全 文 ：第 ww卷 第 tu期
u s s {年 tu 月
林 业 科 学
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快速检疫中培养松材线虫的冷藏真菌菌种筛选
李海燕 黄北英 熊惠龙 宋玉双
k国家林业局森林病虫害防治总站 沈阳 ttssvwl
关键词 } 松材线虫 ~分散型 ¶幼虫 ~冷藏真菌培养 ~快速检疫检验
中图分类号 }≥zyv 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kuss{ltu p stxz p sy
收稿日期 }ussz p sw p uv ∀
基金项目 }/十五0攻关项目子专题 }松材线虫病快速检疫技术研究资助 ∀
Σελεχτιον οφ τηε χολδ2στορεδ φυνγυσσπεχιεσφορ χυλτυρινγ Βυρσαπηελενχηυσ
ξψλοπηιλυσιν ραπιδ θυαραντινε
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k ΓενεραλΣτατιον οφ Φορεστ Πεστ Μαναγεµεντo Στατε Φορεστρψ Αδµινιστρατιον Σηενψανγ ttssvwl
Αβστραχτ } „ ²¯±ª³µ²¦¨§∏µ¨¬¶±¨ §¨¨§·² ∏´¤µ¤±·¬±¨ ³¬±¨ º²²§±¨ °¤·²§¨¶¥¨¦¤∏¶¨ ²±¯¼·«¨ §¬¶³¨µ¶¤¯ ·«¬µ§2¶·¤ª¨ ¤¯µ√¤¨ ¦²∏¯§¥¨
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§¨ √¨ ²¯³°¨ ±·q Φυσαριυµ ¶³qº¤¶·«¨ ¥¨¶·o Πεσταλοτια ¶³qº¤¶·«¨ ¶¨¦²±§o Βοτρψτισ χινερεα º¤¶·«¨ º²µ¶·¬± ³µ²°²·¬±ª ¤¯µ√¤¨
§¨ √¨ ²¯³°¨ ±·q≤²¯§2¶·²µ¨§ Βq χινερεα º¤¶±²·¶∏¬·¤¥¯¨©²µ·«¨ µ¤³¬§ ∏´¤µ¤±·¬±¨ ²©·«¨ ±¨ °¤·²§¨ q • «¨ ±·«¨ ¶ ¤¯µ√¤¨ ²© Βq
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Κεψ ωορδσ} ³¬±¨ º²²§±¨ °¤·²§¨ ~·«¨ §¬¶³¨µ¶¤¯ ·«¬µ§2¶·¤ª¨ ¤¯µ√¤¨ ~¦∏¯·∏µ¨ º¬·«·«¨ ¦²¯§¶·²µ¨§¤ª¨ ©∏±ª¬~µ¤³¬§¬±¶³¨¦·¬²±
松材线虫病是一种通过媒介昆虫携带松材线虫k Βυρσαπηελενχηυσ ξψλοπηιλυσl侵染松树而导致松树迅速死
亡的一种毁灭性传染病害 ∀人为调运未经处理或处理不彻底的感病原木 !木材 !薪材及包装箱等制品是病害
扩散的主要原因 ∀随着国际贸易往来和国内各地之间各种形式的交流日益频繁 o松材线虫继续传入我国和
在国内继续扩散的可能性越来越大 ∀检疫是松材线虫病综合治理的一项非常重要的基础性措施 ∀随着经济
的迅速发展 o生产上迫切需要准确快速的检疫检验技术 ∀利用木屑有机提取溶液的显色方法进行快速检疫
检验 o快速 !显色直观 o检验工具及设备简单 !经济 o便于推广应用k王玉 等 ousss ~usstl ∀因其准确性和专
化性达不到 tss h o只限于已知疫区的病死木和包装材料的初步检测 o应用调运检疫有一定的局限性 ∀酶学
和血清学技术需要样品量大 o结果易受线虫龄期和环境的影响 o目前还没有成熟的技术用于松材线虫病的检
