全 文 ：第 ww卷 第 w期
u s s {年 w 月
林 业 科 学
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„³µqou s s {
香樟胚性愈伤组织遗传转化体系建立 3
杜 丽t 庞振凌t 周 索t 曾晓慧t 包满珠u
kt1 南阳师范学院生命科学与技术学院 南阳 wzvsss ~ u1 华中农业大学园艺林学学院 教育部园艺植物生物学重点实验室 武汉 wvsszsl
摘 要 } 通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法 o建立香樟胚性愈伤组织遗传转化体系 ∀结果表明 }以胚性愈伤组
织为受体 o能取得比较理想的转化效果 ~xs °ª#pt的潮霉素对胚性愈伤组织有很好的筛选效果 ~根癌农杆菌 s⁄yss
为 s1y时 o能获得较高的转化率 ~侵染时间提高为 ws °¬±时 o对提高转化效率有显著的效果 ~共培养 v §能够得到
较好的转化效率 ∀对转基因香樟愈伤组织进行 °≤• 检测 o结果表明 Š˜≥基因已整合到香樟胚性愈伤组织的基因组
中 ∀
关键词 } 香樟 ~根癌农杆菌 ~遗传转化 ~°≤•
中图分类号 }≥zt{1wy ~ ±|wv1u 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kuss{lsw p ssxw p sy
收稿日期 }ussz p s| p t| ∀
基金项目 }河南省自然科学基金ksyttsvvvssl ~南阳师范学院高层次人才科研启动费资助 ∀
3 包满珠为通讯作者 ∀
Εσταβλισηµεντ οφ Αγροβαχτεριυµ2Μεδιατεδ Τρανσφορµατιον Σψστεµ
οφ Εµ βρψογενιχ Χαλλι οφ Χινναµοµυµ χαµπηορα
⁄∏¬t °¤±ª«¨ ±¯¬±ªt «²∏≥∏²t  ±¨ª ÷¬¤²«∏¬t …¤² ¤±½«∏u
kt1 Σηοολοφ Λιφε Σχιενχε ανδ Τεχηνολογψo Νανψανγ Νορµαλ Υνιϖερσιτψ Νανψανγ wzvsss ~ u1 ΚεψΛαβορατορψοφ Ηορτιχυλτυραλ
Πλαντ Βιολογψοφ Μινιστρψοφ Εδυχατιον Χολλεγε οφ Ηορτιχυλτυρε ανδ Φορεστρψ Σχιενχεσo Ηυαζηονγ Αγριχυλτυραλ Υνιϖερσιτψ Ωυηαν wvsszsl
Αβστραχτ} „ ª¨ ±¨·¬¦·µ¤±¶©²µ°¤·¬²± ¶¼¶·¨° ²© °¨¥µ¼²ª¨±¬¦¦¤¯ ¬¯k Χινναµοµυµ χαµπηοραl °¨ §¬¤·¨§ ¥¼ Αγροβαχτεριυµ
τυµεφαχιενσ º¤¶ ¶¨·¤¥¯¬¶«¨§q ∞¬³¨µ¬°¨ ±·¤¯ µ¨¶∏¯·¬±§¬¦¤·¨§·«¤·¨ ©©¬¦¬¨±··µ¤±¶©²µ°¤·¬²± º¤¶²¥·¤¬±¨ § º¬·« °¨¥µ¼²ª¨±¬¦¦¤¯ ¬¯¤¶
