全 文 ：第 wt卷 第 w期
u s s x年 z 月
林 业 科 学
≥≤Œ∞‘׌„ ≥Œ∂ „∞ ≥Œ‘Œ≤„∞
∂²¯1wt o‘²1w
∏¯ qou s s x
国内部分地区松材线虫和拟松材线虫基因多态性的
• „°⁄分析 3
张 奇t 李海燕u 白 钢t 胡加付u 杨文博t
kt q南开大学生命科学学院 天津 vssszt ~ u q国家林业局森林病虫害防治总站 沈阳 ttssvwl
摘 要 } 采用 ≥⁄≥法提取线虫基因组 ⁄‘„ o分别选取了 y种随机引物对部分地区的 ts株松材线虫和 ts株拟松材
线虫进行随机扩增和亲缘关系比较 ∀ • „°⁄的结果可以明显区分松材线虫和拟松材线虫 o与形态学分类相吻合 ∀
聚类分析的结果也表明 o线虫种内和种间均存在差异 o但种间差异明显大于种内差异 o同种线虫在同一地区或临近
地区的同源性明显高于其它地区 o同一地区内寄主对线虫种类分布的影响较小 ∀该方法具有所需样品量少 !检测
灵敏度高 !结果准确等优点 o为松材线虫种群的亲缘关系 !传播途径及其检测防疫等方面提供一种灵敏 !可靠的研
究方法 ∀
关键词 } 松材线虫 ~拟松材线虫 ~ • „°⁄~聚类分析
中图分类号 }±xuv ~≥wvu1wn x 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kussxlsw p sttu p sy
收稿日期 }ussv p s| p st ∀
基金项目 }国家/十五0重点科技攻关子项目/林业重大病虫害预警及控制技术研究0中的专题 t ∀
3 白钢为通讯作者 ∀本研究采样工作得到浙江 !安徽 !江苏 !江西森防站及江苏林科院大力支持 o在此表示感谢 ∀
Γενετιχ Ασσαψ οφ Βυρσαπηελενχηυσ ξψλοπηιλυσ ανδ Β q µυχρονατυσ
φροµ Σοµε Πλαγυε Ποτ οφ Χηινα βψ ΡΑΠ∆
«¤±ª±¬t ¬‹¤¬¼¤±u …¤¬Š¤±ªt ‹∏¬¤©∏u ≠¤±ª • ±¨¥²t
kt qΧολλεγε οφ Λιφε Σχιενχε o Νανκαι Υνιϖερσιτψ Τιανϕινvssszt ~ u qΓενεραλΣτατιον οφ Φορεστ Πεστ ανδ ∆ισεασε Χοντρολo
Τηε Στατε Αδµινιστρατιον οφ Φορεστρψ Σηενψανγttssvwl
Αβστραχτ} „©·¨µ ¬¨·µ¤¦·¬±ª Βυρσαπηελενχηυσ ξψλοπηιλυσ ¤±§ Βq µυχρονατυσ ª¨ ±²°¬¦⁄‘„ ¥¼ ≥⁄≥ °¨ ·«²§o·¨± ¶·µ¤¬±¶²© Βq
ξψλοπηιλυ󤱧·¨±¶·µ¤¬±¶²© Βq µυχρονατυσ©µ²°¶²°¨ ³¨¬§¨ °¬¦¤µ¨¤¶º¨ µ¨ ¦²°³¤µ¨§¬±·«¨ µ¨ ¤¯·¬²±¶«¬³¶¥¼¶¨¯¨ ¦·¨§¶¬¬³µ¬°¨ µ¶
