全 文 ：第 ww卷 第 w期
u s s {年 w 月
林 业 科 学
≥≤Œ∞‘׌„ ≥Œ∂ „∞ ≥Œ‘Œ≤„∞
∂²¯1ww o‘²1w
„³µqou s s {
长春花花叶病病原物的分离和鉴定 3
曹言勇t 施 艳t 范在丰t 宋丽敏u 田国忠u
kt1 中国农业大学植物病理系 农业部分子病理学重点开放实验室 北京 tsss|w ~
u1 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 国家林业局森林保护学重点实验室 北京 tsss|tl
摘 要 } 长春花病原物采自海南省琼海市博鳌镇和广东省广州市星海公园 o症状表现为系统花叶与畸形 o对其进
行染病外植体组织培养 !鉴别寄主反应 !传播方式鉴定 !病毒粒体形态观察和血清学反应及病叶双链 • ‘„k§¶• ‘„l
分析 ∀引起长春花花叶病的病原物鉴定为黄瓜花叶病毒k¦∏¦∏°¥¨µ°²¶¤¬¦√¬µ∏¶o≤  ∂l o克隆该病毒分离物外壳蛋白
基因核苷酸序列 o并对该核苷酸序列进行生物信息学分析 o结果显示侵染我国长春花引起长春花花叶和畸形的
≤  ∂ 分离物应初步划归在 ≤  ∂ Œ…亚组 ∀
关键词 } 长春花 ~花叶病 ~黄瓜花叶病毒
中图分类号 }≥zyv1tt 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kuss{lsw p ssys p s|
收稿日期 }ussz p su p s| ∀
基金项目 }国家科技基础条件平台建设项目kussx⁄Ž„utuszl ∀
3 田国忠为通讯作者 ∀参加本研究的还有中国农业大学李怀方教授 !周涛博士 o中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所朴春根 !
李永 !淮稳霞 !邵丽娜 !张殿朋等 o特此致谢 ∀
Ισολατιον ανδ Ιδεντιφιχατιον οφ τηε Πατηογεν Τηατ Χαυσεσ Μοσαιχ ον Περιωινκλε
≤¤² ≠¤±¼²±ªt ≥«¬≠¤±t ƒ¤± ¤¬©¨ ±ªt ≥²±ª¬°¬±u ׬¤± Š∏²½«²±ªu
kt1 ΚεψΛαβ qφορ Μολεχυλαρ Πλαντ Πατηολογψοφτηε Μινιστρψοφ Αγριχυλτυρε οφ ΠΡΧ ∆επαρτµεντ οφ Πλαντ Πατηολογψo
Χηινα Αγριχυλτυραλ Υνιϖερσιτψ Βειϕινγ tsss|w ~ u1 Ρεσεαρχη Ινστιτυτε οφ Φορεστ Εχολογψo Ενϖιρονµεντ ανδ Προτεχτιον o ΧΑΦ
ΚεψΛαβ q οφ Φορεστ Προτεχτιον o Στατε Φορεστρψ Αδµινιστρατιον Βειϕινγ tsss|tl
Αβστραχτ} ׫¨ ¶¼¶·¨°¬¦°²¶¤¬¦¤±§°¤¯©²µ°¤·¬²±¶¼°³·²°¶º¨ µ¨ ²¥¶¨µ√¨ §²±·«¨ ¯¨ ¤√¨ ¶²©³¨µ¬º¬±®¯¨k Χατηαραντηυσροσευσl
©µ²° …². ¤²o±¬²±ª«¤¬o‹¤¬±¤± °µ²√¬±¦¨ ¤±§÷¬±ª«¤¬°¤µ®oŠ∏¤±ª½«²∏oŠ∏¤±ª§²±ª°µ²√¬±¦¨ q •¬·«·«¨ ¬±©¨¦·¨§·¬¶¶∏¨ ¦∏¯·∏µ¨ o
«²¶·µ¤±ª¨ §¨·¨µ°¬±¤·¬²±o¶¨µ²¯²ª¬¦¤¯ ¤¶¶¤¼ ¤±§√¬µ¤¯ ³¤µ·¬¦¯¨ °²µ³«²¯²ª¬¦¤¯ ²¥¶¨µ√¤·¬²±o§¶• ‘„ ¤±¤¯¼¶¬¶o·«¨ ³¤·«²ª¨± º¤¶
¬§¨±·¬©¬¨§·² ¥¨ ¦∏¦∏°¥¨µ°²¶¤¬¦√¬µ∏¶k≤∂l q≤¯ ²±¬±ª²©·«¨ ¦²¤·³µ²·¨¬± ª¨ ±¨ ¤±§¤±¤¯¼¶¬¶²©·«¨ ±∏¦¯¨ ²·¬§¨ ¶¨ ∏´¨±¦¨¶©∏µ·«¨µ
§¨ °²±¶·µ¤·¨§·«¤··«¬¶≤∂ ¬¶²¯¤·¨ º¤¶·¨±·¤·¬√¨ ¼¯ ¤¶¶¬ª±¨ §·²·«¨ Œ…¶∏¥ªµ²∏³²©≤∂ q
Κεψ ωορδσ} Χατηαραντηυσροσευσ~°²¶¤¬¦§¬¶¨¤¶¨ ~¦∏¦∏°¥¨µ°²¶¤¬¦√¬µ∏¶k≤∂l
长春花k Χατηαραντηυσροσευσl又名五瓣梅 o为夹竹桃科长春花属植物 o是常见的盆栽观赏植物 ∀长春花株
型整齐 !叶片对生 !翠绿具光泽 o花瓣 x o有玫瑰红 !黄或白色 ∀花期长 o最佳观赏时间可达 w ∗ y周 ∀长春花
植株体内含多种生物碱 o特别是长春花碱和长春花新碱 o经临床验证具有明显的抗癌功效 o无副作用k蔡连捷
等 oussx ~云青柳 oussxl ∀在我国的广东 !云南 !海南和广西等省区有大量栽培 ∀
引起长春花的病害主要有长春花疫病k朱纯等 oussul !长春花黄化病k蔡红等 oussvl以及花叶病k⁄∏¤µ·¨
ετ αλqousstl等 ∀孔宝华等kusssl通过电镜观察 !酶联免疫吸附测定k ±¨½¼°¨ ¬¯±®¨ §¬°°∏±²¯²ª¼ ¤§¶²µ¥¤¶¶¤¼o
∞Œ≥„l和生物侵染试验从/ ||云南世博会0期间海南带到云南的长春花上检测出黄瓜花叶病毒k¦∏¦∏°¥¨µ
°²¶¤¬¦√¬µ∏¶o≤ ∂l o但迄今未见对我国南方长春花主栽区病毒病的系统调查与分子鉴定的研究报道 ∀作者
自 ussw年开始对广东和海南等地长春花病毒病进行了调查 o并从海南省琼海市博鳌镇的长春花栽培基地和
广东省广州市星海公园采集了发病的长春花植株 o通过生物学 !血清学和分子生物学的方法进行了病原系统
鉴定 ∀
t 材料与方法
111 试验材料
发病的长春花植株采自海南省琼海市博鳌镇长春花栽培基地和广东省广州市星海公园 o种植在实验室
防虫温室中 ∀供试接种植物包括茄科 !藜科 !豆科 !葫芦科 !番杏科以及禾本科共计 y科 tx种植物 o种植在实
验室防虫温室 ∀本研究使用的抗血清有 uv种 o其中芜菁花叶病毒k·∏µ±¬³ °²¶¤¬¦√¬µ∏¶o×∏ ∂l !西瓜花叶病毒
kº¤·¨µ°¨ ²¯± °²¶¤¬¦√¬µ∏¶o•  ∂l !马铃薯 ≠ 病毒k³²·¤·² ≠ √¬µ∏¶o°∂ ≠l !甘蔗花叶病毒k¶∏µª¤µ¦¤±¨ °²¶¤¬¦√¬µ∏¶o
≥≤ ∂l !小西葫芦黄花叶病毒k½∏¦¦«¬±¬¼¨ ¯¯²º °²¶¤¬¦√¬µ∏¶o≠  ∂l !烟草花叶病毒k·²¥¤¦¦² °²¶¤¬¦√¬µ∏¶oא ∂l !