¤¦¦¨³·²µq‹¼ªµ²°¼¦¬± ²©xs °ª#pt º¤¶ ©¨©¬¦¬¨±·¬±¶¦µ¨ ±¨¬±ª °¨¥µ¼²ª¨ ±¬¦¦¤¯ ¬¯q • «¨ ±·«¨ ’⁄yss √¤¯∏¨ ²© Αγροβαχτεριυµ º¤¶
s1y o¤«¬ª«·µ¤±¶©²µ°¤·¬²±µ¤·¨ º¤¶ª¤¬±¨ §q׫¨ ¬±©¨¦·¬²±·¬°¨ ²©ws °¬±o¦²°¥¬±¨ §º¬·«¦²2¦∏¯·∏µ¨ ·¬°¨ ²©v §oµ¨°¤µ®¤¥¯¼
±¨«¤±¦¨§·µ¤±¶©²µ°¤·¬²±µ¤·¨q• ¶¨∏¯·¶²©°≤• ³µ²√¨ §·«¤··«¨ Š˜≥ ª¨ ±¨ «¤§¬±·¨ªµ¤·¨§¬±·² °¨¥µ¼²ª¨ ±¬¦¦¤¯ ¬¯²© Χq χαµπηορα
ª¨ ±²°¨ q
Κεψ ωορδσ} Χινναµοµυµ χαµπηορα~ Αγροβαχτεριυµ τυµεφαχιενσ~ª¨ ±¨·¬¦·µ¤±¶©²µ°¤·¬²±~°≤•
香樟k Χινναµοµυµ χαµπηοραl o樟科k¤∏µ¤¦¨¤¨ l o常绿乔木 o是贵重家具 !高级建筑 !造船和雕刻等理想的
用材 o近年来 o香樟在园林绿化中的应用越来越多 o成为城市中重要的园林绿化树种 ∀作者利用未成熟的香
樟合子胚诱导获得胚性愈伤组织 o历经 v年继代保存 o胚性愈伤组织仍具有发育成体胚 !体胚再形成植株的
能力 ∀香樟的植株再生通常是经过体细胞胚胎发生途径来完成的k杜丽等 oussy ~⁄∏ ετ αλqousszl o但国内外
迄今为止尚无关于香樟的胚性愈伤组织遗传转化体系的报道 ∀本文利用现有保存的香樟胚性愈伤组织细胞
系 o对影响香樟遗传转化的几个因素进行了研究 o建立了高效的农杆菌遗传转化体系 o为香樟的基因工程育
种奠定了基础 ∀
t 材料与方法
111 植物材料
香樟可通过体细胞胚发生途径获得再生植株 o本文利用这个再生系统进行遗传转化的研究 ∀以香樟继
代保持 v年的胚性愈伤组织k胚性系 |lk杜丽等 oussy ~⁄∏ ετ αλqousszl为试验材料和转化受体 ∀
112 胚性愈伤组织对潮霉素的敏感性试验
将胚性愈伤组织接种于附加不同浓度潮霉素的保持增殖培养基上k≥ n t1s °ª#pt …„ n s1t °ª#pt
u ow2⁄ n zss °ª#pt ≤‹ o蔗糖 vs ª#pt o琼脂粉为 z1x ª#ptlk≤‹ }水解酪蛋白l ot个月后比较不同浓度抗生
素对外植体增殖的抑制作用 o以确定合适的选择压力 ∀试验的潮霉素浓度梯度为 ts !vs !xs !zs !tss °ª#pt ∀
试验外植体数不少于 vs团k直径约 x °°l ∀
113 根癌农杆菌菌株及质粒
试验中所用根癌农杆菌菌株为 ∞‹„tsx o它含有 ³≤„…Œ„tvst质粒 o该质粒携带 Š˜≥报告基因和 ‹°×选
择基因 o其中 Š˜≥基因含有一个内含子 o以确保 Š˜≥基因只在植物细胞中表达 o而不在农杆菌中表达 ∀含有
该质粒的农杆菌对潮霉素有抗性 ∀质粒中 ×2⁄‘„区域的结构简图如图 t所示 ∀
图 t 质粒 ³≤„…Œ„tvst的 ×2⁄‘„区结构简图
ƒ¬ªqt ≤²±¶·µ∏¦·¬²± ²©×2⁄‘„ µ¨ª¬²± ²©³¯¤¶°¬§³≤„…Œ„tvst
114 农杆菌介导的转化