疫检验 ∀虽然分子生物学技术具有敏感性高 !所需样品少 !快速简便等优点 o但由于需要昂贵的仪器设备和
高层次的专业技术人员 o目前在检疫实践工作中还未得到广泛应用k王明旭等 ousswl ∀尽管形态分类尚存在
一些缺陷 o如有些形态特征不十分稳定 o但目前还没有更成熟的方法取代它 k杨宝君等 oussvl ∀一些专家学
者通过提高水温 !改进分离器等方式缩短线虫分离时间 o通过休眠幼虫的快速培养缩短形态学鉴定的时间 o
在一定程度上使松材线虫病检疫检验达到了快速 !准确k宋玉双等 ot||u ~周弘等 ousst ~ussu ~李一农等 o
ussul ∀疫木直接培养 o不需要制作生物培养基质 o但木材中营养缺乏 o休眠幼虫成熟要 v ∗ w §∀单异活体培
养 o接种线虫 vy «即有大量成虫出现 o可以进行形态学鉴定 ~而生物培养基质的制作需要 w ∗ x §k钟国强等 o
usswl ∀如何相互弥补不足 o使形态学快速检疫检验更快速 o在生产实际中容易操作 !易于广泛推广应用的研
究工作具有更加重要的意义 ∀本研究利用冷藏的生物培养基质培养松材线虫 ¶幼虫开展试验 o探索解决检
疫实际工作中经常遇到的分离线虫量少或全部为 ¶幼虫 o培养鉴定所需时间长的难题 ∀
1 试验材料
t1t 供试样品 tl 样木的收集 利用贝尔曼漏斗法分离 o立体显微镜和显微镜下镜检鉴定的方法从 ussv
年 u月至 ussw年 tt月采自广东 !重庆 !安徽和贵州等松材线虫病疫区的大量病木中 o筛选出只感染松材线
虫的病木 y株和 t块沙发板条作为样本 ∀将只分离到休眠幼虫的样本放入冰箱 w ε 下冷藏 o以保持松材线
虫的休眠幼虫虫态 ∀将有成虫的样本放在室内自然条件下 o东北干燥炎热的夏秋季节使样本变得非常干燥 o
松材线虫为度过不良环境逐渐进入休眠阶段 ∀不定期从样本上取样分离镜检 o待样本中的松材线虫全部为
休眠幼虫时 o置于 w ε 冰箱中冷藏备用 ∀ul 样品的制备 从经过筛选只含有松材线虫休眠幼虫的样本中取
样 o劈成木条 o用贝尔曼漏斗法分离松材线虫 ∀用 x °沉淀管接取分离液 o自然沉淀收集松材线虫 o用于冷
藏真菌培养 ∀收集的松材线虫休眠幼虫样品置于 w ε 冰箱中冷藏备用 ∀
t1u 供试真菌 选用繁殖倍数较高的 v种真菌k杨宝君等 oussvl }沈阳农业大学植物线虫实验室提供的灰
葡萄孢k Β qχινερεαl !中国林为科学研究院森林生态环境与保护研究所线虫室提供的盘多毛孢k Πεσταλοτια ¶³ql
和南开大学生命科学学院微生物系提供的镰刀孢k Φυσαριυµ ¶³ql ∀
t1v 仪器设备 本试验采用普通的实验仪器 }西门子普通家用型冰箱 !培养箱 !立体显微镜和显微镜等 ∀
2 研究方法
u1t 培养基质的制备 采用 °⁄„培养基 o在直径 zx °°的培养皿中制成平板 ∀在无菌条件下 o将灰葡萄
孢 !盘多毛孢和镰刀孢分别接种到平板上培养 ∀灰葡萄孢 ux ε !盘多毛孢和镰刀孢 u{ ε 培养 w ∗ x §o待菌
丝铺满平板表面后 o置于 w ε 冰箱中冷藏备用 ∀
u1u 松材线虫的接种培养 从冰箱中取出铺满真菌的培养皿和松材线虫样品 o逐渐恢复至室温 ∀将每个
°⁄„平板菌丝层分别相对均等的分成 ts小块 o用镊子夹取每 t小块 o菌丝层朝上置于直径 xs °°小培养皿
中 ∀有菌条件下 o用尖头滴管吸取未经任何处理松材线虫休眠幼虫悬液 o分别等量地滴在 t{ °° ≅ t{ °°的
盖玻片上 t滴 ∀解剖镜下数每张盖玻片上松材线虫的数量 o使每张盖玻片上的线虫数量接近相等 o数量控制
在 vs ∗ tss条 ∀显微镜下确认为 ¶幼虫后 o用镊子夹取盖玻片 o水滴面朝下接种到小培养皿中 °⁄„平板菌
丝层上 o小培养皿中滴 u滴水保湿 o盖上培养皿 o置于 vs ε 或 ux ε 培养箱中培养 ∀