·«µ²∏ª« • „°⁄¤¶¶¤¼q׫¨ µ¨¶∏¯·²©• „°⁄¦²∏¯§§¬¶¦¨µ±²¥√¬²∏¶¯¼ Βq ξψλοπηιλυσ©µ²° Βq µυχρονατυ󤱧·«¨ µ¨¶∏¯·¬¶¦²±¶¬¶·¨±·
º¬·« °²µ³«²¯²ª¼ ¤±¤¯¼¶¬¶q ׫¨ ¦¯∏¶·¨µ¤±¤¯¼¶¬¶ ¤¯¶² §¨ °²±¶·µ¤·¨§ ¥¨·º¨ ±¨ ¬±·¨µ¶³¨¦¬©¬¦¤±§¬±·µ¤¶³¨¦¬©¬¦√¤µ¬¤·¬²±¶o º«¬¦«
¬±·¨µ¶³¨¦¬©¬¦√¤µ¬¤·¬²±¶º¨ µ¨ °²µ¨ ·«¤±¬±·µ¤¶³¨¦¬©¬¦√¤µ¬¤·¬²±¶q ‘¨ °¤·²§¨ «²°²¯²ª¼ ¬±·«¨ ¶¤°¨ ¤±§¤§­¤¦¨±·§¬¶·µ¬¦·¬¶«¬ª«¨µ
·«¤±¬± §¬¶·¤±·§¬¶·µ¬¦·qŒ±·«¨ ¶¤°¨ §¬¶·µ¬¦·«²¶·«¤¶√¨ µ¼ ¬¯·¯¨ ©¨©¨¦·²±·«¨ ±¨ °¤·²§¨ §¬¶·µ¬¥∏·¬²±q׫¨ °¨ ·«²§¬¶¶¨±¶¬·¬√¨ ¤±§
¤¦¦∏µ¤·¨o¤±§¦¤± ¥¨ µ¨ª¤µ§¨§¤¶¤µ¨ ¬¯¤¥¯¨·¨¦«±¬´∏¨ ©²µ·«¨ ¶·∏§¼ ²© ±¨ °¤·²§¨ §¬¶·µ¬¥∏·¬²±o¶³µ¨¤§³¤·«º¤¼o §¨·¨¦·¬²± ¤±§
³µ¨√¨ ±·¬²±q
Κεψ ωορδσ} Βυρσαπηελενχηυσ ξψλοπηιλυσ~ Βq µυχρονατυσ~• „°⁄~¦¯∏¶·¨µ¤±¤¯¼¶¬¶
松材线虫k Βυρσαπηελενχηυσ ξψλοπηιλυσl是松树的一种灾难性病害的病原生物 o是引起松树萎蔫病的主要原
因k陈玉惠等 ousstl ∀松材线虫病最初主要分布于美国 !加拿大 !日本 !韩国等国家 o我国于 t|{u年秋在南京
紫金山松林中首次发现该病害 o之后相继在浙江 !广东 !江苏 !安徽等省份也检测到松材线虫病害的存在 o它
已经对我国的松树资源构成了极大的威胁 ∀由于目前对于松材线虫的防治尚无经济有效的措施 o因此严格
检验检疫是阻止该病的发生 !传播和蔓延最重要的途径之一 ∀拟松材线虫k Β q µυχρονατυσl作为伞滑刃属的
线虫同松材线虫经常混生或单独出现在病树木上 o两者形态极其相似 o较难区分k张路平等 ousssl ∀同工酶
谱以及分子生物学的研究结果也表明二者有十分相近的同源性 o给松材线虫的快速检疫以及鉴定带来了诸
多的困难k胡凯基等 ot||xl ∀
自 us世纪 |s年代初国外学者开始将 • „°⁄技术引入到线虫的研究以来 o已在植物寄生线虫的检测中
使用k‹¤«± ετ αλqot||y ~…¨ ±§¨½∏ot||{l o…µ¤¤¶¦«等kt||xl以及郑经武等kt||{l也相继利用人工培养的线虫建
立了松材线虫和拟松材线虫的 • „°⁄p °≤• 技术 o研究结果表明可在两者之间发现具有特异性的 ⁄‘„片断 ∀
本试验对采自国内不同地区的 us株松材线虫和拟松材线虫样品的基因多态性进行了探讨 o确定 • „°⁄方法
扩增的最适随机引物以及松材线虫基因组 ⁄‘„提取的最佳方法 o为我国不同地区野生的松材线虫和拟松材
