全 文 ：第 ww卷 第 {期
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林 业 科 学
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小桐子种子油体蛋白的提取及其电泳分析 3
刘玉君t ou 沈世华t
kt1 中国科学院植物研究所光合作用与环境分子生理学重点实验室 北京 tsss|v ~ u1 中国科学院研究生院 北京 tsssv|l
摘 要 } 小桐子的种子富含油脂 o是制备生物柴油的理想材料 ∀从小桐子种子中分离油体 o再从油体中提取蛋
白 o并采用聚丙烯酰胺凝胶电泳对油体蛋白进行分析 ∀结果表明 }小桐子种子油体蛋白经单向凝胶电泳后 o得到至
少 {个蛋白条带 o其中可能包含分子量分别为 us ®∏和 uw ®∏的 u种油质蛋白异构体 o且后者的表达量为前者的 u
倍 ~双向凝胶电泳后 o得到油体蛋白质组的二维表达谱 o这些蛋白质主要分布在等电点 x ∗ ts !分子量 tu ∗ yy ®∏的
范围内 ~对二维表达谱分析表明 }小桐子种子油体蛋白质组至少有 twt个蛋白点 o其中酸性蛋白 zw个 o碱性蛋白 yz
个 o表达丰度较高的多为低分子量碱性蛋白 ∀首次报道大量高效提取小桐子种子油体和分离油体蛋白的方法和技
术 o为进一步分析鉴定小桐子种子油体蛋白的组成和功能以及品种改良奠定基础 ∀
关键词 } 小桐子 ~种子 ~油体蛋白 ~u⁄2°„Š∞~≥⁄≥2°„Š∞
中图分类号 }≥zt{1wv 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kuss{ls{ p ssvz p sx
收稿日期 }ussz p s| p uv ∀
基金项目 }中国科学院知识创新工程重要方向项目kŽ≥≤÷u p ≠ • p Š p suz p ul ∀
3 沈世华为通讯作者 ∀
Ισολατιον ανδ Πολψαχρψλαµιδε Γελ Ελεχτροπηορεσισ Αναλψσισ οφ Οιλ Βοδψ
Προτεινσφροµ ϑατροπηα χυρχασ Σεεδσ
¬∏≠∏­∏±tou ≥«¨ ± ≥«¬«∏¤t
kt1 ΚεψΛαβορατορψοφ Πηοτοσψντηεσισ ανδ Ενϖιρονµενταλ Μολεχυλαρ Πηψσιολογψ Ινστιτυτε οφ Βοτανψo
Χηινεσε Αχαδεµψοφ Σχιενχεσ Βειϕινγ tsss|v ~ u1 Γραδυατε ΣχηοολoΧηινεσε Αχαδεµψοφ Σχιενχεσ Βειϕινγ tsssv|l
Αβστραχτ } ϑατροπηα χυρχασoº¬·««¬ª«²¬¯¦²±·¨±·¶¨ §¨¶o¬¶¤³µ²°¬¶¬±ª²¬¯¦µ²³©²µ°¤®¬±ª¥¬²§¬¨¶¨¯q’¬¯ ¥²§¼¬¶¤±¬°³²µ·¤±·
¦²±¶·¬·∏¨±·²©·«¨ ¶¨ §¨¶q Œ± ·«¬¶µ¨³²µ·o²¬¯ ¥²§¼ º¤¶¬¶²¯¤·¨§ ©µ²° ·«¨ ¶¨ §¨¶ ¤±§ ∏¶¨§·² ¬¨·µ¤¦·³µ²·¨¬±¶q „©·¨µ≥⁄≥
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§¨·¨¦·¨§twt ³µ²·¨¬±¶³²·¶¬±¦¯∏§¬±ªzw ¤¦¬§¬¦³µ²·¨¬±¶¤±§yz ¥¤¶¬¦³µ²·¨¬±¶q ²¶·²©·«¨ ³µ²·¨¬±¶§¬¶·µ¬¥∏·¨§¬±·«¨ µ¤±ª¨ ²©³Œ
x ∗ ts ¤±§°²¯ ¦¨∏¯¤µ°¤¶¶tu ∗ yy ®∏qƒ∏µ·«¨µ°²µ¨ o·«¨ ¤¥∏±§¤±·³µ²·¨¬±¶º¨ µ¨ °¤¬±¯¼ ²¯º °²¯ ¦¨∏¯¤µ°¤¶¶¥¤¶¬¦³µ²·¨¬±¶q׫¬¶
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©²∏±§¤·¬²±©²µ©∏µ·«¨µ∏±§¨µ¶·¤±§¬±ª·«¨ ©∏±¦·¬²± ²©¬·¶²¬¯ ¥²§¼q
Κεψ ωορδσ} ϑατροπηα χυρχασ~¶¨ §¨~²¬¯ ¥²§¼ ³µ²·¨¬±¶~u⁄2°„Š∞~≥⁄≥2°„Š∞
随着石化能源的日趋枯竭和生态环境的日渐恶化 o可再生且清洁的生物能源的研究开发已成为近年来
的热点课题 o以植物油为主要原料的生物柴油k¥¬²§¬¨¶¨ l¯以其优良的使用性能和环保效应倍受社会关注 o已