在不同的温度下 o松材线虫的发育有差别 ∀在 vs ε 条件下 o松材线虫生长最快 ov天可完成 t代 ~ux ε
条件下需要 w ∗ x §完成 t代 ∀温度上升发育加快 o但温度过高则发育不正常 o繁殖受到抑制k杨宝君等 o
ussvl ∀许多学者在用于接种试验的松材线虫培养中多采用 ux ε o基本不采用 vs ε ∀为达到快速检疫的目
的 o本试验培养温度主要采用 vs ε 试验 o而以 ux ε 作参考 o用来培养松材线虫的 v种真菌灰葡萄孢 !盘多毛
孢和镰刀孢在 vs ε 下每 t菌种每 t培养时间分别设 tw个重复 ~ux ε 下每 t菌种每 t培养时间分别设 w个
重复 ∀
u1v 松材线虫发育成熟情况的观察 培养 uw ow{和 zu «后 o分别从小培养皿中取出 °⁄„菌丝层 o连同盖玻
片放入铺好纱布的漏斗中 o夹上止水夹 o缓缓加水适量 o用镊子取出盖玻片 o贝尔曼漏斗法分离 ∀w «后 o用
x °沉淀管接取漏斗底部分离液 o沉淀 s1x «后 o用滴管吸取沉淀管底部的线虫 o制成临时玻片标本 o显微镜
下观察松材线虫的发育情况 o记录每个重复中松材线虫的雌 !雄成虫和幼虫的数量及新孵幼虫的有无 ∀
u1w 统计与分析 统计同一温度下 o同一菌种 !相同培养时间的分散型 v龄幼虫成虫率 !有成虫样重复数 !
可以准确鉴定病原线虫种类的重复数和出现新孵幼虫的重复数 o进而统计有成虫样率 !鉴定率和新孵幼虫样
率 ∀成虫率是每一重复中观察到的雌 !雄成虫之和与该重复中镜检出线虫总数的百分比 ~有成虫样率是有成
虫出现的重复数与所设重复数的百分比 ~鉴定率是可以准确鉴定病原线虫种类的重复数与所设重复数的百
分比 ~新孵幼虫样率是出现新孵幼虫的重复数与所设重复数的百分比 ∀利用数理统计方法分析温度 !菌种
和培养时间对快速检疫检验的影响 ∀
3 结果与分析
v1t v种冷藏真菌在不同温度下培养松材线虫 ¶幼虫的成虫率比较 灰葡萄孢 !盘多毛孢和镰刀孢 v种真
菌在 w ε 冰箱中经过一定时间冷藏后 o于 ux ε 和 vs ε 恒温条件下培养松材线虫¶幼虫 ouw ow{和 zu «后松
{xt 林 业 科 学 ww卷
材线虫的成虫率及各处理组合的平均成虫率见表 t ∀从表 t中可以看出 }灰葡萄孢在 vs ε 下培养松材线虫
幼虫 w{和 zu «的成虫率低于 ux ε o盘多毛孢和镰刀孢在 vs ε 下培养松材线虫休眠幼虫每一培养时间的成
虫率均高于 ux ε ∀
表 1 冷藏真菌不同温度下培养松材线虫 Λ¶幼虫的成虫率
Ταβ .1 Τηε ρατε οφ δεϖελοπινγ το βε αδυλτστηατ Λ¶ λαρϖαε οφ Β . ξψλοπηιλυσ χυλτυρεδ ωιτη χολδ στορεδ αγε φυνγι ατ 25 ανδ 30 ε
温度
× °¨ q
重复
• ³¨¨ q
灰葡萄孢 Β q χινερεαΠh 盘多毛孢 Πq¶³qΠh 镰刀孢 Φq¶³qΠh
uw « w{ « zu « uw « w{ « zu « uw « w{ « zu «
t s1ss xs1ss yy1yz s1ss uy1vu v{1wy s1ss xs1ss wv1zx
u s1ss s1ss z{1xz s1ss ux1ss y|1uv y1yz |s1|t {s1ss
ux ε v s1ss s1ss s1ss s1ss zx1ss {s1ss tt1tt tss1ss tss1ss
w s1ss s1ss s1ss v1zs xs1ss zu1uu y1ux ys1zt tss1ss
平均  ¤¨± s1ss tu1xs vy1vt s1|v ww1s{ yw1|{ y1st zx1wt {s1|w