线虫的快速检疫和种类区系分布的研究提供了样品量小 !快速 !简便的试验方法 ∀
t 材料与方法
111 材料
试剂 }蛋白酶 Žoפ´ 酶以及 ≤ׄ…均购于上海生工 oy个随机引物由上海生工合成 o⁄‘„ ¤µ®¨µ购于北京
鼎国生物公司 o其他试剂均为分析纯 ∀
主要仪器 }°≤• 扩增仪kuwss型 o°∞公司l o凝胶自动成像仪kŒ°¤ª¨ °¤¶·¨µ∂⁄≥ o°«¤µ°¤¦¬¤l o其他仪器均为
国产 ∀
112 线虫样品的取样及分离
本实验从浙江 !广东 !江苏 !安徽 !四川 !湖北等地采集了黑松k Πινυστηυνβεργιιl !马尾松k Πq µασσονιαναl
和华山松k Πq αρµανδιl的样木 o分别采用贝尔曼漏斗法分离线虫 o镜检 o根据形态学分类法鉴定线虫的种类 ∀
并从松材线虫或拟松材线虫的含量较大 o同时纯度在 |x h以上的样木中k杂有极少的线虫也只是腐生类的
线虫l o筛选出了 us个株系作为本实验线虫样品进行研究 o其中松材线虫 ts株k‘²qt ∗ tsl o拟松材线虫 ts
株k‘²qtt ∗ usl o见表 t ∀
表 1 松材线虫和拟松材线虫的来源
Ταβ . 1 Γεογραπηιχ οριγινσ ανδ ηοστσ οφ Β . ξψλοπηιλυσ ανδ Β . µυχρονατυσ
ussu
线虫种类
≥³¨¦¬¨¶
样品号
‘²q
寄主
‹²¶·
来源
յ»±
采集日期
≤²¯¯¨ ¦·¬²± §¤·¨
松材线虫 Β q ξψλοπηιλυσ
t 黑 松 Πq τηυνβεργιι 浙江宁波 ‘¬±ª¥²o«¨­¬¤±ª s{ p us
u 黑 松 Πq τηυνβεργιι 浙江宁波 ‘¬±ª¥²o«¨­¬¤±ª s{ p us
v 马尾松 Πq µασσονιανα 广东惠州 ‹∏¬½«²∏oŠ∏¤±ª§²±ª ts p uw
w 马尾松 Πq µασσονιανα 江苏金坛 ¬±·¤±o¬¤±ª¶∏ ts p uw
x 黑 松 Πq τηυνβεργιι 安徽当涂 ⁄¤±ª·∏o„±«∏¬ ts p vs
y 马尾松 Πq µασσονιανα 安徽含山 ‹¤±¶«¤±o„±«∏¬ ts p vs
z 马尾松 Πq µασσονιανα 安徽含山 ‹¤±¶«¤±o„±«∏¬ ts p vs
{ 黑 松 Πq τηυνβεργιι 安徽含山 ‹¤±¶«¤±o„±«∏¬ ts p vs
| 黑 松 Πq τηυνβεργιι 安徽含山 ‹¤±¶«¤±o„±«∏¬ ts p vs
ts 马尾松 Πq µασσονιανα 安徽滁州 ≤«∏½«²∏o„±«∏¬ tt p st
拟松材线虫 Β q µυχρονατυσ
tt 华山松 Πq αρµανδι 四川邻水 ¬±¶«∏¬o≥¬¦«∏¤± tt p su
tu 马尾松 Πq µασσονιανα 四川邻水 ¬±¶«∏¬o≥¬¦«∏¤± tt p su
tv 马尾松 Πq µασσονιανα 四川邻水 ¬±¶«∏¬o≥¬¦«∏¤± tt p su
