全 文 ：第 wu卷 第 t期
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林 业 科 学
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反义磷脂酶 ⁄Χ基因与几丁质酶基因转化美洲黑杨 Šu
邹维华t ou 赵 强t 崔德才t 王 斌v
kt q山东农业大学生命科学学院 泰安 uztst{ ~ u q中国农业科学院生物技术研究所 北京 tsss{t ~
v q中国科学院遗传与发育生物学研究所 北京 tsststl
摘 要 } 建立美洲黑杨 Šu组培再生体系 o确立美洲黑杨 Šu分化最适宜培养基和生根培养基 ∀然后分别进行卡
那霉素和潮霉素敏感性试验 o利用叶盘法依次将反义磷脂酶 ⁄Χk„±·¬p°⁄Χl基因和几丁质酶k≤‹x…l基因转入美洲
黑杨 Šu中 ∀首先转入反义磷脂酶 ⁄Χ基因 o经诱导不定芽及生根阶段卡那霉素k选择性抗生素l连续筛选 o获得了
ut株卡那霉素抗性植株 ∀抗性植株经 °≤• 及 °≤•p≥²∏·«¨µ±杂交检测 o有 tv株均呈阳性 o证明 „±·¬p°⁄Χ基因成功整
合到美洲黑杨 Šu基因组中 ∀耐盐性试验表明 ow株转基因植株抗 ‘¤≤¯ 能力比对照都有不同程度提高 ∀选择 w号
株系继续转入几丁质酶基因 o通过潮霉素k选择性抗生素l筛选不定芽及诱导生根获 y株潮霉素抗性植株 o经 °≤•
及 °≤•p≥²∏·«¨µ±杂交检测 oy株均呈阳性 o证明 ≤‹x…基因成功整合到美洲黑杨 Šu基因组中 ∀由于 ≤‹x…基因与报
告基因 Š˜≥处于同一开放阅读框k’• ƒl内 o因此通过 Š˜≥基因的组织化学染色分析 o证明了 y株转化植株几丁质
酶基因均获得正常表达 ∀
关键词 } 美洲黑杨 ~反义磷脂酶 ⁄Χ基因 ~几丁质酶基因 ~耐盐 ~抗病
中图分类号 }≥zt{1wy ~±|wv1u 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kussylst p ssvz p sy
收稿日期 }ussw p st p tx ∀
3 崔德才为通讯作者 ∀
Τρανσφορµατιον οφ Ποπυλυσ δελτοιδεσ ωιτη Αντι2ΠΛ∆Χ Γενε ανδ Χηιτινασε Γενε
²∏ • ¬¨«∏¤tou «¤² ±¬¤±ªt ≤∏¬⁄¨ ¦¤¬t • ¤±ª…¬±v
kt qΧολλεγε οφ Λιφε Σχιενχε o Σηανδονγ Αγριχυλτυραλ Υνιϖερσιτψ Ται. ανuztst{ ~ u qΒιοτεχηνολογψ Ρεσεαρχη Ινστιτυτε o Χηινεσε Αχαδεµψ
οφ ΑγριχυλτυραλΣχιενχεσ Βειϕινγtsss{t ~ v qΙνστιτυτε οφ Γενετιχσ ανδ ∆εϖελοπµενταλ ΒιολογψoΧΑΣ Βειϕινγtsststl
Αβστραχτ} ∂¬¤ ¶¨ ∏´¨±·¬¤¯ ¶¬±ª¯ 2¨ª¨ ±¨ ·µ¤±¶©²µ°¤·¬²± ¶·µ¤·¨ª¼o¤±·¬¶¨±¶¨ ³«²¶³«²¯¬³¤¶¨ ⁄Χk„±·¬2°⁄Χlª¨ ±¨ ¤±§¦«¬·¬±¤¶¨