白草花叶病毒k³¨ ±±¬¶¨·∏° °²¶¤¬¦√¬µ∏¶o°¨ ± ∂l !玉米线条病毒k½¨ ¤ °²¶¤¬¦√¬µ∏¶o ¨ ∂l !莴苣花叶病毒k¯ ·¨∏¦¨
°²¶¤¬¦√¬µ∏¶o∂l !紫藤脉花叶病毒kº¬¶·¨µ¬¤ °²¶¤¬¦√¬µ∏¶o• ∂  ∂ l抗血清由实验室保存 o辣椒轻斑驳病毒
k³¨ ³³¨µ°²·¯¨√¬µ∏¶o°¨ ³²∂ l !大豆花叶病毒k¶²¼¥¨¤± °²¶¤¬¦√¬µ∏¶o≥ ∂ l !南方菜豆花叶病毒k¶²∏·«¨µ± ¥¨¤±
°²¶¤¬¦√¬µ∏¶o≥… ∂l !南瓜花叶病毒k¶´∏¤¶« °²¶¤¬¦√¬µ∏¶o≥´ ∂l !马铃薯黄矮病毒k³²·¤·² ¼¨ ¯¯²º §º¤µ© °²¶¤¬¦
√¬µ∏¶o°≠⁄∂l !黄瓜花叶病毒 !南芥菜花叶病毒k¤µ¤¥¬¶°²¶¤¬¦√¬µ∏¶o„µ∂l !花生矮化病毒k³¨¤±∏·¶·∏±·√¬µ∏¶o
°≥∂l !马铃薯 ÷ 病毒k³²·¤·² ÷ √¬µ∏¶o°∂ ÷l !李属坏死环斑病毒k³µ∏±∏¶±¨ ¦µ²·¬¦µ¬±ª¶³²·√¬µ∏¶o°‘• ≥∂l !番茄斑萎
病毒k·²°¤·²¶³²·¨§º¬¯·√¬µ∏¶o×≥• ∂l !葡萄扇叶病毒kªµ¤³¨ √¬±¨ ©¤±¯ ¤¨©√¬µ∏¶oŠƒ∂l抗血清购自 „ª§¬¤公司 o齿兰
环斑病毒k²§²±·²ª¯²¶¶∏°µ¬±ª¶³²·√¬µ∏¶o’• ≥∂l抗血清由新加坡国立大学王锡民博士惠赠 o酶标 „ 蛋白购自
≥¬ª°¤公司 o≤ ∂ 和 א ∂ 免疫胶体金层析试纸条购自 „ª§¬¤公司 ∀纤维素粉购自 • ¤·°¤±公司 oוŒ½²¯ 试剂购
自 Œ±√¬·µ²ª¨±公司 o2∂ 反转录酶为 °µ²°¨ ª¤公司产品 o∞÷2פ´ !³⁄t{2×及 • ‘„酶抑制剂购自 פŽ¤•¤公
司 ots °°²¯#pt §‘×°¶购自 ׬¤±ª¨ ±公司 ∀常规生化试剂为北京化学试剂公司产品 ∀引物由赛百盛公司合
成 ∀测序由三博远志公司完成 ∀
112 染病长春花的组织培养与低温保存
剪取长春花幼梢 o用 zx h的乙醇和 s1t h升汞溶液表面消毒 ∀移入长春花生长培养基上 o配方为在 ≥
培养基附加 y p苄氨基腺嘌呤 x °ª#pt和萘乙酸 s1u °ª#pt ∀培养温度 ux ε o光照强度 t sss ∗ t xss ¬¯o光
照时间为 tw «#§pt ∀获得无杂菌的组织培养苗以具节茎段进行定期继代培养繁殖保存 ∀低温保藏时 o将组
培苗切段 o接种在装有培养基试管的斜面上 o约一半茎段埋入培养基中 ∀将试管在正常条件下培养一段时间
后k约 z §l o然后放入 y ∗ ts ε 冰箱内保藏kt ∗ u月取出 t ∗ u次于光照条件下培养 t ∗ u §后重新放回冰箱内
保存lk田国忠等 oussx ~ussyl ∀
113 寄主范围测定
取症状明显的长春花叶片于 s1st °²¯#pt磷酸接种缓冲液中研磨 o然后用金刚砂摩擦接种供试植物 o所
有接种植物都在接种适合期接种 ∀每种植物接种 v ∗ x株 o重复 u次 ∀接种过的植株放在 t{ ∗ ux ε 的防虫
温室中生长 oz §后隔天观察并记录症状 o∞Œ≥„检测接种的叶片 ∀对于不表现症状的植物用摩擦接种的方
法进行回接 o回接的植物同样用 ∞Œ≥„检测k⁄¬­®¶·µ¤ ετ αλot||{l ∀
114 介体昆虫传播试验
将桃蚜k Μψζυσ περσιχαεl放在白菜k Βρασσιχα χηινενσισl上饲养 o连续进行 u ∗ v代的接种鉴定 o确认无病毒症
状后大量饲养繁殖获得无毒蚜 ∀将无毒的桃蚜在培养皿中饥饿 t «o然后取症状明显的长春花幼嫩叶片 o剪
成条状饲喂蚜虫 o待蚜虫饲喂 x ∗ ts °¬±后将蚜虫转移到组培的长春花幼苗上 o每株至少放 x头 ∀饲喂 u «
后用杀虫剂灭蚜 ∀另设不杀灭蚜虫组作为对照 ∀z §后隔天观察并记录症状 o并进行 ∞Œ≥„检测k张鹏飞等 o
usstl ∀
115 酶联免疫吸附测定
采集长春花发病叶片和接种的供试植物显症叶片用包被缓冲液研磨后 o以健康的长春花叶片作为阴性
对照 ∀用上述 uv种抗血清通过抗原包被k¤±·¬ª¨± ¦²¤·³¯¤·¨o„≤°l∞Œ≥„进行检测k≤¯ ¤µ® ετ αλqot|zzl ∀
116 ΧΜς 免疫胶体金层析试纸条的检测
称取感病和健康的长春花叶片各 s1tx ªo分别装入缓冲液包 o用玻璃磨槌把缓冲液包内的样品磨碎 o取
出 ≤  ∂ 免疫胶体金层析试纸条 o按Œ°°∏±²¶·µ¬³×箭头指示方向 o把有箭头的一头插入缓冲液和样品的混合液
中 o箭头大约浸湿 s1x ¦°∀v ∗ x °¬±后观察并记录结果 ∀
117 病毒粗提纯及免疫沉淀病毒粒体电子显微镜观察
取症状明显的长春花幼嫩叶片 tss ªo在液氮中研磨至粉状 ~加入 s1x °²¯#pt的柠檬酸缓冲液k³‹ z1sl
uss °k含 t h巯基乙醇l o氯仿 uss °∀搅拌混匀 ow ε 下 v sss µ#°¬±pt离心 tx °¬±~吸取上层水相 o加入
z1x h的聚乙二醇 ysssk°∞Š ysssl和 w h的 ‘¤≤¯ o溶解后在 w ε 下静置 u «ow ε 下 | sss µ#°¬±pt离心 us °¬±~
ty 第 w期 曹言勇等 }长春花花叶病病原物的分离和鉴定
沉淀 w ε 下悬浮于 s1sx °²¯ #pt的柠檬酸缓冲液中 u «k按初提纯液体积的 tΠx加缓冲液l ~w ε 下 | sss
µ#°¬±pt离心 us °¬±o上清液中加入质量分数 z1x h的 °∞Šy sss和质量分数 w h的 ‘¤≤¯ o溶解后在 w ε 下静置
u «~沉淀 w ε 下重新悬浮于 s1sx °²¯#pt的柠檬酸缓冲液中 u «k按初提纯液体积的 tΠus加缓冲液l ~w ε 下
| sss µ#°¬±pt离心 us °¬±o上清液即为 ≤ ∂ 病毒粗提纯液 ∀