t t1sw t1vy ww1ww |1zy {s1ss |s1ss y1ux zy1|u tss1ss
u s1ss s1ss s1ss s1ss vv1vv xy1wx s1ss vv1vv tss1ss
v s1ss tx1v{ s1ss s1ss tss1ss tss1ss s1ss tss1ss tss1ss
w s1ss s1ss tw1u| s1ss y{1xz xw1u| s1ss tss1ss tss1ss
x s1ss s1ss tz1{y s1ss vv1vv |s1|t s1ss zt1wv tss1ss
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z s1ss s1ss ts1|t 3 s1ss s1ss zy1x| 3 s1ss v{1{| xz1tw
vs ε { s1ss u1vv uv1xv x1uy ut1ut yy1yz s1ss |t1t{ |s1ss
| s1ss s1ss s1ss s1ss ts1ss wt1yz s1ss zy1|u {{1{|
ts s1ss s1ss s1ss y|1uv tss1ss tss1ss ys1ss {s1ss tss1ss
tt s1ss s1ss s1ss ty1yz tss1ss tss1ss vz1x {{1{| |s1|t
tu s1ss s1ss v1xz s1ss wu1{y zv1vv zt1wv tss1ss tss1ss
tv s1ss s1ss ts1|t 3 s1ss ux1ss {x1zt t{1zx {y1yz {s1s
tw s1ss s1ss s1ss s1ss s1ss zy1x| 3 s1ss zt1wv tss1ss
平均  ¤¨± s1sz v1xw ts1|t z1z{ w{1yw zy1x| tx1yw z|1ty |v1vx
3 }为弥补的缺失数据 ׫¨ §¤·¤¦²°³¨ ±¶¤·¨§©²µ·«¨ °¬¶¶¨§©¬ª∏µ¨ q
应用 τ检验对 u种温度下每一个处理组合的平均成虫率进行统计检验k南京农业大学 ot|{{l o结果见表
u o所有处理组合的平均成虫率在 ux和 vs ε 下差异均不显著 o温度虽然对不同的菌种有影响 o但对松材线虫
¶幼虫的发育成熟没有显著影响 ∀
表 2 2 种温度下冷藏真菌培养松材线虫 Λ¶幼虫的平均成虫率 τ检验表
Ταβ .2 τ τεστ οφ µεαν ρατε οφ δεϖελοπ µεντ φροµ λαρϖαε το βε αδυλτσ βετωεεν 25 ε ανδ 30 ε
菌种
≥³¨¦¬¨¶
培养时间
⁄∏µ¤·¬²±Π«
温度 × °¨³¨µ¤·∏µ¨
ux ε vs ε
平均数
 ¤¨±
重复
• ³¨¨·¬·¬²±
平方和
≥ ∏´¤µ¨ ¶∏°
平均数
 ¤¨±
重复
• ³¨¨·¬·¬²±
平方和
≥ ∏´¤µ¨ ¶∏°
标准误
≥·¤±§¤µ§
µ¨µ²µ
τ
差异显著性
≥¬ª±¬©¬¦¤±·
¯¨ √¨ ¯x h
uw s1ss w s1ss s1sz tw t1s{ s1tw p s1x 不显著 ‘²·≥¬ªq
灰葡萄孢
Β q χινερεα w{ tu1xs w u xss v1xw tw t ty|1{t {1ts t1tt 不显著 ‘²·≥¬ªqzu vy1vt w v{ tt{1yy ts1|t tw w tww1vv uz1wz s1|u 不显著 ‘²·≥¬ªq
uw s1|v w tv1y| z1z{ tw x t|v1yt |1yw p s1zt 不显著 ‘²·≥¬ªq
盘多毛孢
Πq¶³q w{ ww1s{ w vt s{{1zw w{1yw tw xs txx1vy v{1s| p s1tu 不显著 ‘²·≥¬ªqzu yw1|{ w yz xxv1ut zy1x| tw {| xvx1wy xu1|y p s1uu 不显著 ‘²·≥¬ªq
