养基试验因素水
平设计以及统计结果见表 3，4。以菌体发酵液的
OD600值为指标，葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、NaCl 4 因
素与 OD600值(Ｒ1)之间的回归方程为:
Ｒ1 = － 1. 968 05 + 0. 127 36A － 0. 022 062B +
0. 252 52C + 0. 314 15D + (2. 800 00E － 004)AB +
(2. 475 00E － 003)AC + (9. 500 00E － 004)AD +
(7. 025 00E － 003)BC + (3. 633 33E － 003)BD －
0. 010 833CD － (4. 034 33 E － 003)A2 －
(2. 299 33E － 003)B2 － 0. 027 340C2 －
0. 012 665D2。
式中，Ｒ1 为 OD600值，A，B，C，D 分别为葡萄糖、酵母
膏、蛋白胨、NaCl 的编码值。二次多项式方程拟合
的方差分析结果见表 5。回归模型达到显著水平
(P ＜ 0. 000 1)，且 回 归 方 程 的 相 关 系 数 Ｒ2 =
0. 981 3。另外失拟项在 α = 0. 05 水平上不显著
(P = 0. 203 7 ＞ 0. 05)，误差项不显著，说明实际情
况和回归方程之间的吻合度比较好，试验的误差小，
用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析
是可行的。另外，该回归模型各项的方差分析结果
还表明，1 次项、2 次项都有较显著影响，因此响应值
的变化十分复杂，与各具体试验因素之间不是简单
的线性关系。回归模型中，1 次项 A，B，D 对样品
OD 值的曲面效应显著，2 次项 A2，B2，C2，D2 的效应
均极显著，交互项 AB 和 AD 的交互效应不显著。因
此，在一定范围内可变动葡萄糖、酵母膏、蛋白胨及
NaCl 之间的关系，使发酵液中的活菌数(即样品 OD
值)达到最高水平。
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第 12 期 李红军等: 杉木炭疽病拮抗菌 HY32 的发酵条件优化
表 3 发酵培养基 Box-Behnken 试验因素水平
Tab. 3 Box-Behnken design of fermentation medium
g·L － 1
因素 Factor
水平 Level
－ 1 0 1
A(葡萄糖 Glucose) 15 20 25
B(酵母膏 Yeast extract) 10 15 20
C(蛋白胨 Peptone) 3 5 7
D(NaCl) 9 12 15
表 4 发酵培养基响应面试验设计及结果
Tab. 4 Experimental design and results of response
surface analysis on fermentation medium
试验号 No． A B C D Ｒ1 (OD600 )
1 1 0 － 1 0 1. 461
2 1 0 0 1 1. 602
3 1 0 1 0 1. 514
4 － 1 － 1 0 0 1. 638
5 0 0 － 1 1 1. 653
6 0 － 1 0 － 1 1. 572
7 0 0 0 0 1. 744
8 － 1 1 0 0 1. 591
9 － 1 0 0 1 1. 617
10 0 0 1 － 1 1. 510
11 0 － 1 － 1 0 1. 645
12 1 0 0 － 1 1. 375
13 0 0 0 0 1. 741
14 0 0 1 1 1. 528
15 0 1 － 1 0 1. 432
16 － 1 0 0 － 1 1. 447
17 0 － 1 0 1 1. 648
18 － 1 0 － 1 0 1. 582
19 － 1 0 1 0 1. 536
20 0 － 1 1 0 1. 544
21 0 0 0 0 1. 745
22 0 0 0 0 1. 723
23 1 1 0 0 1. 539
24 0 1 1 0 1. 612
25 0 0 － 1 － 1 1. 375
26 0 1 0 1 1. 661
27 0 1 0 － 1 1. 367