按照体积比 tΠxs在 ≤  ∂ 病毒粗提纯液加入效价为 tΠxtu的 ≤ ∂ 抗血清 ow ε 下 tu sss µ#°¬±pt离心
x °¬±o吸取管底部分的病毒粗提液进行电镜观察 ∀用镊子夹持铜网边缘 o把铜网放在病毒粗提液液滴上 o使
铜网正面与液滴接触 ov °¬±后 o用干净的滤纸从铜网边缘吸去余液 o再用蒸馏水轻轻冲洗铜网 o用干净的滤
纸从铜网边缘吸去蒸馏水 o冲洗 v次 ∀在封口膜上滴上 u h醋酸铀≈˜„ o˜’uk≤‹v ≤’’lu#u‹u ’ 溶液k³‹ w1s
∗ x1ul o用镊子夹持铜网边缘 o把铜网放在醋酸铀液滴上 o使铜网正面与液滴接触 ov °¬±后 o用干净的滤纸从
铜网边缘吸去余液 o重复 v次 ∀将负染好的铜网正置于底部铺有干净滤纸的培养皿中 ovs °¬±后 o在日立
k‹¬·¤¦«¬l透射电镜下观察k电镜型号 ‹2zxsslk郝宏京等 oussyl ∀
118 发病植物叶片 δσΡΝΑ提取
参照 ²µ¬¶等kt|z|l !≤¤¶«§²¯ ¤¯µ等kt|{ul的方法提取发病的长春花叶片 §¶• ‘„ o同时以健康的长春花叶
片作为对照 ∀提取的 §¶• ‘„经 t h琼脂糖凝胶电泳分离 o并在 „¯ ³«¤凝胶成像仪下观察并记录结果 ∀
119 植物总 ΡΝΑ提取
以发病的长春花叶片为材料 o用 וŒ½²¯ 试剂提取总 • ‘„ ∀具体方法参照 Œ±√¬·µ²ª¨±公司 וŒ½²¯ 说明书
k≤«²°¦½¼±¶®¬ετ αλqot|{zl ∀
1110 病毒 ΧΠ基因克隆及序列分析
根据 ‘≤…Œ上登录的 ≤ ∂ ≤°基因的核苷酸序列设计一对引物 o引物序列分别为 }≤ ∂ ≤°ƒ ox. 2„׊ Š„≤
„„„ ×≤× Š„„ ×≤„ „≤≤ „2v. ~≤ ∂ ≤°• ox. 2×≤„ Š„≤ ׊Š Š „Š ≤„≤ ≤≤≤ „Š„ ≤Š×2v. ∀以提取的长春花叶
片总 • ‘„为模板 o用 ≤  ∂ ≤°• 为反转录引物进行反转录 o反应体系kus ˏl为 }w ˏ⁄∞°≤处理的 ‹u ’ ow ˏx
≅反转录缓冲液 ot ˏts °°²¯#pt §‘×°¶ot ˏ≤ ∂≤°• kus °°²¯#ptl ot ˏkws ˜l• ‘„酶抑制剂 ov ˏ总
• ‘„ ot ˏkuss ˜l 2∂ 反转录酶 ∀yx ε 水浴 x °¬±owu ε 水浴 ys °¬±∀以反转录产物为模板 o用引物
≤  ∂ ≤°ƒ o≤ ∂ ≤°• 进行 °≤• 扩增 ∀同时以另一对引物k扩增 ≤°部分片段l进行扩增作对照 o引物序列分别
为 }≤ ∂xƒ ox. 2„≤Š ×ׄ Š≤„ Š≤× ŠŠ× ≤Š× ≤≤2v. ox. 2×≤„ Š„≤ ׊Š Š„Š ≤„≤ ≤≤≤ „Š„ ≤2v. ∀反应条件为 }
|w ε ov °¬±~|w ε ovs ¶ox| ε ovs ¶ozu ε ot °¬±ovs次循环 ~zu ε ots °¬±∀
将 °≤• 产物用 t h琼脂糖凝胶电泳 o切下凝胶中与预期大小相符的片段 o用 ⁄‘„凝胶回收试剂盒回收
后与 ³⁄t{2×连接后转化大肠杆菌 ⁄‹xΑo碱裂解法提质粒 o进行 °≤• !酶切验证 o将验证正确的阳性克隆送
公司进行测序 o用 ⁄‘„„‘和 …„≥×软件k‘≤…Œo«·³}ΠΠººº q±¦¥¬q±¯ ° q±¬«qª²√Π…„≥×lk„¯·¶¦«∏¯ ετ αλqot||sl
对序列进行生物信息学分析 ∀本文引用的 ≤ ∂ 株系或分离物的 ≤°基因序列信息如表 t所示 ∀
u 结果与分析
211 田间病害症状与危害
在同一地块 o不同植株可能因感染时期不同而表现出不同的症状k图 tl ∀主要表现有 }tl普通花叶 }叶
片褪绿 !疱斑 ~ul叶片畸形 }叶片皱缩 !扭曲 !向背面卷曲 !叶尖变窄或整个叶片变窄 o呈蕨叶状 ~vl植株矮化 }
节间缩短 !植株矮化 !丛生或簇生 ~wl花小 !变形或杂色 }花瓣由心形变为窄条状或花变小至退化 o玫瑰红色
花瓣上嵌有深红色或浅色条斑 o严重时不开花 o病株一般不能结实 ∀病害严重影响长春花植株的生长 o不但
失去观赏价值 o同时也明显降低或使其失去其药用价值 o在生产上造成严重危害 ∀
212 染病苗的组织培养与保存
用采自海南的长春花花叶病外植体 o通过组织培养获得了染病的长春花组织培养苗 ∀组培苗叶片表现
出与田间病株类似的叶片皱缩 !扭曲或疱斑花叶等症状 o但叶片明显比田间病株黄化 o症状也相对较轻 ~在
组培过程中有部分苗易出现玻璃化现象k图 ul ∀
染病苗以茎段继代培养 t年以上 o病苗的症状维持稳定 ∀将茎段转移至装有组培培养基的试管斜面上 o
在低温下冷藏可长期保藏染病组培苗作为毒原 ∀
uy 林 业 科 学 ww卷
表 1 引用的 ΧΜς 株系或分离物
Ταβ .1 ΧΜς στραινσΠισλολατεσ εµ πλοψεδ φορ σεθυενχεσ αλιγνµεντ
简称
„¥¥µ¨√¬¤·¬²±
登录号
„¦¦¨¶¶¬²± ‘²q
株系或分离物
≥·µ¤¬± ²µ¬¶²¯¤·¨
所属亚组
≥∏¥ªµ²∏³
来源地
յ»±
ƒ· ⁄u{w{z ƒ·2≤  ∂ Œ„ 日本 ¤³¤±
≤¶ ⁄u{w{| ≤¶2≤  ∂ Œ„ 日本 ¤³¤±
≠ ⁄tuw|| ≠2≤  ∂ Œ„ 日本 ¤³¤±
’ ⁄ssv{x ’2≤  ∂ Œ„ 日本 ¤³¤±
≤¤·«¤µ¤±·«∏¶¥µ „≠vzy{ws ≤¤·«¤µ¤±·«∏¶¥µ2≤  ∂ Œ„ 巴西 …µ¤½¬¯
Ž²µ vyuxt Ž²µ¨¤± ≤  ∂ Œ„ 韩国 Ž²µ¨¤
Ž „ƒtuz|zz Ž2≤  ∂ Œ… 中国 ≤«¬±¤
•¥ „ssy||s • ¥2≤  ∂ Œ… 中国 ≤«¬±¤
≤zu ⁄wusz| ≤zu2≤  ∂ Œ… 日本 ¤³¤±
≥⁄ „…ss{zzz ≥⁄2≤  ∂ Œ… 中国 ≤«¬±¤
≤«¦∏ ÷yxstz ≤«¦∏2≤  ∂ Œ… 中国 ≤«¬±¤
°¯¤±· ˜vu{x{ °¯¤±·¤¬±2≤  ∂ Œ… 哥伦比亚 ≤²¯²°¥¬¤