uw y1st w xzz1ww tx1yw tw tt tuw1tu tw1wx p s1sz 不显著 ‘²·≥¬ªq
镰刀孢
Φq¶³q w{ zx1wt w |s |zw1yu z|1ty tw |v uyw1w{ xz1vy p s1yz 不显著 ‘²·≥¬ªqzu {s1|w w tsw {tw1sy |v1vx tw tuv |vt1ss yv1|t p s1us 不显著 ‘²·≥¬ªq
v1u 冷藏真菌菌种和培养时间对松材线虫 ¶幼虫成虫率影响的差异性分析 一定的成虫率是形态学鉴定
的基础 ∀以松材线虫 ¶幼虫的成虫率为考核指标 o分析比较菌种和培养时间对松材线虫 ¶幼虫发育成熟
的影响 ∀v种冷藏真菌 ux ε 下培养松材线虫¶幼虫的成虫率随培养时间变化趋势如图 t¤所示 ~vs ε 下培
养松材线虫 ¶幼虫的成虫率随培养时间变化趋势如图 t¥所示 ∀
利用表 t中的数据对冷藏真菌菌种和培养时间影响松材线虫 ¶幼虫的成虫率进行双因素方差分析见
表 v ∀ Φ测验结果表明 }ux ε 下菌种间和培养时间间差异极显著 o菌种和培养时间没有交互作用 ~vs ε 下
|xt 第 tu期 李海燕等 }快速检疫中培养松材线虫的冷藏真菌菌种筛选
菌种间和培养时间间差异极显著 o同时菌种和培养时间有交互作用 ∀
图 t 冷藏真菌 ux ε k¤l !vs ε k¥l下培养松材线虫 ¶幼虫不同培养时间的成虫率比较
ƒ¬ªqt ׫¨ µ¤·¨ ²©§¨ √¨ ²¯³° ±¨·©µ²° ¤¯µ√¤¨ ¦∏¯·∏µ¨§º¬·«·«µ¨¨¶³¨¦¬¨¶²©¦²¯§¶·²µ¨§¤ª¨ ©∏±ª¬¤·ux ε k¤l ¤±§vs ε k¥l
表 3 菌种和培养时间对成虫率影响双因素方差分析表 ≠
Ταβ .3 ς αριανχε αναλψσισ οφ τηε ρατε οφ δεϖελοπ µεντ φροµ λαρϖαε το βε αδυλτσ
变异来源
≥²∏µ¦¨ ²©
√¤µ¬¤·¬²±
温度 × °¨³¨µ¤·∏µ¨
ux ε vs ε
自由度
⁄ƒ
平方和
≥≥
均差
 ¤¨± §¨√¬¤·¬²±
方差比
∂¤µ¬¤±¦¨ µ¤·¬²
自由度
⁄ƒ
平方和
≥≥
均差
 ¤¨± §¨√¬¤·¬²±
方差比
∂¤µ¬¤±¦¨ µ¤·¬²
菌种 ≥³¨¦¬¨¶ u { ytt1wx w vsx1zv {1ww33 u zv wyw1tx vy zvu1s{ |s1yt33
培养时间 ⁄∏µ¤·¬²± u ut zu{1zv ts {yw1vz ut1u|33 u ys wuv1xu vs utt1zy zw1xv33
菌种 ≅培养时间
≥³¨¦¬¨¶≅ ⁄∏µ¤·¬²± w v wzz1ux {y|1vt t1zs w ut |tz1zu x wz|1wv tv1xu
33
随机误差 •¤±§²° µ¨µ²µ uz tv zz|1xv xts1vx ttz wz wu|1t{ wsx1v{
总变异 ײ·¤¯ vx wx {vy1yz tux usv uvw1xz
≠ 33 }差异极显著 ∞¬·µ¨°¨¯¼ ¶¬ª±¬©¬¦¤±·§¬©©¨µ¨±¦¨ q
313 冷藏真菌菌种和培养时间对松材线虫 Λ¶幼虫成虫率影响的差异性比较
通过方差分析在 ux和 vs ε 下冷藏真菌菌种间和培养时间间差异均极显著 o同时在 vs ε 条件下冷藏菌
种和培养时间有交互作用 ∀采用新复极差测验进一步明确各个平均数之间的差异显著性 ∀v种冷藏真菌对
松材线虫 ¶幼虫发育成熟的影响达到了差异显著 o在 ux ε 下只有镰刀孢和灰葡萄孢达到了差异极显著 ~