28 0 0 0 0 1. 711
29 1 － 1 0 0 1. 558
利用 Design-expert 8. 0 软件对表 2 中的数据进
行分析，可得到发酵液的最大 OD600值为 1. 745。各
试验因素的最佳取值分别为: 葡萄糖 19. 80 g·L － 1，
酵母膏 12. 16 g·L － 1，蛋白胨 4. 22 g·L － 1，NaCl13. 13
g·L － 1。为了验证本次分析结果的准确性，通过 3 次
重复试验，所得发酵液的实际 OD600值的平均值为
1. 743，可见实际结果与 Design-expert 8. 0 软件的预
测结果符合良好，说明采用响应面法优化菌株
HY32 的发酵培养基配方是可行的。
表 5 发酵培养基方差分析
Tab. 5 Analysis of variance on fermentation medium
数据源
Source
SS DF MS F Sig．
模型 Model 0. 34 14 0. 024 52. 40 ＜ 0. 000 1
A 0. 011 1 0. 011 23. 69 0. 000 2
B 0. 014 1 0. 014 29. 37 ＜ 0. 000 1
C 7. 680E － 004 1 7. 680E － 004 1. 67 0. 217 7
D 0. 094 1 0. 094 204. 31 ＜ 0. 000 1
AB 1. 960E － 004 1 1. 960E － 004 0. 43 0. 524 9
AC 2. 450E － 003 1 2. 450E － 003 5. 32 0. 036 9
AD 8. 123E － 004 1 8. 123E － 004 1. 76 0. 205 6
BC 0. 020 1 0. 020 42. 83 ＜ 0. 000 1
BD 0. 012 1 0. 012 25. 78 0. 000 2
CD 0. 017 1 0. 017 36. 67 ＜ 0. 000 1
A2 0. 066 1 0. 066 143. 17 ＜ 0. 000 1
B2 0. 021 1 0. 021 46. 51 ＜ 0. 000 1
C2 0. 078 1 0. 078 168. 31 ＜ 0. 000 1
D2 0. 084 1 0. 084 182. 85 ＜ 0. 000 1
误差 Error 9. 128E － 004 4 2. 282E － 004
总和 Total 0. 34 28
2. 2 发酵培养条件的优化
2. 2. 1 培养温度对活菌数及抑菌活性的影响 温
度对微生物生长及其代谢物质的合成有很大的影
响，合适的温度可以促进菌体生长和代谢产物的合
成。由表 6 可知，温度较高或较低情况下拮抗菌的
抑菌活性均比较低，其中，30 ℃时的菌株的 OD600值
及抑菌率均显著高于其他温度，故菌株 HY32 最适
培养温度为 30 ℃。
2. 2. 2 初始 pH 对活菌数及抑菌活性的影响 pH
能够引起细胞膜电荷变化及营养物的离子化，进而
影响细胞的生长和繁殖，影响抗菌物质的产生。摇
瓶发酵时，培养基的 pH 一直在变化，难以人为控
制，故本试验仅考虑培养基初始 pH 对活菌数及抑
菌活性的影响。由表 7 可知，不同的初始 pH 对活
菌数及抑菌活性影响显著，且 pH8 较适宜菌株生
长，当 pH 低于 6. 0 或大于 9. 0 时，活菌数及抑菌活
性均显著下降。
表 6 不同培养温度对菌株 HY32 活菌数及抑菌率的影响
Tab. 6 Effect of different culture temperatures on viable count and bacteriostatic rate of HY32
指标 Index 26 ℃ 28 ℃ 30 ℃ 32 ℃ 34 ℃
OD600 1. 59 ± 0. 04b 1. 75 ± 0. 57c 1. 83 ± 0. 57d 1. 72 ± 0. 02c 1. 53 ± 0. 02a
抑菌率 Bacteriostatic rate(% ) 57. 73 ± 0. 02a 71. 95 ± 0. 01c 78. 60 ± 0. 01d 66. 85 ± 0. 02d 70. 75 ± 0. 08b