≥³tsw ˜ts|uw ≥³¬±¤¦«tsw≤  ∂ ŒŒ 美国 ˜≥„
¶ „ƒtuz|zy ¶2≤  ∂ ŒŒ 美国 ˜≥„
± utwyw ±2≤  ∂ ŒŒ 澳大利亚 „∏¶·µ¤¯¬¤
Ž¬± tu{t{ Ž¬±2≤  ∂ ŒŒ 苏格兰 ≥¦²·¯¤±§
u „…ssy{tv u2≤  ∂ ŒŒ 日本 ¤³¤±
≥± ˜uu{uu ≥±2≤  ∂ ŒŒ 澳大利亚 „∏¶·µ¤¯¬¤
≥ „ƒsyvyts ≥2≤  ∂ ŒŒ 南非 ≥²∏·« „©µ¬¦¤
≤¤·«¤µ¤±·«∏¶¦± ∞ƒwtzxz{ ≤¤·«¤µ¤±·«∏¶¦±2≤  ∂ 待定 ˜±¦¨µ·¤¬± 中国 ≤«¬±¤
Œ°³¤·¬¨±¶¦± ∞ƒwtzxz| Œ°³¤·¬¨±¶¦±2≤  ∂ 待定 ˜±¦¨µ·¤¬± 中国 ≤«¬±¤
图 t 长春花花叶病田间症状
ƒ¬ªqt ׫¨ ³¨µ¬º¬±®¯¨ °²¶¤¬¦§¬¶¨¤¶¨ ¶¼°³·²°¶
„ ∗ ⁄为染病长春花症状 o∞ !ƒ为健康长春花 ∀Œ±©¨¦·¨§³¯¤±·¶k„ ∗ ⁄l ¤±§«¨ ¤¯·«¼ ³¯¤±·¶k∞oƒl q
213 血清学测定
感病的长春花叶片用 uv种
抗血清 ∞Œ≥„检测结果显示 o与
≤  ∂ 抗血清有较强的阳性反
应 o与其他 uu种抗血清无反应
k表 ul ∀感病的长春花叶片汁
液摩擦接种的供试植物用 ≤  ∂
抗血清 ∞Œ≥„检测 o也呈较强的
阳性反应 ∀经蚜虫传毒的长春
花植株发病后 ∞Œ≥„ 检测也与
≤  ∂ 抗血清有较强阳性反应 ∀
分别将适量的感病和健康
的长春花叶片装入缓冲液包研
碎后 o将病毒免疫胶体金试纸条
插入混合液中 ov ∗ x °¬±后 o在
感病长春花叶片混合液中的试
纸条在检测区和对照区各形成
一条红色线 o而健康样品混合液
中的试纸条和 א ∂ 试纸条只在
对照区形成一条红色线k图 vl ∀
该结果进一步说明感病长春花
叶片中含有 ≤  ∂ 而不含有
א ∂ o与 ∞Œ≥„ 测定结果一致 ∀
用 ≤ ∂ 免疫胶体金试纸条也从
染病的长春花组织培养苗中检
测出 ≤  ∂ 的存在 o说明病毒在
组培苗中得到有效地保存 ∀
vy 第 w期 曹言勇等 }长春花花叶病病原物的分离和鉴定
图 u 长春花染病组织培养苗表现花叶症状
ƒ¬ªqu Œ±©¨¦·¨§³¨µ¬º¬±®¯¨³¯¤±·¶¦∏¯·∏µ¨§ ιν ϖιτρο ¶«²º¬±ª °²¶¤¬¦¶¼°³·²°¶
214 寄主范围与传播方式
该病原物接种 y 科 tx 种植物后
的症状表现及接种后与 ≤ ∂ 抗血清
的反应见表 v ∀在茄科和葫芦科植物
上症状主要表现为系统花叶 o在豆科
和藜科植物上症状表现主要表现局部
坏死斑 ∀不侵染禾本科植物 ∀
试验结果显示 o长春花病原物不
仅极易通过摩擦接种传播 o也可以通
过桃蚜传播 ∀桃蚜传播后发病周期为
{ ∗ tu §∀
用染病长春花组培苗汁液磨擦接
种普通烟 !本生烟和白肋烟皆表现典
型的花叶症状k图 wl ∀
215 病毒粒体形态
表 2 用不同血清采用 ΕΛΙΣΑ对长春花病叶
检测结果 ≠
Ταβ .2 ΕΛΙΣΑ ρεσυλτσ οφινφεχτεδ περιωινκλελεαϖεσ
υσινγ αντιβοδιεσ αγαινστ διφφερεντ ϖιρυσεσ
病毒抗血清
∂¬µ∏¶¤±·¬¥²§¼
„wxs
wxs ±° ¤¥¶²µ³·¬²± √¤¯∏¨ ΙΠΗ
°¨ ³²∂ s1swx s1xyu x
≥ ∂ s1syy s1{ux s
×∏ ∂ s1sxz s1zt{ w
•  ∂ s1sxw s1yz{ w
°∂ ≠ s1swv s1xwu w
≥… ∂ s1sxx s1y{z y
≥´ ∂ s1syv s1z{y |
≥≤  ∂ s1sv| s1w{z x
≠  ∂ s1sws s1xst u
א ∂ s1sxv s1yyw y
°¨ ± ∂ s1sv{ s1wzx v
°≠⁄∂ s1swx s1xyv {
 ¨ ∂ s1sxu s1yxs s
≤  ∂ v1us ws1sss s
„µ ∂ s1swy s1xzx s
’• ≥∂ s1szs s1{zx v
 ∂ s1swy s1xzw |
°≥∂ s1s{s t1sst v
°∂ ÷ s1sys s1zxv t
°‘• ≥∂ s1swz s1x{z x
×≥ • ∂ s1sxt s1yvz x
Šƒ∂ s1swx s1xyu x
• ∂  ∂ s1swu s1xux s
≠ ΙΠΗ € k样品平均吸光值 p 空白对照平均吸光
值lΠk健康对照平均吸光值 p空白对照平均吸光值l ∀ ΙΠ
Η€ k¶¤°³¯¨¤√¨ µ¤ª¨ ¤¥¶²µ³·¬²± √¤¯∏¨ p ¥¯¤±® ¦²±·µ²¯ ¤√¨ µ¤ª¨
¤¥¶²µ³·¬²± √¤¯∏¨ lΠk«¨ ¤¯·«¼ ¦²±·µ²¯ ¤√ µ¨¤ª¨ ¤¥¶²µ³·¬²± √¤¯∏¨ p
¥¯¤±®¦²±·µ²¯ ¤√¨ µ¤ª¨ ¤¥¶²µ³·¬²± √¤¯∏¨ l q
粗提纯的病毒粒体经 ≤  ∂ 抗血清免疫沉降后进行负染 o
在透射电镜下观察到典型的球状病毒粒体 o平均直径为 u{ ∗
vs ±° o病毒粒体中央有致密电子心k图 xl ∀
216 δσΡΝΑ的提取结果
从发病的幼嫩长春花叶片提取 §¶• ‘„ o从提取的 §¶• ‘„
凝胶电泳结果k图 yl可以看出 o有 x条 §¶• ‘„条带 o大小分别
为 v1v !v1s !u1u和 s1| ®¥o还有一条 s1v ®¥左右的 §¶• ‘„条
带 o健康对照长春花叶片没有检测到任何 §¶• ‘„条带 ∀这与
≤  ∂ 产生的§¶• ‘„大小相符 o而 s1v ®¥左右的§¶• ‘„条带可
能是病毒卫星 • ‘„ ∀
217 ΧΜς ΧΠ基因的扩增 !ΠΧΡ 产物的克隆 !测序及序列分
析
提取发病长春花叶片的总 • ‘„ o以反转录后的 ¦⁄‘„ 为
模板 ou 对引物均扩增出预期大小的条带 o引物 ≤  ∂ ≤°ƒ !