k≤‹x…l ª¨ ±¨ º¨ µ¨ ¬±·µ²§∏¦¨§¬±·² Ποπυλυσ δελτοιδεσ kŠul ¬± ³µ²³¨µ²µ§¨µ¥¼ Αγροβαχτεριυµ τυµεφαχιεν °¨ §¬¤·¨§¶² ¤¶·²
±¨«¤±¦¨ ¶¤¯·2·²¯ µ¨¤±¦¨ ¤±§§¬¶¨¤¶¨ µ¨¶¬¶·¤±¦¨ qƒ¬µ¶·¯¼o·«¨ ²³·¬°¤¯ °¨ §¬¤²© Πq δελτοιδεσkŠul©²µ¥∏§§¬©©¨µ¨±·¬¤·¬²±¤±§µ²²·¬±ª
º¨ µ¨ ¶¨·¤¥¯¬¶«¨§q׫¨ ¶¨±¶¬·¬√¬·¼ ²© ¬¨³¯¤±·¶·²®¤±¤°¼¦¬±¤±§«¼ªµ²°¼¦¬± º¨ µ¨ ·¨¶·¨§¶¨³¤µ¤·¨¯¼¬± ²µ§¨µ·²§¨¦¬§¨ ¤µ¨¤¶²±¤¥¯¨
¶¨¯¨ ¦·¬√¨ ³µ¨¶¶∏µ¨ ©²µ·µ¤±¶©²µ°¤·¬²±q„±·¬2°⁄Χª¨ ±¨ º¤¶¬±·µ²§∏¦¨§©¬µ¶·¯¼qut ®¤±¤°¼¦¬±2µ¨¶¬¶·¤±·µ²²·¨§³¯¤±·¶º¨ µ¨ ²¥·¤¬±¨ §
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Κεψ ωορδσ} Ποπυλυσ δελτοιδεσ~ ¤±·¬¶¨±¶¨ ³«²¶³«²¯¬³¤¶¨ ⁄Χ ª¨ ±¨ k„±·¬p°⁄Χl ~¦«¬·¬±¤¶¨ ª¨ ±¨ k≤‹x…l ~¶¤¯·2·²¯ µ¨¤±¦¨ ~
§¬¶¨¤¶¨ µ¨¶¬¶·¤±¦¨
利用基因工程技术选育耐盐杨树是开发利用盐碱地的一条十分有发展前景的途径 o在防治土壤盐渍化
和维护生态环境方面都具有十分重要的意义k刘岩等 ot||zl ∀在转入耐盐基因的基础上如能再将抗病基因
转入杨树中 o则会大大提高其开发利用的价值 ∀本研究的目的就是试图将与耐盐有关的磷脂酶基因和与抗
病有关的几丁质酶基因同时转入杨树中 o以获得既耐盐又抗病的速生杨树新种质材料 ∀
磷脂酶是通过调节细胞膜透性 o影响细胞渗透压平衡和细胞信号转导的一类酶 o与植物耐受逆境的能力
直接相关 o其中的磷脂酶 ⁄k°⁄l在植物中广泛存在k∏±±¬® ετ αλqot||{ ~• ¤±ªot|||l ∀研究表明 o°⁄不仅
可以水解磷脂 o改变细胞膜的稳定性和透性 o而且水解产物中的磷脂酸 !胆碱和乙醇胺等还是信号分子 o参与
细胞对外界环境刺激的应答过程和细胞内的信号传递 o从而影响和调节细胞内一系列基因的表达k • ¤±ªo
t||| ~崔德才等 ousssl ∀在自然状态下 o当植物受到逆境如病虫害 !干旱 !水淹等条件胁迫时 o磷脂酶活性会
在短时间内剧烈变化使膜的透性改变 o从而引起植物的应答反应k • ¤±ªot||z ~t||| ~¨¨ ετ αλqot||{ ~∏±±¬®
ετ αλqot||{l ∀如果能在一定范围内抑制 °⁄的活性 o则有可能改变植物对逆境的反应 o减少伤害 ∀对转
°⁄Χ反义基因所得的拟南芥kΑραβιδοπσιστηαλιαναl和烟草k Νιχοτιανα ταβαχυµl的转化植株所做的测定表明 o其
°⁄的活性明显受到抑制 o抗逆性有了明显改变kƒ¤± ετ αλqot||z ~t|||l ∀刘斌等kussul通过农杆菌介导法获
得的转反义 °⁄Χ基因的三倍体毛白杨k Ποπυλυστοµεντοσαl…×pt{ o在实验室条件下显示其耐盐性明显高于对
照 o可在含 y{ °°²¯#pt以上 ‘¤≤¯ 的培养基上正常生长 ∀