在 vs ε 下 v种冷藏真菌之间的差异均达到了极显著 o见表 w ∀
培养时间对松材线虫 ¶幼虫发育成熟的影响在 ux ε 下 ozu和 w{ «之间差异不显著 ozu ouw «及 w{ ouw «
之间差异达到极显著 ~在 vs ε 下 v个培养时间对松材线虫¶幼虫发育成熟的影响差异达到了极显著 o见表
x ∀在 vs ε 下 o菌种和培养时间的交互作用对松材线虫 ¶幼虫发育成熟的影响见表 y ∀
314 冷藏真菌培养松材线虫 Λ¶幼虫对快速检疫检验的的影响
v种真菌不同温度 !不同培养时间的鉴定率 !有成虫样率和新孵幼虫样率见表 z ∀在有些重复中鉴定率
低于有成虫样率 o这是由于本试验为解决生产上分离线虫量少的难题 o在保证对比试验一致的情况下线虫最
低接种量只有 vs条 ~而受回收线虫数量的限制 o在镜检时只见到雄成虫或雌成虫的缘故 ∀从表 z可以看出
样本的鉴定率 !有成虫样率和新幼虫样率与前文分析的温度 !菌种和培养时间对松材线虫 ¶幼虫发育成熟
的影响结果基本一致 o在接种线虫量较少时 o镰刀孢 ux ε 下培养 zu «ovs ε 下培养 w{和 zu «o盘多毛孢
vs ε 培养 zu «o鉴定率均能达到 tss h ∀温度升高有利于镰刀孢和盘多毛孢促进松材线虫 ¶幼虫发育成
熟 o不利于灰葡萄孢促进松材线虫 ¶幼虫发育成熟 ∀经过冷藏的镰刀孢促进松材线虫幼虫发育成熟的作用
最明显 o盘多毛孢次之 o灰葡萄孢最差 ∀
4 结论与讨论
本试验的结果表明 oux ε 和 vs ε 对松材线虫 ¶幼虫的发育成熟影响差异不显著 ∀但灰葡萄孢属于低
syt 林 业 科 学 ww卷
表 4 菌种对松材线虫 Λ¶幼虫发育成熟影响的差异性 ≠
Ταβ .4 Σιγνιφιχανχε οφ σπεχιεσ οφ φυνγι αφφεχτεδ ον οφ τηε Λ¶
λαρϖαε δεϖελοπ µεντ
温度
× °¨³¨µ¤·∏µ¨Πε
菌种
≥³¨¦¬¨¶
平均成虫率
„√¨ µ¤ª¨Πh
差异显著性
≥¬ª±¬©¬¦¤±·¯ √¨¨ ¯
x h t h
镰刀孢 Φq¶³q xw1tu ¤ „
ux 盘多毛孢 Πq¶³q vy1yy ¥ „…
灰葡萄孢 Β q χινερεα ty1uz ¦ …
镰刀孢 Φq¶³q yu1u ¤ „
vs 多毛孢 Πq¶³q ww1vw ¥ …
灰葡萄孢 Β q χινερεα w1{v ¦ ≤
≠同列中字母不同则差异显著 o下同 ∀ ׫¨ §¬©©¨µ¨±·¯ ·¨¨µ¬± ¤¦²¯∏°± ° ¤¨±¶
¶¬ª±¬©¬¦¤±·§¬©©¨µ¨±¦¨ q׫¨ ¶¤°¨¥¨ ²¯º q
表 5 培养时间对松材线虫 Λ¶幼虫发育成熟影响的差异性
Ταβ .5 Σιγνιφιχανχε οφ δυρατιον αφφεχτεδ ον τηε Λ¶ λαρϖαε
δεϖελοπ µεντ
温度
× °¨³¨µ¤·∏µ¨Πε
培养时间
⁄∏µ¤·¬²±Π«
平均成虫率
„√¨ µ¤ª¨Πh
差异显著性
≥¬ª±¬©¬¦¤±·¯ √¨¨ ¯
x h t h
zu ys1zx ¤ „
ux w{ wv1ss ¤ „
uw v1vt ¥ …
zu ys1u{ ¤ „
vs w{ wv1z{ ¥ …
uw z1{v ¦ ≤
表 6 30 ε 下菌种和培养时间交互作用对松材线虫 Λ¶
幼虫发育成熟影响的差异性
Ταβ .6 Σιγνιφιχανχε οφιντεραχτιον οφ σπεχιεσ ανδ δυρατιον
αφφεχτεδ ον τηε Λ¶ λαρϖαε δεϖελοπ µεντ ατ 30 ε
菌种 ≅培养时间
≥³¨¦¬¨¶≅ ⁄∏µ¤·¬²±
平均成虫率
„√ µ¨¤ª¨Πh
差异显著性
≥¬ª±¬©¬¦¤±·¯ √¨¨ ¯
x h t h