收集培养好的农杆菌菌体用共培养介质k„… n tss Λ°²¯#pt „≥ o表 tlk„≥ }乙酰丁香酮l重新悬浮至
’⁄yss s1u ∗ t1u左右 o将愈伤组织置于悬浮液中侵染 ts ∗ ys °¬±o用灭菌滤纸吸干表面液体 o一段时间后取出
并用无菌滤纸吸去表面多余的菌液 o并在超净工作台上将浸泡后的材料吹至半干kus ∗ vs °¬±l o后接入胚性
愈伤组织共培养培养基k≥ n t1s °ª#pt ‘„„ n t sss °ª#pt ∞ n tss Λ°²¯#pt „≥lk∞}麦芽提取物l
中 o将上述接种物置于黑暗条件下培养 t ∗ y §∀
对于胚性愈伤组织的转化条件优化 o本研究试验了根癌农杆菌 ∞‹„tsxΠ³≤„…Œ„tvst 的菌液浓度
k’⁄yss € s1u !s1w !s1y !s1{ !t1s !t1ul o共培养天数kt !u !v !w !x !y §l o侵染时间kts !us !vs !ws !xs !ys °¬±l o对遗
传转化的影响 ∀检测其中的某个因素时 o其他因素的水平采用 ’⁄yss为 s1y o共培养天数为 v §o侵染时间为 ws
°¬±o共培养结束后用外植体 Š˜≥的瞬间表达量的多少确定转化条件的适宜程度 ∀
表 1 ΑΒ液体培养基的组成
Ταβ .1 Χοµ ποσιτιον οφ
λιθυιδ ΑΒ µεδιυµ
组成
≤²°³²¶¬·¬²±
浓度
≤²±¦¨±·µ¤·¬²±
Žu ‹°’w v ª#pt
‘¤‹u°’w t ª#pt
‘‹w ≤¯ t ª#pt
ª≥’w#z‹u ’ s1v ª#pt
Ž≤¯ s1tx ª#pt
≤¤≤¯ u s1st ª#pt
ƒ ≥¨’w#z‹u ’ u1x °ª#pt
葡萄糖 Š¯ ∏¦²¶¨ s1x h
115 脱菌和选择培养
试验中测试了不同浓度的潮霉素kxs °ª#pt和 zs °ª#ptl和 vss °ª#pt头
孢霉素组成的选择培养基k≥ n t1s °ª#pt ‘„„ n t sss °ª#pt ∞l对诱导
Š˜≥基因转化的抗性愈伤组织的影响 o该试验设计 u次重复 o每次重复采用至少
xs个外植体kx个培养皿 ots团外植体Π皿l oux ε 黑暗条件下选择培养 oy周后进
行抗性愈伤组织诱导率k产生新鲜愈伤组织的外植体数Π每个重复的外植体总数
≅ tss h l统计 ∀此后 o诱导出的新鲜抗性愈伤组织在含有 xs °ª#pt潮霉素和
vss °ª#pt头孢霉素的选择培养基上每 v周继代 t次进行抗性愈伤组织的增殖
培养 oux ε 暗培养 ∀
116 抗性愈伤组织的 ΓΥΣ基因瞬间表达及 ΠΧΡ 检测
转化共培养后对转化受体进行 Š˜≥染色 o检测转化瞬时表达率 o可初步判
断农杆菌对受体组织的侵染效率 ∀检测 Š˜≥基因在转基因愈伤组织中的表达 o取未转化的同步材料为阴性
对照 ∀胚性愈伤组织反应后可直接观察 oŠ˜≥基因瞬间表达呈阳性者可在肉眼下观察到蓝色反应 o然后统计
Š˜≥基因瞬间表达率k有蓝色反应的外植体数Π外植体总数l ∀试验重复 v次 o每次外植体总数不少于 vs粒 ∀
香樟胚性愈伤组织 ⁄‘„的提取采用 ≤ׄ…少量提取法 ∀根据 ‹°×基因序列 o设计一对特异引物为 }xχ p
≤Š× o≤׊ o×≤Š o„Š„ o„Š× o××≤ p vχ和 xχ p ׄ≤ o××≤ oׄ≤ o„≤„ oŠ≤≤ o„×≤ p vχ o琼脂糖凝胶电泳检测扩