几丁质酶具有降解几丁质k聚 ‘p乙酰胺基葡萄糖l的作用k¬±·«²µ·ot||tl ∀许多危害植物的病原真菌
的细胞壁主要成分之一是几丁质 o而植物中还未发现几丁质酶的底物 ∀所以 o几丁质酶在防御病原真菌侵害
中具有重要作用 o它既能阻碍病原真菌细胞壁构成物质的沉积 o破坏细胞壁的正常建成 o又能降解病原真菌
细胞壁中的几丁质 o破坏真菌细胞壁 o而且这个过程产生的细胞壁碎片具有诱导物作用 o从而刺激寄主植物
产生抗病反应 o最终致使病原体死亡k•²¥¨µ·¶ ετ αλqot|{{l ∀转几丁质酶基因获得的烟草 !水稻k Ορψζα
σατιϖαl !小麦k Τριτιχυµ αεστιϖυµl等抗病性都有所提高k…µ²ª¯¬¨ ετ αλqot||t ~∂¬¯¯¬¨ ot||x ~¬ετ αλqousstl ∀
本研究选用单基因连续转化法 o通过农杆菌介导先把反义磷脂酶 ⁄Χ基因转到美洲黑杨k Ποπυλυσ
δελτοιδεσlŠu中 o获得耐盐植株后 o再转入几丁质酶基因 o最终获得了转双价基因的 Šu速生黑杨新种质材料 ∀
t 材料与方法
111 试验材料与菌种
美洲黑杨 Šu为一优良无性系 o由中国科学院遗传研究所与格林公司 !北京农林科学院联合培育 o中国
科学院遗传与发育生物学研究所泰安生物技术实验基地提供 ∀ °⁄Χ反义基因由美国肯萨斯州立大学王学
敏教授惠赠 o载体质粒为 ³Ž≠÷zk见图 tl o农杆菌菌株为 ∞‹„tsx o„±·¬p°⁄Χ基因由花椰菜花叶病毒的 vx≥
启动子驱动 o含新霉素磷酸转移酶基因 o具卡那霉素抗性 o终止子为二磷酸核酮糖羧化酶小亚基 ∞|基因 v.
末端终止子µ¥¦≥v. ∀菜豆几丁质酶基因 ≤‹x…载体质粒为 ³tvss≤‹x…o由王斌实验室克隆并保存 o≤‹x…基因
由双 vx≥启动子驱动 o几丁质酶基因后连有 Š˜≥报告基因 o具潮霉素抗性k见图 ul ∀
图 t 质粒 ³Ž≠÷z的结构
ƒ¬ªqt ⁄¬¤ªµ¤° ²©³¯¤±·¨ ¬³µ¨¶¶¬²± √¨ ¦·²µ³Ž≠÷z 图 u 质粒 ³tvss≤‹x…的结构
ƒ¬ªqu ⁄¬¤ªµ¤° ²©³¯¤±·¨ ¬³µ¨¶¶¬²± √ ¦¨·²µ³tvss≤‹x…
112 方法
t1u1t 卡那霉素kŽ°l和潮霉素k‹¼ªl临界筛选浓度的确定 为确定 Šu杨对卡那霉素及潮霉素的抗性 o将
生长健壮的幼嫩叶片及高约 v ∗ x ¦°的芽分别接种于含不同浓度抗生素的叶分化培养基和生根培养基上 o
进行叶片诱导分化及芽诱导生根的抗生素临界浓度试验 ∀
t1u1u 农杆菌介导的杨树叶盘转化 改良的农杆菌介导杨树叶盘转化法参照刘斌等kussul的方法进行 o通
过延长共培养时间提高了叶片转化率 o转化叶片在筛选培养基上生长 v ∗ w周后 o转移到含筛选抗生素的生
根培养基上 o将能正常生根的株系扩繁作为分子检测的材料 ∀
t1u1v 杨树再生苗的 °≤• 检测 采用 ≥⁄≥微量提取法k王关林等 oussul从幼嫩组培苗的叶片中提取植株总
⁄‘„ o取 tss ∗ xss ±ªo分别用反义 °⁄Χ及几丁质酶基因的引物 o参照 ≤¤µ¯等kt||xl的方法进行 °≤• 检测 o按
标准反应程序进行 °≤• 扩增 o°≤• 产物经 t1u h琼脂糖凝胶电泳 !∞…染色后 o在 ˜∂ 灯下观察结果 ∀
t1u1w 转基因杨树的 °≤•p≥²∏·«¨µ±杂交鉴定 °≤•p≥²∏·«¨µ±杂交参照 ≥¤°¥µ²²®等kt|{|l的方法进行 o°≤• 产