≤  ∂ ≤°• 扩增出大小为 yxs ¥³左右的条带 ∀作为对照的一对
引物 ≤  ∂xƒ !≤ ∂v• 扩增出大小为 xus ¥³左右的条带k图
zl ∀
°≤• 产物回收后克隆到 ³⁄t{2× o挑选验证好的阳性克
隆测序 ∀对测序结果用 ⁄‘„„‘和 ‘≤…Œ的 …„≥×软件分析
发现 o侵染长春花的 ≤  ∂ 的 ≤°基因k登录号 o∞ƒwtzxz{l在核
苷酸水平上与 Š¨ ±…¤±®中已登录 ≤ ∂ 的 ≤°基因的序列同源
性最高为 |z1uy h k≤ ∂uwv株系 o登录号 „x{xxut1tl o最低为
|v h k≤ ∂ …„• |yΠt分离物 o登录号 „{u|zzz1tl ~而与国外
报道的侵染长春花的 ≤  ∂ 的 ≤° 基因同源性为 |v1|t h ∀在
氨基酸水平上 o与其他 ≤ ∂ 株系或分离物的同源性为 |{ h ∗
|| h ∀
218 ΧΜς 中国长春花分离物分类地位的确定
将 ≤ ∂ 长春花中国分离物k¦¤·«¤µ¤±·«∏¶¦±2≤  ∂l≤°基因的核苷酸序列与 ≤  ∂ 的 v个亚组 t|种分离物
或株系k表 tl≤°基因的核苷酸序列在 ⁄‘„„‘中进行比对并生成系统进化树k图 {l o从系统进化树上可以
看出 o≤¤·«¤µ¤±·«∏¶¦±2≤  ∂ 与 ≤  ∂ Œ…亚组的 Ž!• ¥!≤zu !≥⁄!≤«¦∏株系有较近的亲缘关系 o与 • ¥2≤ ∂k赤豆中
wy 林 业 科 学 ww卷
表 3 在供试植物上的症状表现 ≠
Ταβ .3 Σψµ πτοµσ οφ τηεινοχυλατεδ πλαντσ ωιτη τηε χρυδε σαπ οφ
ινφεχτεδ περιωινκλε τισσυεσ
供试植物
× ¶¨·³¯¤±·¶
症状 3
≥¼³·²°¶
与 ≤  ∂ 抗血清的反应 σ
≥ µ¨²¯²ª¬¦¤¯ µ¨¶∏¯·¶
普通烟k Νιχοτιανα τοβαχυµl Π’ nΠn
珊西烟k Ν q σαντηι2νχl Π’ nΠn
茄科
≥²¯¤±¤¦¨¤¨ 本生烟k Ν q βεντηαµιαναl
f ≤µΠ’
白肋烟k Ν qβυρλεψl f Π’
番茄kΛψχοπερσιχον εσχλτεντµl ¶·Π≤µ nΠn
大豆k Γλψχινε µαξl pЏ‘ pΠn
豆科
¨ª°¬±²¶¤¨ 蚕豆kςιχια φαβαl pЏ‘ pΠn
豇豆 kςιγνα σινενσισl pЏ‘ pΠn
藜科 昆诺藜 k Χηενοποδιυµ θυινοαl pЏ‘ pΠn
≤«¨ ±²³²§¬¤¦¨¤¨ 苋色藜k Χηενοποδιυµ αµαραντιχολαl pЏ‘ pΠn
黄瓜k Χυχυµισσατιϖυσl Π’ nΠn
葫芦科
≤∏¦∏µ¬¥¤¦¨¤¨ 西葫芦k Χυχυριβιτα πεποl Π’ nΠn
南瓜k Χιτρυλλυσλανατυσl Π’ nΠn
番杏科
× ·¨µ¤ª²°¬¤¦¨¤¨ 番杏k Τετραγονια εξπανσαl pΠ≠≥ pΠn
禾本科
Šµ¤°¬±¨ ¤¨ 玉米k Ζεα µαψσl pΠp pΠp
≠ 3 为系统叶症状Π接种叶症状 ∀  }系统花叶 ~ ’ }无症带毒 ~¶·}矮化 ~ ≤µ}皱缩 ~‘}局部
坏死斑 ~ ≠≥ }黄斑 ~p }不侵染 ∀ σ为系统叶与 ≤  ∂ ∞Œ≥„反应Π接种叶与 ≤  ∂ ∞Œ≥„反应结果 ∀
n }阳性 ~p }阴性 ~ f }用染病长春花汁液接种 ∀ 3 Œ±§¬¦¤·¨¶¶¼¶·¨°¬¦Π¬±²¦∏¯¤·¨§¯¨ ¤√¨ ¶¼°³·²°¶q  }
≥¼¶·¨°¬¦°²¶¤¬¦~’ }„¶¼°³·²°¤·¬¦¬±©¨¦·¬²±~¶·}≥·∏±·~≤µ}≤µ¬°³¯¨~‘}²¦¤¯ ±¨ ¦µ²·¬¦¶³²·~≠≥ }≠¨¯ ²¯º
¶³²·~p } ƒ¤¬¯ ·² ¬±©¨¦·¬²±q σ } ∞Œ≥„ √¤¯∏¨ ²©¶¼¶·¨°¬¦¯¨ ¤√¨ ¶Π¬±²¦∏¯¤·¨§¯¨ ¤√¨ ¶∏¶¬±ª ¤±·¬¥²§¼ ¤ª¤¬±¶·
≤ ∂ q n }°²¶¬·¬√¨µ¨¤¦·¬²±qp }‘¨ª¤·¬√¨ µ¨¤¦·¬²±~ f }Œ±²¦∏¯¤·¬²± º¬·«·«¨ ¦µ∏§¨ ¶¤³²©¬±©¨¦·¨§ ³¯¤±·¯¨·¶
¦∏¯·∏µ¨§ ιν ϖιτρο q
国分离物lk周雪平等 ot||w ~
刘勇等 ot|||l亲缘关系最近 o
而与 Œ„亚组和 ŒŒ亚组亲缘关
系较远 o因此 o≤ ∂ 中国长春
花分离物应初步归为 Œ…亚组 ∀
v 讨论
长春花是我国一种重要的
园艺观赏植物 o也是重要的药