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林 业 科 学 50 卷
表 7 不同初始 pH 对菌株 HY32 活菌数及抑菌率的影响
Tab. 7 Effect of different initial pH values on viable count and bacteriostatic rate of HY32
指标 Index pH5. 0 pH6. 0 pH7. 0 pH8. 0 pH9. 0
OD600 1. 23 ± 0. 09a 1. 44 ± 0. 08b 1. 63 ± 0. 07c 1. 64 ± 0. 08c 1. 55 ± 0. 06c
抑菌率 Bacteriostatic rate(% ) 44. 95 ± 0. 03a 65. 90 ± 0. 03c 76. 10 ± 0. 02d 76. 70 ± 0. 03d 61. 75 ± 0. 02b
2. 2. 3 接种量对活菌数及抑菌活性的影响 由表
8 可知，在一定范围内，活菌数和抑菌活性随接种量
的增加而增加，当接种量在 6% 以上时抑菌率显著
降低，故 6%接种量为最优。
表 8 不同接种量对菌株 HY32 活菌数及抑菌率的影响
Tab. 8 Effect of different inoculums on viable count and bacteriostatic rate of HY32
指标 Index 2% 4% 6% 8% 10%
OD600 1. 61 ± 0. 05a 1. 71 ± 0. 05b 1. 74 ± 0. 04b 1. 72 ± 0. 03b 1. 64 ± 0. 04a
抑菌率 Bacteriostatic rate(% ) 60. 83 ± 0. 03a 72. 10 ± 0. 03bc 82. 80 ± 0. 04d 73. 96 ± 0. 02c 67. 23 ± 0. 03b
2. 2. 4 摇床转速对活菌数及抑菌活性的影响 摇
床转速的高低会影响发酵液的溶氧，转速高则溶氧
高，反之则低。溶氧对菌体的生长繁殖非常重要，
菌体在溶氧量不足时就会死亡。但转速过高时会产
生较大的剪切力，对菌体造成伤害，从而影响菌体的
生长繁殖及其代谢产物的合成。由表 9 可知，摇瓶
转速为 180 r·min － 1时，HY32 菌株发酵液的活菌数
及抑菌活性达到最高且显著优于其他处理，当转速
达到 200 r·min － 1时，活菌数及抑菌率下降。
表 9 不同摇床转速对菌株 HY32 活菌数及抑菌率的影响
Tab. 9 Effect of different rotation speed on viable count and bacteriostatic rate of HY32
指标 Index 120 r·min － 1 140 r·min － 1 160 r·min － 1 180 r·min － 1 200 r·min － 1
OD600 1. 35 ± 0. 10a 1. 61 ± 0. 09b 1. 67 ± 0. 08b 1. 72 ± 0. 09b 1. 58 ± 0. 14b
抑菌率 Bacteriostatic rate(% ) 45. 65 ± 0. 02a 68. 45 ± 0. 02b 78. 35 ± 0. 03d 82. 75 ± 0. 02e 66. 18 ± 0. 04b
2. 2. 5 培养时间对活菌数及抑菌活性的影响 由
表 10 可知，HY32 菌株在培养 24 h 内，菌量呈对数
增长，到 36 h 左右生物产量达最大值，OD600值出现
最高峰，为 1. 783 6。而培养 72 h 的发酵液的抑菌
率最大为 84. 7%，72 h 后开始显著下降。由此可
见，与菌体的对数增长期相比，抑菌活性物质的产生
相对滞后。在培养 36 h 后，HY32 菌株的生长呈现
衰退趋势，菌体逐渐死亡，但是抑菌活性物质的产量
仍处在积累的过程中。菌体繁殖数量与抑菌物质活
性强弱的关系表明，拮抗物质应是细菌繁殖达到高
峰后在衰亡过程中释放到体外的代谢物质，因此，菌
株 HY32 发酵产生抑菌活性物质的最适培养时间为
72 h。
2. 2. 6 响应面试验设计 在单因素试验的基础上，
采用 Box-Behnken 中心设计原理，对影响 HY32 菌
株的活菌数及抑菌活性的重要因素，即培养温度、初