{v 林 业 科 学 wu卷
物经 t1u h琼脂糖凝胶电泳后 o用毛细管转移法转移到 ‹¼¥²±§p‘n尼龙膜上 o预杂交 o杂交后进行放射性自显
影 ∀探针用随机引物法合成 o采用 °µ²°¨ ª¤的 °µ¬°¨ µp¤pŠ¨ ±¨ ¤¥¨ ¬¯±ª≥¼¶·¨°试剂盒 o试验中用转化质粒 ⁄‘„
作为阳性对照 o用未转基因的美洲黑杨 Šu植株 ⁄‘„作为阴性对照 ∀
t1u1x 转反义 °⁄Χ基因植株的耐盐性鉴定 取株高 v ∗ x ¦°o转反义 °⁄Χ基因 °≤•p≥²∏·«¨µ±杂交阳性植
株和未转化的阴性对照植株各 ts株 o接种于不同含盐量生根培养基上 o进行耐盐性分析 ∀ ‘¤≤¯ 浓度分别为
s oy{ otsu otvy otzs °°²¯#pt ot{ §后检测结果 ∀
t1u1y Š˜≥基因稳定表达的组织化学染色 Š˜≥基因稳定表达的组织化学染色分析参照王关林等kussul
的方法进行 o取转几丁质酶基因 °≤•p≥²∏·«¨µ±杂交阳性植株和未转化的阴性对照植株叶片 v ∗ w片浸泡在
Š˜≥染色液中于 vz ε 保温过夜 o将材料转入 zs h的乙醇中脱色 o至阴性对照材料呈白色 o肉眼观察拍照 ∀
u 结果
211 卡那霉素(Κµ )和潮霉素(Ηψγ)临界筛选浓度
结果表明 o低浓度的卡那霉素kŽ°l即抑制叶片产生不定芽 ∀在不含 Ž°的对照培养基上 o外植体产生
大量丛生芽 o当 Ž°浓度大于 us °ª#pt时 o叶片既不分化出芽也不产生愈伤组织 ∀故 Ž° us °ª#pt即可作
为临界浓度筛选转化细胞 ∀叶片分化对潮霉素非常敏感 ox °ª#pt时叶片即不能分化 ots °ª#pt时叶片变
褐 o坏死 o本试验选取 ts °ª#pt筛选转化细胞 ∀
芽诱导生根的临界卡那霉素浓度要高于叶分化所需浓度 oŽ°浓度大于 vs °ª#pt时就没有根分化发
生 o因此取 vs °ª#pt的卡那霉素筛选抗性植株 ∀芽诱导生根对潮霉素也非常敏感 ox °ª#pt时即不能生根 o
与培养基接触部位变白 o叶片变黄 ∀试验中取 ts °ª#pt筛选转化植株 ∀
212 转基因植株的抗性筛选
转反义 °⁄Χ基因的叶片在附加头孢霉素k≤ ©¨lwss °ª#pt !卡那霉素kŽ°lus °ª#pt的分化培养基上 us
§后即分化出抗性芽 o待小芽长至 s1x ¦°左右时转到含相同抗生素浓度的扩繁培养基上 otx §转接 t次 o转
接 v次 o其中大多数小芽黄化死亡 ∀将获得的抗性芽转到附加 ≤ ©¨wss °ª#pt oŽ° vs °ª#pt的生根培养基
上 o十几天后即可生根 ∀获得了 ut株卡那霉素抗性植株 o转化植株扩繁后进行分子检测 ∀
转 ≤‹x…基因的叶片经共培养 ts §o待叶片上有芽点突起后再将叶片转移到附加 ≤ ©¨wss °ª#pt !潮霉
素k‹¼ªlts °ª#pt的分化培养基上 o培养期内叶片严重失绿褐化 o仅局部可见绿色芽点分化长大 ∀ux §后转
至含相同抗生素的扩繁培养基上继续培养 vs §以上 o芽丛生长缓慢 o仅长至 s1x ¦°大小 ∀将芽丛转至不含
潮霉素仅附加头孢霉素的培养基上扩繁 o待芽长至 v ∗ x ¦°时进行抗生素生根培养 o在含 ‹¼ªts °ª#pt的培
养基上 ts §后有 y株正常生根 o将这 y个株系分别扩繁 o进行分子检测 ∀
图 w 转反义 °⁄Χ基因 °≤•2≥²∏·«¨µ±杂交检测