tw 马尾松 Πq µασσονιανα 四川邻水 ¬±¶«∏¬o≥¬¦«∏¤± tt p su
tx 马尾松 Πq µασσονιανα 四川邻水 ¬±¶«∏¬o≥¬¦«∏¤± ts p vs
ty 马尾松 Πq µασσονιανα 湖北孝感 ÷¬¤²ª¤±o ‹∏¥¨¬ tt p st
tz 马尾松 Πq µασσονιανα 安徽滁州 ≤«∏½«²∏o„±«∏¬ tt p st
t{ 马尾松 Πq µασσονιανα 安徽滁州 ≤«∏½«²∏o„±«∏¬ tt p st
t| 马尾松 Πq µασσονιανα 安徽祁门 ±¬° ±¨ o „±«∏¬ tt p uz
us 马尾松 Πq µασσονιανα 安徽祁门 ±¬° ±¨ o „±«∏¬ tt p uz
113 线虫 ∆ΝΑ的提取
t1v1t ≥⁄≥法 取线虫悬浮液 x
ˏ于 s1x °离心管中 o置于液
氮中反复冻融 v次 ∀加入 tss ˏ
≥⁄≥ ⁄‘„提取缓冲液kuss °°²¯#
pt ×µ¬¶p ‹≤¯ o uxs °°²¯ # pt
‘¤≤¯ oux °°²¯#pt ∞⁄ׄ os1x h
≥⁄≥ o³‹ {1xl o置于 xx ε 水浴中
保温 t «o待冷却至室温后 o用等
体积的酚Β氯仿Β异戊醇kuxΒuwΒ
tl抽提 o冰浴后 o离心 o取上清液
xs ˏ用等体积预冷的异丙醇沉
淀 ∀沉淀经 zs h乙醇清洗 o干燥
后溶于 us ˏ×∞缓冲液中kts
°°²¯#pt ×µ¬¶p ‹≤¯ ot °°²¯#pt
∞⁄ׄ o³‹{1sl op us ε 保藏备用
k王扬等 ot|||l ∀
t1v1u ≤ׄ…法 取线虫悬浮液
x ˏ于 s1x °离心管中 o经液氮
反复冻融后 o加入 tss ˏ预热到
ys ε 的 ≤ׄ… ⁄‘„ 提取缓冲液
ktss °°²¯ # pt ×µ¬¶p ‹≤¯ o t1w
°²¯#pt ‘¤≤¯ ous °°²¯#pt ∞⁄ׄ ou h ≤ׄ…o³‹ {1sl o置于 xx ε 水浴中保温 t «后 o经酚 !氯仿和异戊醇抽
提 o异丙醇沉淀 o沉淀经 zs h乙醇清洗 o干燥后溶于 us ˏ×∞缓冲液中 op us ε 保藏备用k王扬等 ot|||l ∀
t1v1v 蛋白酶 Ž法 取线虫悬浮液 x ˏ置于玻璃片上 o用手术刀切碎 o再转移到 s1x °离心管中 o加入 {s
ˏ预冷的 • …液ku1x °°²¯#pt ⁄×× ot1tux h ׺¨ ±¨ us os1sux h Š¨ ¤¯·¬±ou1x ≅ °≤• ¥∏©©¨µl o以及预冷的 t °ª#
°pt蛋白酶 Žus ˏo混匀 o迅速将离心管放入液氮中 ts °¬±oyx ε 水浴恒温 t «o随后 |x ε 恒温 ts °¬±o以
vtt 第 w期 张 奇等 }国内部分地区松材线虫和拟松材线虫基因多态性的 • „°⁄分析
灭活蛋白酶 Žo离心后取上清液于 p us ε 保藏备用k张立海等 ousstl ∀
t1v1w 氯化苯法 取线虫悬浮液 x ˏ于 t1x °离心管中 o加入 xss ˏ氯化苯提取缓冲液ktss °°²¯#pt