增片段范围如图 x所示 ∀
u 结果与分析
211 胚性愈伤组织对潮霉素的敏感性分析
研究了 ts ∗ tss °ª#pt不同潮霉素浓度对胚性愈伤组织增殖的影响 ∀将继代培养的胚性愈伤组织接种
到含潮霉素的保持培养基上 o观察和记录在不同选择压力下培养 w周后的生长结果 ∀随着培养基中潮霉素
浓度的增加 o具有新生长的愈伤组织的比例显著降低 ots ∗ vs °ª#pt压力下 ow周后虽然有部分愈伤组织逐
渐死亡 o但仍有部分愈伤组织存活下来并能继续生存下去 ∀当潮霉素浓度达到 zs °ª#pt或更高时 o从接种
xx 第 w期 杜 丽等 }香樟胚性愈伤组织遗传转化体系建立
ts §后立即抑制了胚性愈伤组织生长 o生长缓慢 ∀这个结果表明潮霉素在选择压力低时 o即使长时间选择亦
有部分愈伤组织存活 o当压力提高达到一定值时 o经短时间的选择即可达到抑制生长的效果 ∀可见潮霉素对
于香樟胚性愈伤组织的生长抑制是速效的 ∀在观察中发现 o当潮霉素浓度为 xs °ª#pt时 o虽然能够观察到
新的愈伤组织以很低的频率发生k  tx h l o但大多数愈伤组织颜色发暗 o呈现黄褐色 o表面干涩 o缺乏活力 ~
潮霉素浓度为 zs °ª#pt时 o愈伤组织呈褐色 o有极少量新的愈伤组织发生 o愈伤组织体积增大不明显 ~当潮
霉素浓度为 tss °ª#pt o愈伤组织呈黑褐色 o体积无增大 o生长完全受到抑制 ∀因此认为 xs °ª#pt潮霉素已
表现出对香樟胚性愈伤组织生长的明显抑制 o故将潮霉素浓度 xs °ª#pt作为选择压力 ∀
212 侵染时间对胚性愈伤组织遗传转化的影响
农杆菌侵染植物外植体首先进行农杆菌细胞与植物细胞间的相互作用 o足够的侵染时间有利于农杆菌
通过趋化作用或其他作用充分吸附到植物外植体伤口或愈伤组织表面 o一般农杆菌的侵染时间为 x °¬±到
t «之间 ∀本文研究了 ts ∗ ys °¬±这 y个水平kts !us !vs !ws !xs !ys °¬±l o其中每个处理的共培养时间均为
v §o侵染用农杆菌的 ’⁄yss值都调整为 s1y oŠ˜≥数据是 v次独立重复试验的平均结果 ∀结果显示 }当侵染时
间为 ts °¬±时 o胚性愈伤组织的 Š˜≥基因瞬间表达率为 sk图 u„l o而侵染时间延长至 us °¬±时 oŠ˜≥基因瞬
间表达率突增至 ws h以上 ~最高的表达率出现在侵染时间为 ws °¬±的处理中 oŠ˜≥基因瞬间表达率可达
zy1yz h ~侵染时间超过 ws °¬±表达率开始下降 o可能是过长的侵染时间使农杆菌对外植体的生长造成了伤
害 o所以 ws °¬±的侵染时间适于香樟胚性愈伤组织的遗传转化 ∀
213 菌液浓度对胚性愈伤组织遗传转化的影响
菌液浓度在农杆菌介导的遗传转化中是影响转化效率的重要因素之一 o因此试验在 ws °¬±的侵染时
间 !共培养 v §的同样条件下 o测试了在 s1u ∗ t1u的 y个水平 ’⁄yss值k’⁄yss € s1u !s1w !s1y !s1{ !t1s !t1ul对
转化效率的影响k图 u…l ∀结果显示 o不同浓度的菌液对香樟胚性愈伤组织的转化效率不同 ∀ ’⁄yss值为 s1u