ƒ¬ªqw °≤•2≥²∏·«¨µ± «¼¥µ¬§¬½¤·¬²± ¤¶¶¤¼ ²©¤±·¬2°⁄Χ ª¨ ±¨
t ou ov ox oy }转基因植株 ×µ¤±¶ª¨ ±¬¦³¯¤±·¶~w }质粒 ⁄‘„k阳性对照l
°¯¤¶°¬§⁄‘„ ¤¶³²¶¬·¬√¨¦²±·µ²¯ ~z }非转基因植株k阴性对照l‘²±p
·µ¤±¶©²µ°¨ §³¯¤±·¤¶±¨ ª¤·¬√¨ ¦²±·µ²¯ q
图 v 反义 °⁄Χ基因的 °≤• 检测
ƒ¬ªqv °≤• ¤¶¶¤¼ ²©¤±·¬p°⁄Χ ª¨ ±¨
t }u ®¥标准物 u ®¥ ¤¯§¨µ~x }质粒 ⁄‘„k阳性对照l °¯ ¤¶°¬§ ⁄‘„ ¤¶
³²¶¬·¬√¨ ¦²±·µ²¯ ~{ }非转基因植株k阴性对照l‘²±2·µ¤±¶©²µ° §¨ ³¯¤±·¤¶
±¨ ª¤·¬√¨¦²±·µ²¯ ~u ov ow oy oz }转化植株 ×µ¤±¶ª¨ ±¬¦³¯¤±·¶q箭头指出 wss
¥³的目的扩增片段 „µµ²º ¬±§¬¦¤·¨¶·«¨ ·¤µª¨·¤°³¯¬©¬¦¤·¬²±©µ¤ª° ±¨·q
213 ΠΧΡ 与 ΠΧΡ−Σουτηερν鉴定
考虑到美洲黑杨本身含有 °⁄Χ基因 o所以在引物设计上做了些调整 ∀反义 °⁄Χ基因 x.引物从 vx≥启
动子中选取 ov.引物从 °⁄Χ反义基因内部选取 o以含反义 °⁄Χ基因的质粒 ³Ž≠÷z作阳性对照 o以未转基
因的美洲黑杨 Šu植株作为阴性对照 o进行 °≤• 扩增 ∀tv株卡那霉素抗性植株呈阳性 ox株卡那霉素抗性植
株 °≤• 结果见图 v o其余 {株 °≤• 图略 ∀转基因的植株得到一条和预期长度一样大小的 wss ¥³的目的片段 o
有的样品除目的带外 o还扩增出了非特异带 o未转基因植株也有此非特异带扩增 o优化 °≤• 条件后依然如
|v 第 t期 邹维华等 }反义磷脂酶 ⁄Χ基因与几丁质酶基因转化美洲黑杨 Šu
此 o这可能是内源 °⁄非特异性扩增的结果 ∀为了进一步证明 °≤• 扩增结果 o将 °≤• 扩增产物电泳后转印
于尼龙膜上 o进行 °≤•p≥²∏·«¨µ±杂交检测k图 wl ∀°≤• 阳性植株扩增产物目的带显示出较强信号 o非特异带
没有显示杂交信号 o对照植株没有显示信号 o说明反义 °⁄Χ基因已整合到美洲黑杨 Šu基因组中 ∀
转几丁质酶基因的潮霉素抗性植株的 °≤• 检测结果如图 x所示 ∀y个抗性株系全表现为阳性 o经 °≤•p
≥²∏·«¨µ±杂交检测显示较强信号k图 yl o而阴性对照既无 °≤• 扩增带也无 °≤•p≥²∏·«¨µ±杂交信号 ∀证明
≤‹x…基因已整合到美洲黑杨 Šu基因组内 ∀
图 x 转几丁质酶基因的 °≤• 检测
ƒ¬ªqx °≤• ¤¶¶¤¼ ²© ≤‹x… ª¨ ±¨
t }u ®¥标准物 u ®¥ ¤¯§¨µ~u ow ox oy }³tvss≤‹x… 质粒 ⁄‘„ k阳性对照l
³tvss≤‹x… ³¯¤¶°¬§⁄‘„ ¤¶³²¶¬·¬√¨ ¦²±·µ²¯ ~v }非转基因植株k阴性对照l ‘²±2
·µ¤±¶©²µ° §¨³¯¤±·¤¶±¨ ª¤·¬√¨ ¦²±·µ²¯ ~z ∗ tu }转化植株 ×µ¤±¶ª¨ ±¬¦³¯¤±·¶q箭头指
出目的扩增片段 „µµ²º ¬±§¬¦¤·¨¶·«¨ ·¤µª¨·¤°³¯¬©¬¦¤·¬²±©µ¤ª°¨ ±·q
图 y 转几丁质酶基因 °≤•2≥²∏·«¨µ±检测