×µ¬¶p ‹≤¯ ows °°²¯#pt ∞⁄ׄ o³‹ |1sl ots h ≥⁄≥ tss ˏ以及氯化苯 vss ˏ∀xs ε 振荡 vs °¬±后加入 v °²¯
#pt醋酸钠缓冲液k³‹ x1slvss ˏo冰浴 tx °¬±后离心 o取上清液加入等体积预冷的异丙醇沉淀 ∀沉淀经
zs h乙醇清洗并干燥后 o溶于 us ˏ×∞缓冲液中 o p us ε 保藏备用k«∏ ετ αλqot||vl ∀
表 2 Ρ ΑΠ∆分析所用的 6 个随机引物
Ταβ . 2 Σιξ ρανδοµ πριµερσ υσεδ φορ
Ρ ΑΠ∆ αναλψσισ
引物名称
‘¤°¨²©·«¨ ³µ¬° µ¨¶
引物序列
≥¨´ ∏¨±¦¨ ²©·«¨ ³µ¬°¨ µ¶
’°„sv „Š×≤„Š≤≤„≤
’°…sz Š×××≤Š≤×≤≤
’°Šsu ŠŠ≤„≤׊„ŠŠ
’°÷st ≤׊ŠŠ≤„≤Š„
’°÷s{ ≤„ŠŠŠŠ×ŠŠ„
’°≠st Š×ŠŠ≤„×≤×≤
114 随机引物及 ΠΧΡ 扩增及分析
• „°⁄扩增的引物均使用随机引物k…µ¤¤¶¦« ετ αλqot||x ~张
路平等 oussul o见表 u o°≤• 扩增的基本反应条件为 }ux ˏ反应
体积中含双蒸水 tz ˏots ≅ °≤• ¥∏©©¨µu1x ˏoux °°²¯ #pt
ª≤¯ u u ˏots ³°²¯#pt随机引物 t ˏo模板 ⁄‘„ t ˏots °°²¯#
pt §‘×° t ˏox ˜# ˏpt פ´ 酶液 s1x ˏ∀扩增程序为 }|w ε ox
°¬±~|w ε ot °¬±ovy ε ot °¬±ozu ε ou °¬±ovx个循环 ~最后 zu ε
延伸 ts °¬±∀
采用 s1{ h琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳分离 o电泳缓
冲液为 t ≅ ׄ∞o电压为 xs ∂ o电泳 t1x «o置凝胶于 ∂⁄≥分析仪
上分析测定 ⁄‘„片段的长度 o观察并照相 ∀
u 结果与分析
211 最佳 ∆ΝΑ抽提方法
分别采用 ≥⁄≥法 !≤ׄ…法 !蛋白酶 Ž法和氯化苯法从线虫k‘²qttl中提取基因组 ⁄‘„ o琼脂糖凝胶电泳
分离后的 ⁄‘„片断大小均被确认在 uv ®¥左右 o经 ∂⁄≥分析估算各方法提取的 ⁄‘„的浓度分别为 }uy1s o
y1w ouy1w otv1v Λª#°pt ∀实验结果表明 o≥⁄≥法与蛋白酶 Ž法的提取 ⁄‘„量基本相同 o但明显高于 ≤ׄ…法
和氯化苯法 ∀分别以上述 w种方法提取的 ⁄‘„为模板与 y种引物组合进行 • „°⁄扩增 o进一步考察最佳提
取方法和最适引物k图 t o表 vl ∀结果表明 o经 ≥⁄≥法提取的 ⁄‘„均可适用于上述 y种引物 o好于其他方法 ∀
 q ¤µ®¨µ t1 ≥⁄≥法 ≥⁄≥ °¨ ·«²§ u1 ≤ׄ…法 ≤ׄ… ° ·¨«²§ v1 蛋白酶 Ž法 °µ²·¨¬±¤¶¨ Ž° ·¨«²§ w1 氯化苯法 ≤«¯²µ²¥¨ ±½¨ ± ° ·¨«²§ ’°„sv !