源植物 ∀通过生物学和分子生
物学的方法进行病原物鉴定发
现 o广东和海南长春花花叶病
主要为 ≤ ∂ 侵染所致 o与以前
的报道吻合k孔宝华等 ousssl ∀
本研究首次对我国 ≤  ∂ 的长
春花分离物的 ≤°基因进行了
测序与 §¶• ‘„ 分离 o基于 ≤°
基因的生物信息将其初步归为
≤  ∂ Œ…亚组 o国外报道的侵染
长春花的 ≤  ∂ 株系为 Œ„亚组
成员 o说明二者的亲缘关系较
远 ∀ 本 文 研 究 发 现 o
图 v 病毒免疫胶体金试纸条检测长春花病组织
ƒ¬ªqv ≤  ∂ ¤¶¶¤¼ ∏¶¬±ªŒ°°∏±²¶·µ¬³× ©µ²°¬±©¨¦·¨§³¨µ¬º¬±®¯¨·¬¶¶∏¨¶
„ }试纸条检测方法 Œ±§¬¦¤·¬±ª¤¶¶¤¼ °¨ ·«²§~…}用长春花病叶的检测结果k下条l与健
康叶片对照 k上条l „¶¶¤¼ µ¨¶∏¯·¶²©¬±©¨¦·¨§k∏³³¨µ¶·µ¬³l ¤±§ «¨ ¤¯·«¼ ³¨µ¬º¬±®¯¨k ²¯º µ¨
¶·µ¬³l q
≤¤·«¤µ¤±·«∏¶¦±2≤  ∂ 与 • ¥2≤  ∂ 的亲缘关
系较近k图 {l o周雪平等kt||wl将从豆科
植物上分离到的 ≤  ∂ 的 x个分离物分为
两个型 o分型的依据是这 x个分离物在豇
豆 !豌豆 !菜豆和蚕豆上的症状反应 o将在
该 w种豆科植物上症状表现为局部枯斑
的定为 Œ型 o产生系统症状的定为 ŒŒ型 o
根据此定型依据 o•¥2≤ ∂ 属于 Œ 型 ∀
≤¤·«¤µ¤±·«∏¶¦±2≤  ∂ 接种豆科植物亦表现
局部枯斑症状k表 vl o同时 o•¥2≤  ∂ 与
≤¤·«¤µ¤±·«∏¶¦±2≤ ∂ 在茄科 !藜科 !葫芦
科 !番杏科上的症状亦一致 ∀这进一步表
明了二者较近的亲缘关系 ∀同时二者在地理分布上也较为相近 o与 Œ…亚组的在核苷酸同源性相对较低的中
国分离物如 oŽ!• ¥!≥⁄!≤«¦∏地理分布较远 ∀
•²²¶¬±¦®等kt|||l根据 ≤  ∂ • ‘„v的 x.端非翻译区kx. ‘²±·µ¤±¶¯¤·¨§µ¨ª¬²±ox. ‘ו l将 ≤  ∂ 的 uy个株系
划分在 Œ„ !Œ…和 ŒŒv个亚组 o为了证明这一观点 o作者将 ≤  ∂ xv个株系的 ≤°基因进行系统进化分析 o发现 Œ
亚组可以划分为 Œ„和 Œ… u个亚组 ∀• ‘„病毒往往进化很快 o很高的突变率是一个重要原因 o不同基因组之
间的重排以及 • ‘„与 • ‘„间的重组也是不可忽视的因素 o在黄瓜花叶病毒属中由于重排产生新种的例子
很多k • «¬·¨ ετ αλqot||xl ∀在雀麦花叶病毒属中 o• „‘t !• ‘„u的 x. 端非编码区相对于 • ‘„v的 x. ‘ו 更为
保守 o而 • ‘„v的 x. ‘ו 易发生重排或重组 !缺失 !插入 o而 • ‘„v的 x. ‘ו 发生的重排或重组 !缺失 !插入正
是 ≤ ∂ 各亚组病毒辐射进化的首要原因k•²²¶¬±¦® ετ αλqot|||l ∀本研究用 ≤¤·«¤µ¤±·«∏¶¦±2≤ ∂ 的 ≤°基因
与其他 ≤ ∂ 的 ≤° 基因进行比对 o根据比对结果将 ≤¤·«¤µ¤±·«∏¶¦±2≤  ∂ 初步划为 Œ…亚组 o因此 o克隆
≤¤·«¤µ¤±·«∏¶¦±2≤ ∂ • ‘„v的 x. ‘ו o和其他株系或分离物的 • ‘„v的 x. ‘ו 进行比对 o根据比对结果明确其
xy 第 w期 曹言勇等 }长春花花叶病病原物的分离和鉴定
图 w 用染病长春花组培苗汁液摩擦接种烟草
ƒ¬ªqw Νιχοτιανᶳ³q¶¨ §¨¯¬±ª¶µ∏¥2¬±²¦∏¯¤·¨§º¬·«
·«¨ ¦µ∏§¨ ¶¤³©µ²°·«¨ ¬±©¨¦·¨§³¨µ¬º¬±®¯ ¬±·¬¶¶∏¨ ¦∏¯·∏µ¨ ¶¨ §¨¯¬±ª¶
„ }本生烟接种病汁液 ~ …}白肋烟清水对照 ~ ≤ }白肋烟接种病汁液 ∀ ≥¼°³·²°¶²© Ν q
βεντηαµιαναk„l ¤±§ Νqταβαχυµ º«¬·¨ ¥∏µ¯¨ ¼ k≤lµ∏¥2¬±²¦∏¯¤·¨§º¬·«¦µ∏§¨ ¶¤³o°²¦®2¬±²¦∏¯¤·¨§º«¬·¨
¥∏µ¯¨ ¼ k…l º¤¶¤¶¤¦²±·µ²¯ q
分类地位是非常必要的 ∀
金免疫层析法是近几年来国
外兴起的一种快速诊断技术 o已经
在肿瘤标志物 !生育指标及部分动
植物疾病检测方面得到了相当普
及和推广 ∀从本试验测定结果来
看 o与传统的 ∞Œ≥„检测相比 o金
免疫层析法不需要任何特殊的仪
器设备 o而且检测快速 o整个操作
时间少于 tx °¬±o操作简便 !快速 !