ƒ¬ªqy °≤•2≥²∏·«¨µ± ¤¶¶¤¼ ²© ≤‹x… ª¨ ±¨
t }阳性对照 °²¶¬·¬√¨¦²±·µ²¯ ~u ∗ z }转基因植株 ×µ¤±¶ª¨ ±¬¦³¯¤±·¶q
箭头指出目的扩增片段 „µµ²º ¬±§¬¦¤·¨¶·«¨ ·¤µª¨·¤°³¯¬©¬¦¤·¬²±
©µ¤ª° ±¨·q
表 1 转基因植株耐盐性测定结果 ≠
Ταβ . 1 Τηε ρεσυλτ οφ σαλτ−τολερανχε τεστ οφ τρανσγενιχ πλαντσ
试验材料
°¯ ¤±·°¤·¨µ¬¤¯¶
‘¤≤¯ 浓度 ‘¤≤¯¦²±¦¨±·µ¤·¬²±Πk°°²¯#ptl
s y{ tsu tvy
≤Ž 生根率 • ²²·¬±ª©µ¨ ∏´¨ ±¦¼Πh tss ys vs s
每株生根数 ‘∏°¥¨µ²©µ²²·¶³¨µ¶«²²· z w u s
平均根长 „√¨ µ¤ª¨ ¯¨ ±ª·«²©µ²²·¶Π¦° u1x t1s s1u s
t 生根率 • ²²·¬±ª©µ¨ ∏´¨ ±¦¼Πh tss tss ys ux
每株生根数 ‘∏°¥¨µ²©µ²²·¶³¨µ¶«²²· z x w w
平均根长 „√¨ µ¤ª¨ ¯¨ ±ª·«²©µ²²·¶Π¦° u1x t1z t1s s1x
u 生根率 • ²²·¬±ª©µ¨ ∏´¨ ±¦¼Πh tss zs xy vs
每株生根数 ‘∏°¥¨µ²©µ²²·¶³¨µ¶«²²· z y w v
平均根长 „√¨ µ¤ª¨ ¯¨ ±ª·«²©µ²²·¶Π¦° u1x t1{ t1u s1x
v 生根率 • ²²·¬±ª©µ¨ ∏´¨ ±¦¼Πh tss tss |s ys
每株生根数 ‘∏°¥¨µ²©µ²²·¶³¨µ¶«²²· z z x w
平均根长 „√¨ µ¤ª¨ ¯¨ ±ª·«²©µ²²·¶Π¦° u1x u1s t1u s1w
w 生根率 • ²²·¬±ª©µ¨ ∏´¨ ±¦¼Πh tss tss zx ys
每株生根数 ‘∏°¥¨µ²©µ²²·¶³¨µ¶«²²· z z w w
平均根长 „√¨ µ¤ª¨ ¯¨ ±ª·«²©µ²²·¶Π¦° u1x t1{ t1v s1v
≠当 ‘¤≤¯浓度为 tzs °°²¯#pt时 o植株不能生根 o变褐死亡 ∀Œ±·«¨ ¦²±§¬·¬²± ²©
tzs °°²¯#pt ‘¤≤¯ o±²µ²²·¶º µ¨¨ ¬±§∏¦¨§o·«¨ ¶«²²·¶·∏µ±¨ §¥¯¤¦®¤±§§¬¨§q
214 转基因植株耐盐性测定与
筛选
取株高 v ∗ x ¦°的转基因无
根试管苗 o接种于含不同 ‘¤≤¯ 浓
度的生根培养基上 o进行耐盐性
分析 ∀培养 t{ §后进行统计分
析 o结果见表 t ∀对照植株在含
‘¤≤¯ tvy °°²¯#pt以上的培养基
上不能生根 o叶子由灰黄变白变
黑 o植株全部死亡 ∀ tv 株 °≤•p
≥²∏·«¨µ±阳性植株则表现不一 o从
中筛选到 w株耐盐性强的植株 ∀
这 w 个植株及其扩繁的后代在
‘¤≤¯ 浓度为 s ∗ y{ °°²¯#pt的培
养基上生长良好 o叶子鲜绿色 ∀
随 ‘¤≤¯ 浓度升高 o植株生长受抑
程度逐渐加深 o在含 tvy °°²¯ #
pt ‘¤≤¯ 的生根培养基上仍能够生根生长 o根长 s1v ∗ s1x ¦°∀在 tzs °°²¯#pt ‘¤≤¯ 的生根培养基上不能生
根 o植株变褐死亡 ∀由此可以证明 o转 °⁄Χ反义基因确实明显提高了美洲黑杨 Šu的耐盐性 ∀