始 pH 和摇床转速，采用 Design-expert V8. 0 软件进
行 3 因素 3 水平(表 11)的中心组合设计(表 12)。
表 10 不同培养时间对菌株 HY32 活菌数及抑菌率的影响
Tab. 10 Effect of different culture times on viable count and bacteriostatic rate of HY32
指标 Index 6 h 12 h 24 h 36 h 48 h 60 h 72 h 84 h
OD600 0. 30 ± 0. 05a 1. 11 ± 0. 08b 1. 41 ± 0. 07d 1. 75 ± 0. 08f 1. 71 ± 0. 02f 1. 61 ± 0. 08e 1. 44 ± 0. 05d 1. 26 ± 0. 03c
抑菌率
Bacteriostatic rate(% )
20. 63 ±0. 02a 37. 43 ±0. 02b 56. 00 ±0. 01d 71. 60 ±0. 01e 71. 85 ±0. 01e 74. 48 ±0. 01f 80. 20 ±0. 02g 41. 20 ±0. 02c
表 11 发酵培养条件 Box-Behnken 试验因素水平
Tab. 11 Box-Behnken design of culture conditions
因素 Factor (X)
水平 Level
－ 1 0 1
A(培养温度 Temperature) /℃ 28 30 32
B(初始 pH Original pH) 7. 0 8. 0 9. 0
C(摇床转速 Ｒotation speed) /( r·min － 1 ) 160 180 200
为考察各因素对 HY32 菌株活菌数的影响，以
菌体发酵液的 OD600值为指标，对表 5 中的试验结果
进行分析，得到 3 因素与 OD600值 (Ｒ2 )之间的回归
方程:
Ｒ2 = － 36. 555 04 + 1. 519 07A + 1. 189 03B +
0. 112 88C + 0. 011 300AB + (2. 687 50E － 005)AC －
(6. 900 00E － 004) BC － (0. 026 461E － 003) A2 －
0. 086 918B2 － (2. 927 31E － 004)C2。
二次多项式方程拟合的方差分析结果见表 13。
89
第 12 期 李红军等: 杉木炭疽病拮抗菌 HY32 的发酵条件优化
回归模型达到显著水平(P ＜ 0. 000 1)，且回归方程
的相关系数 Ｒ2 = 0. 988 9，说明回归显著;另外，失拟
项在 α = 0. 05 水平上不显著(P = 0. 251 8 ＞ 0. 05)，
误差项不显著，说明实际情况和回归方程之间的吻
合度比较好，试验的误差小，用该回归方程代替试验
真实点对试验结果进行分析是可行的。该回归模型
各项的方差分析结果还表明，1 次项、2 次项都有较
显著影响，因此响应值的变化十分复杂，与各具体试
验因素之间不是简单的线性关系，故在一定范围内
可变动培养温度、初始 pH 和摇床转速之间的关系，
使发酵液中的活菌数达到最高水平。
表 12 响应面试验设计及结果
Tab. 12 Experimental design and results of response
surface analysis on culture conditions
试验号 No． A B C Ｒ2 (OD600 )
1 0 － 1 － 1 1. 552 3
2 － 1 － 1 0 1. 618 4
3 0 0 0 1. 863 2
4 0 － 1 1 1. 714 4
5 0 0 0 1. 853 1
6 0 1 － 1 1. 604 5
7 － 1 0 1 1. 610 2
8 － 1 0 － 1 1. 524 1
9 1 0 － 1 1. 641 1
10 0 0 0 1. 864 2
11 0 1 1 1. 711 4
12 1 0 0 1. 731 5
13 － 1 1 0 1. 601 2
14 0 0 0 1. 835 6
15 1 1 0 1. 740 6
16 0 0 0 1. 832 2
17 1 － 1 0 1. 667 4
表 13 方差分析