准确 !自带质控对照 !不需任何附
加试剂 ∀而其敏感性与特异性与
∞Œ≥„ 几乎无差别 k王玉金等 o
图 x 病毒粒子的电子显微镜观察结果
ƒ¬ªqx ’¥¶¨µ√¤·¬²± ²©√¬µ¤¯ ³¤µ·¬¦¯ ¶¨¥¼ ¨¯ ¦¨·µ²± °¬¦µ²¶¦²³¼
图 y 染病长春花 §¶• ‘„
ƒ¬ªqy ∞¯ ¦¨·µ²³«²µ¨¶¬¶²©§¶• ‘„ ©µ²°
¬±©¨¦·¨§³¨µ¬º¬±®¯¨¯¨ ¤√¨ ¶
 }Κ⁄‘„ ΕχοьΠΗιν§ŒŒŒ °¤µ®¨µ∀ t }海南长春花病叶
§¶• ‘„ ~u }广州长春花病叶 §¶• ‘„ ~v }海南长春花健
康叶 §¶• ‘„ ~w }广州长春花健康叶 §¶• ‘„ ∀  }Κ⁄‘„
ΕχοьΠΗιν§ŒŒŒ °¤µ®¨µq Œ±©¨¦·¨§ ³¨µ¬º¬±®¯¨ ¯¨ ¤√ ¶¨kt o
‹¤¬±¤± ¤±§u oŠ∏¤±ª½«²∏l ¤±§ «¨ ¤¯·«¼ ¯¨ ¤√ ¶¨kv o‹¤¬±¤±
¤±§w oŠ∏¤±ª½«²∏l §¶• ‘„ q
ussv ~ 徐葛林
等 oussw ~ ≤«²¬
ετ αλqot|||l ∀
因此在病毒病
的田间快速诊
断方面有相当
大的优势 ~然
而 o由于每张试
纸条只能用于
一个样品一种
病原的检测 o因
此采用国外进
口产品进行大
量样品检测时其成本高于 ∞Œ≥„ ∀而且 o目前的试纸条只能进行
定性检测 o还不能定量 ∀因而 o国内开发此类产品的目标应考虑试
纸条的定量检测和降低成本方面进行探索 ∀
由于 ≤ ∂ 的病毒粒体比较小 o如果在病组织中的滴度比较低
时 o电镜观察时不易观察到 ~同时由于其粒体小 !杂蛋白混淆 o在
电镜下病毒粒子少时难以辨认 ∀过去对于粒体直径为 vs ±°或更
小的病毒粒子 o常用超速离心或梯度密度离心方法获得纯病毒粒
体进行观察 o但在电镜下观察高密度的病毒粒子也比较困难 ∀作
者在进行电镜观察之前对病毒粗提液里的病毒粒体用 ≤ ∂ 抗血
清进行免疫沉降 o然后负染观察 o达到了理想的效果 ∀本文将效价
为 tΠxtu的 ≤ ∂ 抗血清加入 ≤  ∂ 病毒粗提液中对病毒粒体免疫
沉降后 o在电镜下观察 o几乎每个视野下都能看见病毒粒子 o甚至有成堆的病毒粒子k图 xl ∀
长春花花叶病病株在组培时有黄化现象 o与本实验室保存的感染植原体的长春花变叶病组培苗症状相
比 o二者是有明显差异的 o后者表现为叶片变小 !叶色淡或脉间褪绿黄化 !多数有腋芽分化和丛生等症状k田
国忠等 oussx ~ussyl ∀长春花组培苗冷藏时 o冷藏温度比本实验室保藏的感染植原体的枣树k Ζιζιπηυσϕυϕυβαl
和泡桐k Παυλοωνιγ φορτυνειl组培苗冷藏温度高 t ∗ u ε o温度范围在 { ∗ ts ε 为宜 ∀这可能与长春花为南方热
带适生植物 !对低温更敏感有关 ∀
已知 ≤  ∂ 能侵染 t sss多种植物 o其中许多寄主植物为园艺植物k≤«¨ ±oussvl o它有一系列的自然寄主 o
何氏凤仙kΙµπατιενσ ωαλλεραναl是其中一种k²¨ ¥¨ ±¶·¨¬± ετ αλqot||x ~ ‹ µ¨²¯§ot|ywl ∀有趣的是 o作者在采集长
yy 林 业 科 学 ww卷
图 z ≤  ∂ ≤°基因 • ×2°≤• 结果
ƒ¬ªqz • ×2°≤• ³µ²§∏¦·¶²© ≤  ∂ ª¨ ±¨
 }⁄usss ⁄‘„ ¤¯§§¨µ∀ t }海南长春花病叶 °≤• 扩增 k引物
≤  ∂xƒiv• l ~ u }广 州 长 春 花 病 叶 °≤• 扩 增 k引 物
≤  ∂xƒiv• l ~v }海南长春花叶 °≤• 扩增k引物 ≤  ∂ ≤°ƒi• l ~
w }广州长春花病叶 °≤• 扩增k引物 ≤  ∂ ≤°ƒi• l ∀  o⁄usss
⁄‘„ ¤¯§§¨µq ≤  ∂ ª¨ ±¨ ¬± ·²·¤¯ • ‘„ ©µ²° ‹¤¬±¤±kt ¤±§vl ¤±§
Š∏¤±ª½«²∏ku ¤±§ wl ¬±©¨¦·¨§ ³¨µ¬º¬±®¯¨ ¯¨ ¤√¨ ¶o ¤°³¯¬©¼¬±ª ¥¼
³µ¬°¨ µ¶≤ ∂xƒiv• kt ¤±§ul ¤±§≤  ∂ ≤°ƒi• kv ¤±§wl q
春花病样时 o在发病长春花植株旁边有表现花叶症状的何
氏凤仙 o通过生物学何分子生物学的方法鉴定其病原物也
为 ≤  ∂ o而且发现侵染何氏凤仙和长春花的 ≤  ∂ 的 ≤°基
因k登录号 o∞ƒwtzxz|l在核苷酸水平上几乎没有差异k图
{l ∀因此推测二者可能互为传染源 ∀
从病害调查与病毒鉴定结果分析 o此病害的发生和流
行 o与病害的初侵染源 !蚜虫介体密度 !栽植与管理方式 !病
毒的株系以及品种的抗性等都有关系 ∀病害的初侵染源可
能来自带毒的种子 o也可能通过扦插育苗带毒或在人工修
剪 !采收过程中传病 ∀比如 o在三亚鹿回头公园边的山坡下
和儋州市的一些地块 o分布着野生的紫花和白花长春花 o
ussw和 ussx年 u次调查都未发现明显的病毒病症状的病
株 o而在三亚市区的庭院内的长春花则发现典型的病毒病
危害 ∀说明初侵染源的存在是病害发生和流行的关键 ∀种
子或种苗带毒可能是长春花集约栽培过程中病害流行的重
要因子 ∀比如在琼海博鳌镇 o病害的严重发生可能与种子
带菌 !密植 !所栽植的紫花长春花感病 !扦插育苗 !多次收割
茎叶造成接触传染有关 ∀所以 o从病害防治角度 o加强种子
和种苗检验与检疫 !及时清除少量病株毒原 !避免人为损伤
引起的汁液传染 !控制蚜虫危害 !栽种抗病品系等措施是病
害防治的重要措施 ∀无 ≤  ∂ 毒源的地区 o选用不带毒种子和种苗是控制病害关键的措施 ∀
图 { ≤  ∂ 中国长春花分离物与 ≤  ∂ v个亚组 t{个分离用 ⁄‘„„‘比对后生成的系统进化树
ƒ¬ªq{ °«¼¯²ª¨ ±¨ ·¬¦·µ¨¨²© ≤  ∂ ≤° ª¨ ±¨ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨¶²© ≤  ∂ Χατηαρανηυ󬶲¯¤·¨¶¤±§²·«¨µt{ ≤  ∂ ¶·µ¤¬±¶Π¶·µ¤¬±¶
∏¶¬±ª·«¨ ⁄‘„„‘k√¨ µ¶¬²±ox1u1ul ³µ²ªµ¤° k…¤µox h ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ §¬√¨ µª¨ ±¦¨l
zy 第 w期 曹言勇等 }长春花花叶病病原物的分离和鉴定
参 考 文 献
蔡 红 o孔宝华 o陈海如 qussv1 长春花黄化植原体k°≠l株系的检测与鉴定 q微生物学报 owvktl }tty p tt|1