时 o结束共培养后的 Š˜≥瞬间表达率只有 us h左右 o随着菌液浓度的增加 o表达率逐渐增加 o当浓度达到 s1y
时 o表达率最高 o随后开始降低 ∀同时发现 o在浓度高的菌液处理中 o结束共培养时 o细菌过度生长 o几乎包裹
了整个外植体 o转入选择培养后 o有的细菌竟然继续生长 o不容易被清除干净 o影响外植体的生长 o因此认为
’⁄yss值大于 s1{的菌液浓度处理的外植体 Š˜≥基因表达率下降 o可能是过度生长细菌的毒害作用造成的 ∀
所以在对香樟胚性愈伤组织侵染中 o农杆菌最适宜的浓度为 ’⁄yss值 s1y ∀
图 u 侵染时间 !农杆菌侵染浓度对香樟胚性愈伤组织遗传转化的影响
ƒ¬ªqu ∞©©¨¦·²©¬±©¨¦·¬²±·¬°¨ ¤±§ ’⁄ √¤¯∏¨ ²± ª¨ ±¨ ·µ¤±¶©²µ°¤·¬²±¬± °¨¥µ¼²ª¨ ±¬¦¦¤¯ ¬¯²© Χq χαµπηορα
214 共培养时间对胚性愈伤组织遗传转化的影响
理论上说 o农杆菌与植物共培养时间越长 o农杆菌侵入的机会越多 !基因转化的频率越高 ∀然而 o实际操
作中如果共培养的时间越长 o植物的外植体会因过度感染而中毒死亡 o达不到转化效果 ∀因此确定合适的
共培养时间是提高转化率的重要因素之一 ∀本试验使用农杆菌 ’⁄yss值为 s1u和 s1y !侵染时间为 ws °¬±的
转化条件 o在共培养 t ∗ y §后kt !u !v !w !x !y §l o检查 Š˜≥基因在外植体中的瞬间表达情况 o结果如图 v ∀从
图 v可见 o共培养 t §后 o使用较高浓度的菌液k’⁄yss € s1ylŠ˜≥基因在外植体内即有表达 o随着培养时间的
延长 oŠ˜≥基因的表达率增高 o在共培养 v §时表达率达到最高kzy1yz h l o然而随着时间的延长 oŠ˜≥基因的
表达开始下降 o原因是植物的外植体过度感染死亡 ∀ ’⁄yss值为 s1u的所有处理中 oŠ˜≥表达率均明显低于高
浓度k’⁄yss € s1yl的菌液侵染效果 ∀可见 o低浓度菌液 !长时间共培养不能达到和高浓度菌液侵染的同样效
yx 林 业 科 学 ww卷
图 v 共培养时间对胚性愈伤组织遗传转化的影响
ƒ¬ªqv ∞©©¨¦·²©¦²2¦∏¯·¬√¤·¬²±·¬°¨ ²± ª¨ ±¨
·µ¤±¶©²µ°¤·¬²±¬± °¨¥µ¼²ª¨ ±¬¦¦¤¯ ¬¯²© Χq χαµπηορα
果 ∀所以 ,适宜的菌液浓度为 ’⁄yss € s1y o共培养时间为
v §∀
215 抗性愈伤组织的获得及继代增殖
本试验根据 Š˜≥基因瞬间表达结果k图 w¤∗ ¦l o确立了
农杆菌介导香樟胚性愈伤组织遗传转化的合适条件 o即菌
液浓度为 ’⁄yss € s1y o侵染时间为 ws °¬±o共培养时间为
v §∀按照这一条件进行侵染 o共培养 v §后直接转入各自
的选择培养基上进行选择培养 oy周后获得抗性愈伤组织 ∀
诱导获得的抗性愈伤组织继续转接到选择培养基上 o
每隔 v周继代 t次 o进行抗性愈伤组织的增殖和假阳性转
化的剔除 ∀从转入 Š˜≥基因的抗性愈伤组织k图 w§l上可
以看出 o抗性愈伤组织生长较快 o呈新鲜的淡黄色 o而其他
愈伤组织色彩黯淡 o呈褐色 o无生活力 ∀选择培养基中 vss °ª#pt头孢霉素能有效抑制农杆菌的生长 o并对