Tab. 13 Analysis of variance on culture conditions
数据源
Source
SS DF MS F Sig．
模型 Model 0. 20 9 0. 023 69. 19 ＜ 0. 000 1
A 0. 023 1 0. 023 69. 40 ＜ 0. 000 1
B 1. 383E － 003 1 1. 383E － 003 4. 22 0. 079 1
C 0. 025 1 0. 025 75. 65 ＜ 0. 000 1
AB 2. 043E － 003 1 2. 043E － 003 6. 23 0. 041 2
AC 4. 622E － 006 1 4. 622E － 006 0. 014 0. 908 8
BC 7. 618E － 004 1 7. 618E － 004 2. 32 0. 171 3
A2 0. 047 1 0. 047 143. 83 ＜ 0. 000 1
B2 0. 032 1 0. 032 96. 99 ＜ 0. 000 1
C2 0. 058 1 0. 058 176. 03 ＜ 0. 000 1
总和 Total 0. 210 16
利用 Design-expert 8. 0 软件对表 11，12 中的数
据进行分析后，可得到发酵液的最大 OD600 值为
1. 864。各试验因素的最佳取值分别为培养温度
30. 52 ℃，初始 pH8. 09，摇床转速184. 67 r·min － 1。
为了验证本次分析结果的准确性，结合实际情况，将
菌株 HY32 发酵培养条件的最佳条件修正为培养温
度 30. 5 ℃，初始 pH8，摇床转速185 r·min － 1。通过
3 次重复试验，所得发酵液的实际 OD600值的平均值
为 1. 861，可见实际结果与软件的预测结果吻合良
好，说明采用响应面法优化菌株 HY32 的发酵培养
条件是可行的。
3 结论与讨论
采用单因素试验法和响应面法，对地衣芽孢杆
菌菌株 HY32 的发酵培养基及发酵条件进行了优
化。结果表明:拮抗菌株 HY32 最佳发酵培养基的
最适碳源为葡萄糖，最适氮源为酵母膏和蛋白胨;
在单因素试验的基础上，采用响应面法分析得到拮
抗菌 HY32 的最佳培养基配方为葡萄糖 19. 80 g·
L － 1、酵母膏 12. 16 g·L － 1、蛋白胨 4. 22 g·L － 1、NaCl
13. 13 g·L － 1。经过单因素试验及响应面法优化得
到菌株 HY32 的最佳发酵培养条件为: 培养温度
30. 52 ℃，初始 pH8. 09，摇床转速 184. 67 r·min － 1。
对优化培养基及发酵培养条件进行了验证，验证结
果表明采用响应面法优化菌株 HY32 的发酵培养基
及发酵条件是可行的。与针对芒果 ( Mangifera
indica)(任建国等，2010)、苹果(Malus pumila) (王
亮，2012)、胡萝卜(Davucus sp． )(Tola et al．，2014)
等植物炭疽病筛选拮抗菌地衣芽孢杆菌的培养研究
相比，杉木拮抗菌株 HY32 同样表现为有机氮源优
于无机氮源，蔗糖、葡萄糖优于乳糖，但适宜培养温
度、pH 具有较大区别，这可能是炭疽病发生对象不
同以及该菌菌株遗传异质性所致。
以杉木炭疽病病原菌作为指示菌，本试验研究
了菌株 HY32 的最佳发酵培养基优化和发酵培养条
件，明确了其在发酵代谢过程中的一些规律。但是
在试验过程中存在一些问题，即能够产生最大菌体
数量的发酵条件和能够产生最高拮抗活性的发酵条
件通常不会完全吻合，因而在试验中对菌体发酵条
件进行优化时，往往不能同时兼顾以上 2 项指标，这
可能是由于细菌的生长繁殖和其代谢物质的产生并
不是同步进行，或者菌体和抗菌物质的性状有差异，
这还有待于进一步的研究。此外，大规模的工业化
发酵条件与实验室内试验水平不同，各参数数据会
有一定变化，但总体趋势一般不会有太大差异，实验
室内研究结果仍能为拮抗菌 HY32 作为生防菌进行
大规模的发酵提供理论依据。
99
林 业 科 学 50 卷
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(责任编辑 朱乾坤)
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