’°Šsu !’°≠st !’°…sz !’°÷st !’°÷s{为 y种引物 ’°„sv !’°Šsu !’°≠st !’°…sz !’°÷st !’°÷s{ ¤µ¨ ¶¬¬³µ¬° µ¨¶
图 t 线虫基因组方法 ⁄‘„提取方法以及 • „°⁄扩增引物的考察
ƒ¬ªqt „¶¶¤¼ ²©·«¨ Βυρσαπηελενχηυσ ⁄‘„ ¬¨·µ¤¦·° ·¨«²§¶¤±§ • „°⁄¤°³¯¬©¼µ¤±§²° ³µ¬° µ¨¶
表 3 线虫基因组方法 ∆ΝΑ最适提取方法及 Ρ ΑΠ∆ 扩增引物的分析 ≠
Ταβ . 3 Ασσαψ οφ τηε Βυρσαπηελενχηυσ ∆ΝΑ εξτραχτ µετηοδσ
ανδ Ρ ΑΠ∆ αµ πλιφψ ρανδοµ πριµερσ
提取方法
∞¬·µ¤¦·°¨ ·«²§ ’°„sv ’°Šsu ’°≠st ’°…sz ’°÷st ’°÷s{
t q≥⁄≥ n n n n n n n n n n n n
u q≤ׄ… n n n n nΠp n
v q°µ²·¨¬±¤¶¨ Ž n n n n n n n n p nΠp
w q≤«¯²µ²¥¨ ±½¨ ±¨ p n nΠp nΠp n nΠp
≠ n为阳性 °²¶¬·¬√¨ ~ p为阴性 ‘¨ª¤·¬√¨q
212 ΡΑΠ∆ − ΠΧΡ 扩增的结果与分析
采用 ≥⁄≥法分别对 us株松材线虫和
拟松材线虫 ⁄‘„进行提取 o以提取的基因
组 ⁄‘„为模板 o利用 y个随机引物分别对
线虫 ⁄‘„进行随机扩增 ∀扩增结果显示 o
所选用的 y个引物基本可以区分两种线
虫 o线虫种内与种间均存在差异 o但种间差
异明显大于种内差异k图 u !vl ∀其中以
’°…sz为引物 o随机扩增后 o拟松材线虫于
wtt 林 业 科 学 wt卷
vxs ¥³处出现特异性片段可明显的区别于松材线虫 ∀以 ’°÷st为引物 o随机扩增后 o松材线虫于 {xs ¥³处
出现特异性片段可明显的区别于拟松材线虫 ∀
 q ¤µ®¨µt ∗ ts1 不同来源的松材线虫 Β q ξψλοπηιλυσ ²©§¬©©¨µ¨±·²µ¬ª¬±~tt ∗ us1 不同来源的拟松材线虫 Β q µυχρονατυσ ²©
§¬©©¨µ¨±·²µ¬ª¬±~箭头所指处为拟松材线虫明显区别于松材线虫 vxs ¥³的电泳片段 ׫¨ ¥¤±§²©vxs ¥³¬¶·«¨ ²±¨ º«¬¦«¦²∏¯§
§¬¶¦¨µ± ²¥√¬²∏¶¯¼ Β q µυχρονατυσ©µ²° Β q ξψλοπηιλυσ
图 u us个株系线虫的 ’°…sz引物的 • „°⁄分析图谱
ƒ¬ªqu • „°⁄¥¤±§¶²©us ¶·µ¤¬± ±¨ °¤·²§¨¶º¬·«³µ¬° µ¨’°…sz
 q ¤µ®¨µ~t ∗ ts1 不同来源的松材线虫 Β q ξψλοπηιλυσ ²©§¬©©¨µ¨±·²µ¬ª¬±~tt ∗ us1 不同来源的拟松材线虫 Β q µυχρονατυσ ²©
§¬©©¨µ¨±·²µ¬ª¬±~箭头所指处为松材线虫明显区别于拟松材线虫 {xs ¥³的电泳片段 ׫¨ ¥¤±§²©{xs ¥³¬¶·«¨ ²±¨ º«¬¦«¦²∏¯§