镰刀孢 ≅ zu « Φq¶³q≅ zu « |v1vx ¤ „
镰刀孢 ≅ w{ « Φq¶³q ≅ w{ « z|1ty ¤ „
盘多毛孢 ≅ zu « Πq¶³q ≅ zu « zy1x| ¤ „
盘多毛孢 ≅ w{ « Πq¶³q ≅ w{ « w{1yw ¥ …
镰刀孢 ≅ uw « Φq¶³q ≅ uw « tx1yw ¦ ≤
灰葡萄孢 ≅ zu « Β q χινερεα ≅ zu « ts1|t ¦ ≤
盘多毛孢 ≅ uw « Πq¶³q z1z{ ¦ ≤
灰葡萄孢 ≅ w{ « Β q χινερεα ≅ w{ « v1xw ¦ ≤
灰葡萄孢 ≅ uw « Β q χινερεα ≅ uw « s1sz ¦ ≤
温真菌 o在 w ε 冷藏条件下仍缓慢生长 o不易保
藏 oux ε 是它的最适合生长温度 ovs ε 下促进松
材线虫 ¶幼虫生长发育要比 ux ε 差 o灰葡萄孢
不适宜作冷藏培养 ∀镰刀孢和盘多毛孢在 vs ε
下培养松材线虫 ¶幼虫的成虫率均高于 ux ε ∀
镰刀孢 vs ε 下培养 w{ «oux ε 下培养 zu «o即使
只接种 vs条休眠幼虫也能达到 tss h的鉴定率 o
当线虫数量充足时 o培养 uw «即可进行形态学快
速检疫检验 ∀它是 v种真菌冷藏后最适合用于松
材线虫形态学快速鉴定的菌种 ∀盘多毛孢冷藏后
促松材线虫幼虫成熟的作用较镰刀孢略差 o线虫
样品充足时 o培养时间 w{ «也可完成快速检验 o
如线虫量少可根据情况适当延长培养时间 ∀无论
在 ux ε 还是在 vs ε 条件下 o在幼虫的培养过程
中 o真菌培养基质升温快而均匀 o线虫发育相对整
齐迅速 o促进松材线虫幼虫成熟的作用明显优于
疫木直接保湿培养k李海燕等 ouss{l ∀在试验过
程中发现 }培养 uw «检验时 o有很多松材线虫幼
虫的阴门或交合刺已发育成形但还未蜕皮 o只能
记录为幼虫 o培养 w{ «检验时 o成虫率已很高 ~但
为了使本试验的结果前后一致 o培养时间间隔在
本试验中未作变动 ∀为加快检疫检验的速度可在
今后的工作中于 uw和 w{ «之间设置一间隔进行
试验 ∀
镰刀孢是寄主植物的致病菌之一 o松材线虫
用于接种试验时不能采用它培养 ∀但用于松材线
虫检疫检验时完全可以采用它培养 ∀曾有学者建
议将多毛孢作为松材线虫形态鉴定的标准基质
k赵文霞等 oussxl ∀本试验的结果表明 }冷藏后
在镰刀孢菌丝层上 o松材线虫分散型幼虫在 vs ε
条件下发育成熟比在盘多毛孢菌丝层上迅速 ∀因
此 o建议通过试验比较 u个菌种对松材线虫尾尖
突的影响 o同时可以选择培养松材线虫繁殖倍数
高的其他真菌 o如长喙壳菌 !毛壳菌 !细基束梗孢
菌k Χεπηαλοτριχηυµ ¶³ql及黑孢菌等 o作冷藏后培养
松材线虫的试验 o综合分析后筛选出进行形态学
快速检疫检验的最佳培养基质 ∀
选择冷藏真菌培养松材线虫休眠幼虫 o缩短检疫检验时间是工作理念和思维方式的创新 o基层检疫检查
站和基层口岸检疫部门可以将培养基的制作和真菌培养这些无菌操作工作委托给大学或省级森防站和检疫
站等单位 ∀将培养好的 °⁄„平板真菌基质放入数控式冰箱的 w ε 下冷藏 o检疫人员在检疫实际工作中 o一
旦发现疑似松材线虫的幼虫 o马上从冰箱中取出培养基质 o无需对线虫进行消毒即可直接培养 o线虫量多时 o
t §即可完成种类鉴定 o线虫量少时 ou §也能完成鉴定 ∀可以通过追踪管理加速通关速度 ∀但需要针对真菌
冷藏时间对松材线虫分散型 v龄幼虫的发育成熟的影响开展试验 ∀
利用冷藏真菌培养松材线虫休眠幼虫进行松材线虫形态学快速检疫检验 o没有原木 ³‹显色反应快速 o
但准确率高 o基本能达到 tss h ~同时较分子生物学技术易于在基层推广应用 ∀它不需要昂贵的仪器设备 o