蔡连捷 o闫有旺 qussx1 长春花的栽培及其利用 q特种经济动植物 oykxl }t|1
郝宏京 o高 强 o李 元 o等 qussy1 浅谈负染色技术及其应用 q天美科技通讯 }电镜专刊 oktsl }ts p tt1
孔宝华 o蔡 红 o陈海如 o等 qusss1 ||世博会植物病毒种类的调查与鉴定初报 q植物检疫 otwkvl }tvu p tvw1
刘 勇 o周雪平 o薛朝阳 o等 qt|||1 黄瓜花叶病毒赤豆分离物外壳蛋白序列分析及原核表达 q农业生物技术学报 ozktl }xt p xx1
田国忠 o李建民 o朴春根 o等 qussy1 不同来源植原体组织培养苗的长期保藏研究 Μ彭友良 q中国植物病理学会 ussy年学术年会论文集 q北京 }
中国农业科技出版社 otvz p tv|1
田国忠 o温秀军 o李 永 o等 qussx1 枣疯病和泡桐丛枝病原植原体分离物的组织培养保藏和嫁接传染研究 q林业科学研究 ot{ktl }t p |1
王玉金 o王玉珠 o杨书豪 o等 qussv1 胶体金免疫层析法检测血清癌胚抗原标记 q免疫分析与临床 otskvl }tyz p ty|1
徐葛林 o胡巧玲 o吴 杰 o等 qussw1 检测狂犬病毒的胶体金免疫层析法的建立及应用 q中国人兽共患病杂志 ouskvl }uvy p uv{1
云青柳 qussx1 长春花的栽培及观赏利用 q热带林业 ovvkwl }wx p wz1
张鹏飞 o陈建群 o张 闲 o等 qusst1 棉蚜获得黄瓜花叶病毒的行为与取食过程的关系 q昆虫学报 owwkwl }v|x p wst1
周雪平 o濮祖芹 o方中达 qt||w1 豆科植物上分离的黄瓜花叶病毒k≤  ∂l五个分离物的比较研究 q中国病毒学 o|kvl }uvu p uv{1
朱 纯 o阮 琳 o卢树洁 o等 qussu1 长春花疫病的发生危害与防治 q植物保护 ou{kwl }vy p v|1
„¯·¶¦«∏¯ ≥ ƒ oŠ¬¶« • o  ¼¨¨ µ¶∞ • o ετ αλqt||s1 …¤¶¬¦ ²¯¦¤¯ ¤¯¬ª±° ±¨·¶¨¤µ¦«·²²¯ q ²¯ …¬²¯ outx }wsv p wts1
≤«²°¦½¼±¶®¬° o≥¤¦¦«¬‘oŽ¬±ª¶·²± • ∞o ετ αλqt|{z1 ≥¬±ª¯ 2¨¶·¨³ ° ·¨«²§¶²© • ‘„ ¬¶²¯¤·¬²± ¥¼ ¤¦¬§ª∏¤±¬§¬±∏°·«¬²¦¼¤±¤·¨2³«¨ ±²¯2¦«¯²µ²©²µ° ¬¨·µ¤¦·¬²±q„±¤¯
…¬²¦«¨ ° otyu }txy p tx|1
≤¤¶«§²¯ ¤¯µ• o∞¶³¤µ½¤o‹∏§¶²±oŠ • o ετ αλqt|{u1≤ ²¯±¬±ª·«¨ §²∏¥¯ 2¨¶·µ¤±§¨§• ‘„ ª¨ ±¨ ¶²©µ¨²√¬µ∏¶}¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ²©·«¨ ¦¯²±¨ §≥u ª¨ ±¨ q°µ²¦‘¤·¬„¦§¤≥¦¬o
z| }zyww p zy{{1
≤«¨ ± ≠ Žqussv1 ’¦¦∏µµ¨±¦¨ ²©¦∏¦∏°¥¨µ°²¶¤¬¦√¬µ∏¶¬± ²µ±¤° ±¨·¤¯ ³¯¤±·¶¤±§³¨µ¶³¨¦·¬√ ¶¨²©·µ¤±¶ª¨ ±¬¦¦²±·µ²¯ q°« ⁄ §¬¶¶¨µ·¤·¬²± • ¤ª¨ ±¬±ª¨ ± ˜±¬√ µ¨¶¬·¼o
• ¤ª¨ ±¬±ª¨ ± o·«¨ ‘¨·«¨µ¯¤±§¶ux p u{1
≤«²¬ oŽ¬° ≥ ≠ o ≤«²¬o ετ αλqt|||1 ⁄¬ª²¬¬± ¤±·¬¥²§¼ º¬·« ≤²¯ ²¯¬§¤¯ ª²¯§¤±§©¨µµ²¦¨±¨ ©²µ¬·¶∏¶¨ ¬± ¤ ° °¨¥µ¤±¨ ¬°°∏±²¶·µ¬³ ¤±§¬°°∏±²¶¨±¶²µq
¬¦µ²¦«¨ °¬¦¤¯ ²∏µ±¤¯ oyv }|u p ||1
≤ ¤¯µ®  ƒ o„§¤°¶„ ‘qt|zz1 ≤«¤µ¤¦·¨µ¬¶·¬¶²©·«¨ °¬¦µ²³¯¤·¨ ° ·¨«²§²© ±¨½¼° 2¨¯¬±®¨ §¬°°∏±²¶²µ¥¨ ±·¤¶¶¤¼©²µ·«¨ §¨·¨¦·¬²±²©³¯¤±·√¬µ∏¶¨¶qŠ¨ ± ∂¬µ²¯ ovw }
wzx p w{v1
⁄¬­®¶·µ¤o§¨ ¤ª¨µ≤ qt||{1 °µ¤¦·¬¦¤¯ ³¯¤±·√¬µ²¯²ª¼ }³µ²·²¦²¯¶¤±§ ¬¨¨µ¦¬¶¨¶q …¨ µ¯¬±~ ‹ ¬¨§¨ ¥¯¨µª~ ‘¨º ≠²µ®}≥³µ¬±ª¨µk≥³µ¬±ª¨µ¯ ¤¥ °¤±∏¤¯l q
⁄∏¤µ·¨  o •¬√¤¶∞ …o „¯ ¬¨¤±§µ¨ o  „ oετ αλqusst1 ≥¨ µ²¯²ª¬¦¤¯ ¤±§ °²¯ ¦¨∏¯¤µ¦²°³¤µ¬¶²± ¤°²±ª ≤  ∂ ¶·µ¤¬±¶©µ²° ²µ±¤° ±¨·¤¯ ³¯¤±·¶q ∂¬µ∏¶• √¨ • ¶¨oy }
txx1
‹ µ¨²¯§ƒ qt|yw1 ‘¤·∏µ¤¯ ¬±©¨¦·¬²± ²© Ιµπατιενσσυλτανι º¬·« ≤∏¦∏°¥¨µ°²¶¤¬¦√¬µ∏¶o°¯¤±·⁄¬¶¨¤¶¨ • ³¨²µ·¨µow{ k{l }ysv p ysx1
²¨ ¥¨ ±¶·¨¬± Š o¤º¶²± • ‹ o…µ∏±·„ „ qt||x1 ∂¬µ∏¶¤±§√¬µ∏¶2¯¬®¨ §¬¶¨¤¶¨¶²©¥∏¯¥¤±§©¯²º µ¨¦µ²³¶q²«± • ¬¯¨ ¼ i ≥²±¶o ‘¨º ≠²µ®oxwv1
²µ¬¶× o⁄²§§¶„ qt|z|1 Œ¶²¯¤·¬²± ¤±§¤±¤¯¼¶¬¶²©§²∏¥¯ 2¨¶·µ¤±§¨§ • ‘„ ©µ²° √¬µ∏¶¬±©¨¦·¨§³¯¤±·¤±§©∏±ª¤¯ ·¬¶¶∏¨ q°«¼·²³¤·«²¯²ª¼ oyz }{xw p {x{1
•²²¶¬±¦®  o«¤±ªo‹¨¯ º¯¤¯§Ž‹ qt|||1 • ¤¨µµ¤±ª¨ °¨ ±·¶¬±·«¨ x. ±²±·µ¤±¶¯¤·¨§µ¨ª¬²± ¤±§³«¼¯²ª¨ ±¨ ·¬¦¤±¤¯¼¶¨¶²©¦∏¦∏°¥¨µ°²¶¤¬¦√¬µ∏¶• ‘„ v¬±§¬¦¤·¨
µ¤§¬¤¯ √¨²¯∏·¬²± ²©·«µ¨¨¶∏¥ªµ²∏³¶q²∏µ±¤¯ ²© ∂¬µ²¯²ª¼ ozvk{l }yzxu p yzx{1
• «¬·¨ ° ≥ o ²µ¤¯ ¶¨ƒ o •²²¶¶¬±¦®  qt||x1 Œ±·¨µ¶³¨¦¬©¬¦µ¨¤¶¶²µ·° ±¨·¬±·«¨ √¨²¯∏·¬²± ²©¤¦∏¦∏°²√¬µ∏¶q ∂¬µ²¯²ª¼ousz }vvw p vvz1
k责任编辑 郭广荣l
{y 林 业 科 学 ww卷