215 ΓΥΣ基因稳定表达的组织化学染色
由于 ≤‹x…基因后连有报告基因 Š˜≥ o处于同一开放阅读框内 o因此通过检测 Š˜≥基因的稳定表达 o就
可以证明几丁质酶基因获得表达 ∀ Š˜≥基因稳定表达的组织化学染色表明 o所获 y个转基因植株及其后代
中的 Š˜≥基因正常表达 o同时可以推断 ≤‹x…基因也能表达 ∀
v 讨 论
随着植物基因工程技术的日益成熟和完善 o为了使受体植物获得多个优良新性状 o现代基因转化的趋势
往往是将 u个或 u个以上的基因转入同一个受体之中 o如在抗病基因工程中常常转入多种生化底物的抗菌
sw 林 业 科 学 wu卷
蛋白 o以使植物获得抵抗多种病原物侵害的能力 ∀同样在生产某一代谢物时 o也需要转入该代谢物生化合成
途径中的多个基因 ∀多基因转化植株的获得有以下几种途径 }
第 t种是分步进行单个基因的转化 o再进行转基因植株的杂交k«∏ ετ αλqot||w ~…¬½¬¯¼ ετ αλqousssl ∀
此方法的缺陷是后代中不同的转基因位于不同的基因位点 o使杂交后的育种过程变得非常复杂 o而且这种方
法不适用于马铃薯k Σολανυµ τυβεροσυµl !甘薯kΙποµοεα βατατασl !果树 !林木等无性繁殖植物 ∀
第 u种是单基因连续转化法 o即先转入一个基因 o获得转基因植株后再转入另一个基因 ∀此方法需要在
各步的基因转化过程中使用不同的选择标记 ∀
第 v种是将多个基因构建于一个转化载体中 o基因间首尾相连接 o各个基因都有自己的启动子与终止子
k≥¯ ¤·¨µετ αλqot|||l ∀这是目前广泛采用的一种方法 ∀有试验表明 o同一转基因植株内多拷贝的同一启动子
的存在易导致转基因沉默k∂¤± ετ αλqot||vl o因此要选用不同的启动子 o而找到一套在细胞类型 !表达水平 !
发育特异性及对环境应答等方面表现一致的启动子又变得非常困难 ∀
第 w种是基于由一个转录单元编码的多蛋白前体经蛋白酶剪切后能产生多种蛋白质的机制k≤¤µµ¬±ª·²±
ετ αλqot|{{l o将多个基因构建于同一表达框下 o基因间通过连接子k¯¬±®¨µl相连 o该连接子可被体内蛋白酶切
割 ∀这种方法是当前研究的热点 o但由于缺乏对蛋白质剪切机制的深入了解 o构建的多个载体转化后不能被
完全切割 o产生的蛋白质往往携带连接子的几个氨基酸残基 o使蛋白质功能大大下降k˜µº¬± ετ αλqot||{ ~
‹¤¯³¬± ετ αλqot||| ~Œ¶¤¥¨¯¯¨ ετ αλqoussul ∀
综合以上几种方案 o本研究采用第 u种方案 o即首先通过卡那霉素筛选获得转反义 °⁄Χ基因植株 o经耐
盐性筛选获得高耐盐植株后 o继续转入几丁质酶基因 o通过潮霉素筛选获得转化植株 o由于每个基因转化之
后都进行了严格的抗生素筛选和分子鉴定 o因此那些非转化植株及表达较弱的植株都已被淘汰 o筛选得到的
是反义 °⁄Χ和几丁质酶基因整合及表达都是最好的植株 ∀
众多资料表明 o植物的耐盐性是多种抗盐生理性状的综合表现 o是由位于不同染色体上的多个基因控制
的k邱德有等 ot||vl ∀利用转基因技术获得的转基因植株虽有一定的抗盐性 o但这只是相对于对照株而言
的 o因此 o利用转基因技术研究植物的抗盐性还需要深入的研究 ∀反义 °⁄Χ基因的导入使部分转化植株的
耐盐性有所提高 o还只是实验室内获得的初步结果 o今后将结合田间试验进一步加强植物耐盐机制的研究 ∀