tyt 第 tu期 李海燕等 }快速检疫中培养松材线虫的冷藏真菌菌种筛选
表 7 冷藏真菌培养松材线虫 Λ¶幼虫的鉴定率 !有成虫样率和新幼虫样率
Ταβ .7 Τηε ρατε οφιδεντιφιχατιον , ρατε οφ αδυλτσ. σαµ πλεσ ανδ νεωλψ− ηατχηεδ λαρϖαε. σαµ πλεσ
αφτερ χυλτυρινγ Λ¶ λαρϖαε οφ Β . ξψλοπηιλυσ ωιτη τηε χολδ στορεδ αγε φυνγι
温度
× °¨³¨µ¤·∏µ¨Π
ε
菌种
≥³¨¦¬¨¶
鉴定率
•¤·¨ ²©¬§¨±·¬©¬¦¤·¬²±Πh
有成虫样率
•¤·¨ ²©¤§∏¯·¶. ¶¤°³¯ ¶¨Πh
新幼虫样率
•¤·¨ ²© ±¨ º¯ ¼2«¤·¦«¨ §
¤¯µ√¤¨ . ¶¤°³¯ ¶¨Πh
uw « w{ « zu « uw « w{ « zu « uw « w{ « zu «
灰葡萄孢 Β q χινερεα s s xs s xs xs s s ux
ux 盘多毛孢 Πq¶³q s zx zx ux tss tss s s ux
镰刀孢 Φq¶³q s zx tss zx tss tss s s tss
灰葡萄孢 Β q χινερεα s ut vv { u| xs s s z1tw
vs 盘多毛孢 Πq¶³q tw yw tss vy {y tss s s xs1ss
镰刀孢 Φq¶³q u| tss tss wv tss tss s xs {x1zt
复杂的试验程序 o不菲的试验成本和高层次的专业技术人员 ~它采用的技术 o普通的专业技术人员经过稍加
培训即可掌握 ∀它的广泛应用将使松材线虫病的检疫检验工作日常化 o使松材线虫的准确鉴定由专家层面
过渡到普通专业技术层面 o对松材线虫病的检疫检验工作起到推进作用 ∀
参 考 文 献
王玉 o舒朝然 o李海燕 o等 qusss1 松材线虫病木快速检疫技术的研究 q林业科学 ovykxl }x| p yu q
王玉 o李海燕 o舒朝然 o等 qusst1 几种松树松材线虫病木和健木值差异的研究 q植物病理学报 ovtkwl }vwu p vw{ q
王明旭 o张志飞 o罗 宽 o等 qussw1 松材线虫快速检测技术方法的比较研究 q湖南农业大学学报 }自然科学版 ovskvl }uv| p uwu q
宋玉双 o臧秀强 o刘 阳 o等 qt||u1 室温变化与松材线虫分离量的关系 q森林病虫通讯 oktl }ut p uu q
李海燕 o熊惠龙 o宋玉双 o等 quss{1 疫木保湿直接培养快速检验松材线虫的研究 q中国森林病虫 ouzktl }v{ p ws q
李一农 o李芳荣 o黄佩卿 o等 qussu1 进境木质包装松材线虫抽样准确性的探讨 q植物检疫 otykwl }uts p utt q
南京农业大学主编 qt|{{1 田间试验和统计方法 qu版 q北京 }农业出版社 q
杨宝君 o潘宏阳 o汤 坚 o等 qussv1 松材线虫病 q北京 }中国林业出版社 q
周 弘 o沈培根 qusst1 进境木包装松材线虫检疫应把握的关键技术 q植物检疫 otxkvl }txs p txt q
周 弘 o沈培根 o叶春巧 qussu1 线虫分离器的改进和松材线虫分离特点 q植物检疫 otykwl }usz p us| q
赵文霞 o杨宝君 qussx1 松材线虫雌虫尾部形态和寄主的关系 q林业科学研究 ot{kvl }vyu p vyv q
钟国强 o赵立荣 o司徒保禄 o等 qussw1 促进松材线虫发育为成虫的培养方法试验简报 q莱阳农学院学报 outkul }tzz p tz| q
k责任编辑 朱乾坤l
uyt 林 业 科 学 ww卷