§¬¶¦¨µ± ²¥√¬²∏¶¯¼ Β q ξψλοπηιλυσ©µ²° Β q µυχρονατυσ
图 v us个株系线虫的 ’°÷st引物的 • „°⁄分析图谱
ƒ¬ªqv • „°⁄¥¤±§¶²©us ¶·µ¤¬± ±¨ °¤·²§¨¶º¬·«³µ¬°¨ µ’°÷st
213 聚类分析
选用 ’°≠st为引物 o随机扩增后 o通过 ‘’≥„程序进行聚类分析 ∀聚类分析结果表明 ous株线虫样品明
显地分为松材线虫和拟松材线虫两个不同的类群 o与形态学鉴定结果一致k图 w !xl ∀在本次检测的样品中 o
拟松材线虫可以分为两类 }安徽滁州和祁门k‘²qtz ot{ ot| ousl为一类k ο l o四川邻水为另一类k τ l ∀四川
邻水样本中 ‘²qtu和 ‘²qtv o‘²qtw和 ‘²qtx具有较高的同源性 o‘²qtt和 ‘²qty的同源性较高 ∀松材线虫大
体可以分为 v类 }浙江宁波k‘²qt oul和安徽滁州k‘²qtsl为第一类k π l ~江苏金坛 ‘²qw和安徽当涂 ‘²qx具
有较高的同源性为第二类k υ l ~安徽含山 ‘²qy o|和 ‘²qz o{有较高的同源性为第三类k ωl ∀另外 o广东惠州
‘²qv和 ‘²qw ox具有较高的同源性也同为第二类k图 yl ∀试验结果表明 o不同地区和寄主的松材线虫和拟松
材线虫的种内具有较高的同源性 o而种间同源性较低 ~同一地区内感染线虫的种类呈现较高的同源性 o而寄
主树种间的差别较小 ∀
v 结论与讨论
松材线虫是我国重要的森林检疫性病原生物 o其寄主也十分广泛 o目前寄主范围已经涉及到马尾松 !黑
松 !黄山松k Πqταιωανενσισl及华山松等 ∀我国地跨热带 !亚热带 !温带 o松属树种资源丰富 o自然条件下能够
染病的松属树种有 |种 o其中马尾松是我国南方松树中分布较广的树种 o也是感病枯死较多的树种 o这已在
江苏 !安徽 !浙江 !广东等的山林中得到确认 ∀
张路平等kussul和张立海等kusstl人曾分别采用 • „°⁄和 °≤• p ≥≥≤°方法对不同株系的松材线虫和拟
松材线虫的线粒体 ⁄‘„和µ⁄‘„进行了分析 o并证明上述方法均可以用于区分松材线虫和拟松材线虫 ∀汪
来发等kusstl也曾利用 tx种随机引物通过 • „°⁄方法对松材线虫和拟松材线虫的亲缘关系进行研究 o结果
xtt 第 w期 张 奇等 }国内部分地区松材线虫和拟松材线虫基因多态性的 • „°⁄分析
 q ¤µ®¨µ~t ∗ ts1 不同来源的松材线虫 Β q ξψλοπηιλυσ ²© §¬©©¨µ¨±·²µ¬ª¬±~tt ∗ us1 不同来源的拟松材线虫 Β q µυχρονατυσ ²©
§¬©©¨µ¨±·²µ¬ª¬±
图 w us个株系线虫的 ’°≠st引物的 • „°⁄分析图谱
ƒ¬ªqw • „°⁄¥¤±§¶²©us ¶³¨¦¬¨¶º¬·«³µ¬° µ¨’°≠st
图 x 松材线虫和拟松材线虫聚类分析图
ƒ¬ªqx ׫¨ ¦¯∏¶·¨µ¤±¤¯¼¶¬¶¦«¤µ·²© Β q ξψλοπηιλυ󤱧 Β q µυχρονατυσ
表明没有一种通用的引物可以一次性区分松材线
虫和拟松材线虫 ∀虽然汪来发等利用种内和种间
存在的差异比较了国内和国外疫区线虫之间的亲