至于转基因植株的抗病性还有待测定 o如进行几丁质酶活性测定和病原菌接菌试验 ∀杨树为多年生木本植
物 o其耐盐性及抗病性的鉴定要经过 v ∗ x年 o甚至更长时间的田间实地栽培才能获得比较肯定的结果 ∀
参 考 文 献
崔德才 o温孚江 qusss q磷脂酶 ⁄k°⁄l在植物信号转导中的作用 q山东农业大学学报 }自然科学版 ovtkul }ttx p tt|
刘 斌 o李红双 o王其会 o等 qussu q反义磷脂酶 ⁄Χ基因转化毛白杨的研究 q遗传 ouwktl }ws p ww
刘 岩 o彭学贤 o谢友菊 o等 qt||z q植物抗渗透胁迫基因工程研究进展 q生物工程进展 otzkul }vt p v{
邱德有 o朱 徵 qt||v q植物抗渗透胁迫的基因调控及基因工程 q生命科学 oxkwl }ty p tz
王关林 o方宏筠 qussu q植物基因工程 qu版 q北京 }科学出版社
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k责任编辑 徐 红l
简 讯
中国林学会木材科学分会第十次学术研讨会暨/生物质材料科学研究与高效利用0国际学术研讨会于 ussx年 tu月 t ) w
日在南宁广西大学召开 ∀编辑部派石红青同志参加了此次会议 o意在让编辑人员参加相关学科的学术活动 o掌握最新研究动
态 o了解大型攻关课题的研究进展 o宣传5林业科学6 o物色期刊审稿专家 ∀参会同时 o石红青同志还征求了与会代表对期刊发
展的意见 ∀
ussy年 o5林业科学6将由双月刊改为月刊 o这是时代发展的需要 o也是缩短期刊时滞 !适应读者需求的需要 ∀总结与会代
表对本刊发展的意见和建议 o主要有以下几个方面 ∀
tl5林业科学6作为/中国林业学术第一刊0 o在科研人员心目中的位置不容置疑 ∀
ul5林业科学6审稿严格 o学术水平为同类期刊中的佼佼者 ∀
vl期刊由双月刊改为月刊 o是顺乎读者意愿的 o但期刊的学术水平不能下降 ∀
wl期刊需要在进入国际检索系统 o如 ∞Œ!≥≤Œ等方面做出努力 o这样能吸引更多的好稿源 ∀
xl期刊的时滞应进一步缩小 o最好压缩在 t年之内 ∀
yl应开辟绿色通道 o好的文章优先发表 ∀
zl对综述性 !数学理论推导等方面的文章应严格把关 o尽量减少数量 ∀更多的应发表体现林业科学研究工作与成果的论
文 o以激励科研工作者深入开展国家所倡导的更具原创性的研究工作 ∀
{l建议5林业科学6文章的编排顺序按学术水平的高低排序 ∀
|l注重基础研究是关键 o但适当增加应用技术方面的好文章 o扩大期刊的读者面也非常必要 ∀
tsl实行双盲审稿适应读者和审稿人的要求 o但编辑一定要找准审稿人 o同时编辑部要严格把好审稿第一关 ∀
ttl应把握学科发展的前沿 o对一些重复性研究 !缺少理论k技术l创新的文章编辑部可建议作者改投他刊 o这样能减轻审
稿人的不必要负担 ∀
tul对编辑们的认真负责态度表示肯定 o但编辑部应在审稿期限内给作者及时答复 o以便作者对稿件及时处理 ∀
tvl适当增加广告 o可增加期刊收入 o但广告的数量不要过多 ∀
twl建议设立5林业科学6专项出版基金 ∀
从上述意见可以看出 o广大读者对5林业科学6十分关心 o并寄予厚望 ∀ussy年 o编辑部要以抓好期刊质量为第一要务 o积
极 !稳妥 !扎扎实实地迈出月刊发展的第一步 ∀
本刊编辑部
uw 林 业 科 学 wu卷