愈伤组织的增殖无影响 ∀到目前为止 o这些抗性愈伤组织正在进行再生植株的诱导试验 ∀
图 w 香樟胚性愈伤组织 Š˜≥基因表达染色反应
ƒ¬ªqw ‹¬¶·²¯²ª¬¦¤¯ ¤¶¶¤¼ ²© Š˜≥ ª¨ ±¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²±
¬± °¨¥µ¼²ª¨ ±¬¦¦¤¯ ¬¯²© Χq χαµπηορα
¤q共培养 v §后胚性愈伤组织的 Š˜≥基因瞬间表达 ~¥q Š˜≥
阳性反应愈伤组织k左l和对照愈伤组织k右l ~¦qŠ˜≥基因的
不同表达量 k左为对照l ~ §q抗性愈伤组织 ∀ ¤q Š˜≥ ª¨ ±¨
·µ¤±¶¬¨±·¨ ¬³µ¨¶¶¬²± ¤©·¨µv2§¤¼ ¦²2¦∏¯·∏µ¨ Š˜≥ ¶³²·¶~¥q Š˜≥ ¶³²·¶
k¯ ©¨·l ¤±§¦²±·µ²¯ ¦¤¯ ¬¯kµ¬ª«·l ~¦q⁄¬©©¨µ¨±·¨ ¬³µ¨¶¶¬²± ²© Š˜≥ ª¨ ±¨
k¦²±·µ²¯ ²± ·«¨ ¯¨©·l ~ §q ‹¼ªµ²°¼¦¬± µ¨¶¬¶·¤±·¦¤¯ ¬¯¤©·¨µy2º¨¨ ®
¶¨¯¨ ¦·¬²± ¦∏¯·∏µ¨ q
216 胚性愈伤组织 ΓΥΣ基因瞬间表达及稳定表达检测
共培养结束后 o将无菌水清洗过的胚性愈伤组织放
入 Š˜≥反应缓冲液 ovz ε 水浴保温过夜 ∀反应结果可以
直接用肉眼观察 ∀从图 w¤∗ ¦可以看出 o香樟胚性愈伤
组织的 Š˜≥基因表达比较强 o被检测的抗性愈伤组织上
呈现出不同程度的蓝色 o说明 Š˜≥在不同的愈伤组织中
的表达强弱不同 ~有的愈伤组织只是局部出现蓝斑 o可
能是外植体局部被转化的结果 ∀虽然一些研究表明 o
Š˜≥基因瞬间表达主要是由未整合的 ×2⁄‘„引起的 o与
稳定的转化事件并无严格的相关关系 o但是差异较大的
Š˜≥瞬间反应对于遗传转化条件的确定还是具有一定的
指导意义 ∀在本试验中 o使用 Š˜≥基因瞬间表达的结果
进行转化条件优化 o以优化的条件进行转化 o最终得到了
抗性愈伤组织k图 w§l o目前 o导入 Š˜≥基因的抗性胚性
愈伤组织正在进行体胚诱导 o然后进行再生植株的诱导 ∀
217 含有 ΓΥΣ基因的抗性愈伤组织的 ΠΧΡ 检测
进行选择培养 y周后 o经含有 Š˜≥基因的农杆菌菌
液侵染过的胚性愈伤组织上 o可以观察到有黄色新鲜的
胚性愈伤组织出现 ∀含有潮霉素 xs °ª#pt的选择培养
基上的抗性愈伤组织诱导率为 tz1x h ~抗生素提高至 zs
°ª#pt抗性愈伤组织诱导率降至 tu h o而且这些新诱导
的愈伤组织个体都比较细小 o直径不足 u °°k表 ul ∀抗
性愈伤组织在选择培养基上生长较正常的胚性愈伤组织
在不添加抗生素的培养基上缓慢 o可见高浓度的潮霉素
对于抗性愈伤组织的生长仍然具有抑制作用 ∀
将多次选择继代kw个月l的抗性愈伤组织按照外植体来源编号 o提取 ⁄‘„ o进行 °≤• 检测 o检测结果如
图 x所示 ow团测试的潮霉素的抗性愈伤组织中编号为 t !u !v !w的愈伤组织使用 ‹°×基因设计的引物均扩
增出约 xss ¥³的片段 o与质粒 ⁄‘„扩增的片段大小相同 o而以未转化愈伤组织 ⁄‘„为阴性对照的扩增产物