缘性 ,认为松材线虫可能最初从北美通过人为活
动传到日本 ,而后又从北美和日本再传入中国 ,但
没有对国内疫区样品之间的亲缘关系进行分析 ∀
本研究考察了 4 种提取线虫基因组 ∆ΝΑ的方法 ,
并选取了 6种随机引物对松材线虫和拟松材线虫
进行了 ΡΑΠ∆分析 ∀试验结果表明 ,采用 Σ∆Σ法提
取线虫基因组 ⁄‘„ 最为适合 o片断大小约为 uv
®¥o略大于汪来发等人提取的 ut ®¥⁄‘„片断 ∀利
用 ’°…sz为引物随机扩增后 o拟松材线虫于 vxs ¥³
处出现特异性片段可明显的区别于松材线虫 ∀以
’°÷st为引物随机扩增后 o松材线虫于 {xs ¥³处
出现特异性片段可明显的区别于拟松材线虫 ∀以
ω υ π松材线虫采样地点 Β q ξψλοπηιλυσσαµπλινγ ¶¬·¨¶
ο τ 拟松材线虫采样地点 Β q µυχρονατυσσαµπλινγ ¶¬·¨¶
图 y 松材线虫和拟松材线虫种类与采样地点分布图
ƒ¬ªqy ׫¨ §¬¶·µ¬¥∏·¬²± °¤³²© Β qξψλοπηιλυ󤱧 Β qµυχρονατυσ
’°≠st为引物随机扩增后 o进行聚类分析
结果最佳 o基本可以区分松材线虫和拟松
材线虫 o与形态学分类相吻合 ∀
采用上述方法对我国华东 !华中部分
地区的 us个株系松材线虫和拟松材线虫
之间的亲缘关系进行比较 o得出了以下结
果 }两种线虫种内和种间均存在差异 o但种
间差异明显大于种内差异 ~线虫在同一地
区或临近地区的同源性明显高于其它地
区 ~同一地区内寄主对线虫种类分布的影
响较小 ~由于一些人为因素线虫可能被转
移感染到较远的地区 ∀
本研究采用 • „°⁄聚类分析的方法探
讨了我国部分地区松材线虫和拟松材线虫
的种类和分布 o该方法具有所需样品量少 !
检测灵敏度高 !结果准确等优点 o将为松材
线虫的种群亲缘关系 !传播途径及其检测
防疫等方面的研究提供一套灵敏 !可靠的
ytt 林 业 科 学 wt卷
方法 ∀但由于目前我们采集的样品数量以及采集地区存在一定的局限性 o同时 °≤• 扩增以及 • „°⁄分析也
具有一定的不稳定因素 o因此该方法和结果还有待进一步完善 ∀
参 考 文 献
陈玉惠 o叶建仁 o魏初奖 qusst q松材线虫病诊断方法研究进展 q南京林业大学学报 ouxkyl }{v p {z
胡凯基 o杨宝君 qt||x q松材线虫和拟松材线虫不同株系酶电泳的研究 q林业科学研究 o{ktl }zv p zz
王 扬 o汪来发 o喻盛甫 o等 qt||| q松材线虫 • „°⁄规范化反应体系的构建 q云南农业大学学报 otw }tu p ty
汪来发 o王 扬 o杨宝君 o等 qusst q利用 • „°⁄研究松材线虫和拟松材线虫亲缘关系 q植物病理学报 ovtkvl }uux p uu|
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张路平 o李纪标 o孔繁瑶 qusss q松材线虫和拟松材线虫扫描电镜结构的比较研究 q电子显微学报 ot|kxl }yz| p y{w
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