中无目标片段 o说明外源基因已稳定整合到这些被检测抗性愈伤组织细胞的核基因组中 ∀ °≤• 检测选用的
⁄‘„取自在选择培养基k潮霉素 }xs °ª#ptl上多次kw个月l继代的抗性愈伤组织 ow团抗性愈伤组织在 °≤•
检测中均呈现阳性反应 o阳性比率为 tss h o可见长期使用高浓度潮霉素处理抗性愈伤组织能够有效剔除假
zx 第 w期 杜 丽等 }香樟胚性愈伤组织遗传转化体系建立
表 2 ΓΥΣ基因转化香樟胚性愈伤组织的潮霉素抗性愈伤组织诱导情况 ≠
Ταβ .2 Ηψγροµψχιν2ρεσισταντ χαλλι ινδυχτιον φροµ εµ βρψογενιχ χαλλι οφ Χ . χαµπηορα αφτερ ΓΥΣ γενε τρανσφορµατιον
潮霉素浓度
≤²±¦¨±·µ¤·¬²± ²©«¼ªµ²°¼¦¬±Πk°ª#ptl
外植体数
‘∏°¥¨µ²© ¬¨³¯¤±·¶
抗性愈伤组织诱导率
ƒµ¨ ∏´¨ ±¦¼ ²©µ¨¶¬¶·¤±·¦¤¯ ¬¯¬±§∏¦·¬²±Πh
平均生长量k直径l
 ¤¨± ªµ²º·«k§¬¤°¨ ·¨µlΠ°°
xs xs tz1x  u
zs xs tu  t
≠结果统计于选择培养 y周后 ~试验重复 u次k每次外植体数不少于 xs个l ∀ ⁄¤·¤º µ¨¨ ¦²¯¯¨ ¦·¨§¤©·¨µy º¨¨ ®¶¬± ¶¨¯¨ ¦·¬²±¦∏¯·∏µ¨ ~  ¤¨±¶¤µ¨
¦¤¯¦∏¯¤·¨§¬±·º²µ¨³¯¬¦¤·¬²±¶¬±¦¯∏§¬±ªx πετρι §¬¶«¨¶º¬·«ts ¬¨³¯¤±·¶ ¤¨¦«q
阳性的愈伤组织 o这可能与香樟的胚性愈伤组织的生长对潮霉素的作用比较敏感有一定的关系 ∀
图 x Š˜≥基因遗传转化的潮
霉素抗性愈伤组织的 °≤• 检测
ƒ¬ªqx °≤• ¤°³¯¬©¬¦¤·¬²± µ¨¶∏¯·¶²©
«¼ªµ²°¼¦¬± µ¨¶¬¶·¤±·¨ °¥µ¼²ª¨ ±¬¦¦¤¯ ¬¯
¤©·¨µŠ˜≥ ª¨ ±¨ ·µ¤±¶©²µ°¤·¬²±
 q ¤µ®¨µk⁄ussl ~‘q未转化愈伤
组织 ⁄‘„ 阴性对照 ‘²±2·µ¤±¶ª¨±¬¦
°¨¥µ²ª¨±¬¦¦¤¯ ¬¯ ±¨ ª¤·¬√¨ ¦²±·µ²¯ ~ ° q
质粒 ⁄‘„ 阳性对照 °¯ ¤¶°¬§ ⁄‘„
³²¶¬·¬√¨ ¦²±·µ²¯ ~t ∗ w1 抗性愈伤组织
⁄‘„ «¼ªµ²°¼¦¬±2µ¨¶¬¶·¤±· °¨¥µ¼²ª¨±¬¦
¦¤¯ ¬¯q
v 结论与讨论
311 影响香樟胚性愈伤组织遗传转化的因素
根据试验研究 o香樟胚性愈伤组织是比较适宜的遗传转化材料 ∀在试验
中 o使用子叶期的体胚来侵染 o其效果差于胚性愈伤组织k数据未显示l ∀通常
当体胚经过侵染后 o在选择培养时 o外植体材料非常容易褐化死亡 o这可能是
因为基因成功转化部分占整个体胚体积比例太小 o产生的对抗生素的抵抗力
不足以保证整个外植体的存活 o所以香樟体胚的转化效率较差 ∀在许多物种
农杆菌介导的遗传转化中 o胚性愈伤组织是较多使用的转化材料 o如 柑
k Χιτρυσρετιχυλαταlk¬ετ αλqoussul !棉花k Γοσσψπιυµ ηιρσυτυµlk谢德意等 ousszl !
杂交月季k Ροσα ηψβριδlkŠ¤² ετ αλqo ussw ~ Ž¬° ετ αλqo usswl !匍匐剪股颖
k Αγροστιστενυισlk≤«¤¬ετ αλqousswl等都是使用胚性愈伤组织进行遗传转化的 o
香樟在进行农杆菌介导的遗传转化中 o胚性愈伤组织同样是比较适宜的转化
试材 ∀
本文研究了在农杆菌菌液侵染胚性愈伤组织时 o菌液浓度 !侵染时间和共
培养时间对 ×2⁄‘„转化的影响 ∀许多研究表明菌液浓度在农杆菌介导的遗
传转化中是影响转化效率的重要因素之一k⁄²«° ετ αλqousst ~ Š¤² ετ αλqo
ussw ~苏晓华等 oussvl o单位体积中的细菌含量增加 o使得农杆菌和胚性愈伤
组织相遇的机会增加 o×2⁄‘„转入外植体的机会也大大增加 ~但并不是菌液浓度越高 o转化效果越好 o因为
外植体对于农杆菌的忍耐也是有限度的 o过高的细菌浓度如果毒害外植体 o显然会降低 ×2⁄‘„的转化效率 ∀
就香樟胚性愈伤组织的转化而言 o’⁄yss为 s1y的菌液浓度是最佳的转化菌液浓度 o这与王爱菊等kussyl的研
究结果也是一致的 ∀足够的侵染时间有利于农杆菌通过趋化作用或其他作用充分吸附到植物外植体伤口或
愈伤组织表面 ots ∗ ys °¬±是农杆菌转化中经常被使用的时间范围 o不过侵染时间过长同样会造成转化效率
降低 o所以香樟胚性愈伤组织的最佳侵染时间是 ws °¬±∀农杆菌与植物共培养时间越长 o农杆菌侵入的机会
越多 !基因转化的频率越高 o通常可能会认为较低浓度的菌液侵染后 o适当延长共培养时间就能够获得较好
的转化效率 ∀实际上在本研究中发现 o此种设想不能成立 o’⁄yss为 s1u的侵染 o即使共培养时间延长至 y §o
所得转化效果仍大大低于高浓度在较短共培养时间的结果 o显然农杆菌的转化效果在侵染结束后 o就已经基
本确定 ∀可见在香樟的农杆菌介导的遗传转化中 o侵染浓度跟共培养时间相比较而言 o侵染浓度对转化效果
的影响更显著 ∀
312 胚性愈伤组织的植株再生
在进行植株再生的过程中 o抗生素是选择再生植株的关键 ∀它虽然是得到阳性转化材料再生植株的保
证 o但也可能是植株再生困难的根源 ∀在本试验中观察到 o同样进行体胚诱导k附加不同抗生素的诱导培养
基l o卡那霉素抗性愈伤组织诱导获得体胚后k转化含有 ‘°× µ的质粒 o数据未列出l o而潮霉素抗性愈伤组织
没有体胚的形成 ∀试验中观察到香樟胚性愈伤组织对于这 u种抗生素刺激的反应不同 o对潮霉素刺激的敏
感很有可能就是使之发育迟缓的原因 ∀转化细胞是因为含有抗性基因来抵抗抗生素的刺激 o抗生素对这些
材料生长的抑制作用是一直存在的 o这种抑制作用就可能是导致抗性愈伤组织再生困难的原因之一 ∀所以 o
{x 林 业 科 学 ww卷
在使用抗生素进行选择和再生培养时 o应该将抗生素浓度设定为先低后高再低或无 o这样既保证了转化的有
效性 o又能使植株再生不再受阻 ∀目前本试验的香樟潮霉素抗性愈伤组织正在进行植株再生的诱导 ∀
参 考 文 献
杜 丽 o叶要妹 o包满珠 qussy1 香樟未成熟合子胚体胚发生及影响因素的研究 q林业科学 owukyl }vz p v| q
苏晓华 o张冰玉 o黄秦军 o等 qussv1 我国林木基因工程研究进展及关键领域 q林业科学 ov|kxl }ttt p tt{ q
王爱菊 o张凤美 o鹿金颖 o等 qussy1 农杆菌介导的百合遗传转化体系的建立 q园艺学报 ovvkvl }yyw p yyy q
谢德意 o金双侠 o郭小平 o等 qussz1 棉花胚性愈伤组织的转化及转基因胚状体的有效萌发与成苗技术研究 q作物学报 ovvkxl }zxt p zxy q
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k责任编辑 徐 红l
|x 第 w期 杜 丽等 }香樟胚性愈伤组织遗传转化体系建立