成为缓解液体燃油危机的重要途径之一 ∀油脂作为植物的重要成分 o主要以营养贮存物质积累于种子中 ∀
因此 o种子的产量 !含油量和脂肪酸组成等性状是入选生物柴油原料植物的关键指标 ∀
小桐子kϑατροπηα χυρχασl又名麻疯树 !膏桐等 o是大戟科k∞∏³«²µ¥¬¤¦¨¤¨ l麻疯树属kϑατροπηαl多年生亚乔木
k’³¨ ±¶«¤º ousssl o在我国主要分布于云南 !四川 !广西 !广东 !海南和贵州等热带和亚热带地区 ∀小桐子种子
含油量丰富 o对其脂肪酸成分 !理化性质 !十六烷值等研究表明 o小桐子种子油是制备生物柴油的理想原料
k…¤±¨ µ­¬ετ αλqot|{x ~Ž¤±§³¤¯ ετ αλqot||x ~ ƒ²¬§¯ ετ αλqot||y ~Ž∏°¤µ ετ αλqoussv ~ °µ¤°¤±¬®oussv ~ „®¬±·¤¼²o
ussw ~≥«¤« ετ αλqousswl ∀
种子油脂是以油体k²¬¯ ¥²§¼l的形式贮藏于胚乳 !子叶或盾片等组织中k‹∏¤±ªot||y ~ ∏µ³«¼ ετ αλqo
t|||l o被种子的萌发和幼苗生长利用k • ¤±±¨ µετ αλqot|{t ~ ‹∏¤±ªot||ul ∀油体外部包被一层磷脂和蛋白质
镶嵌而成的半单位膜 o脂肪酸以三酰甘油k·µ¬¤¦¼¯ª¯¼¨ µ¨²¯¶oׄŠl的结构储存其内k×½¨ ± ετ αλqot||ul ∀油体膜
及膜上附着的蛋白占油体质量的 t h ∗ w h o这些油体蛋白约 |s h为油质蛋白k²¯ ²¨¶¬±l o少量的为 ¦¤¯ ²¨¶¬±等
其他蛋白k¬¯¯¬¦«¬³ ετ αλqot||y ~×½¨ ± ετ αλqot||z ~≤«¨ ± ετ αλqot||| ~‘¤¨¶·¨§ ετ αλqousssl o它们共同参与油体
结构的建成和生物学功能 o并在油体的形成 !稳定及油脂代谢利用过程中发挥关键作用k×½¨ ± ετ αλqot||u ~
∏µ³«¼ ετ αλqot||| ~ƒµ¤±§¶¨± ετ αλqousst ~ƒ¯ ²µ¬¤±¤ ετ αλqousszl ∀油质蛋白作为油体中的主要蛋白 o已在多种
植物中发现分子量不同的异构体 o并对其在植物组织中的分布 !蛋白结构和功能进行了研究k×½¨ ± ετ αλqo
t||s ~t||u ~t||v ~t||{ ~„¥¨¯¯ ετ αλqot||z ~ • ∏ ετ αλqot||| ~ƒ¯ ²µ¬¤±¤ ετ αλqousszl ∀提取小桐子种子的贮油细
胞器 ) ) ) 油体和分离油体蛋白 o有利于了解油体蛋白质的组成 !种类 !理化学等特性 o为运用生物技术手段进
一步改良品种 o提高种子的油脂含量和改变油脂组分等打下基础 ∀
本研究首次从小桐子种子中提取出油体 o并分别采用聚丙烯酰胺凝胶单向k≥⁄≥2°„Š∞l和双向电泳ku⁄2
°„Š∞l的方法对油体蛋白进行分析 o报道了小桐子种子油体蛋白组表达谱 o及各蛋白质的等电点 !分子量和表
达量等 o为阐明油脂的储藏方式奠定了基础 o也为培育更适于产业化种植的高油小桐子品种提供理论依据 ∀
t 材料与方法
111 材料
供试材料为采自四川省攀枝花市约 ws年树龄人工栽培小桐子的成熟种子 o油体分离及蛋白提取时随机
取不同植株的种子约 ts粒混合提取 ∀
112 方法
t1u1t 油体的分离 参考 ∂ ¶¨±¤等kussyl油体提取方法 ∀取 x ª种仁在 tx °匀浆液 Š ´ kt °°²¯#pt
∞⁄ׄ ots °°²¯#pt Ž≤¯ ot °°²¯#pt ª≤¯ u ou °°²¯#pt ⁄×× os1y °°²¯#pt ≥∏¦µ²¶¨ os1tx °²¯#pt צ¬¦¬±¨ 2Ž’‹ o
³‹ z1xl中研磨成匀浆 o加 tx °ƒ ´ks1w °°²¯#pt ≥∏¦µ²¶¨ o其他成分同 Š ´l后 ots sss ª离心 vs °¬±后取
上层油层 ∀油层重悬于 tx °Š µkŠ ´ n u °²¯#pt ‘¤≤¯ l溶液 o加 tx °ƒ µkƒ ´ n u °²¯#pt ‘¤≤¯ l
后 o如上条件离心 ∀上层油层重悬于 tx °Š ´溶液 o加 tx °ƒ ´后 ots sss ª离心 vs °¬±∀然后取上层
油层 o室温重悬于 tx °Š µ溶液 o振荡 vs °¬±∀悬浮液如上离心 ∀油体层悬浮于 tx °Š ´kw ε l o再加
入 tx °ƒ ´kw ε l ots sss ª离心 vs °¬±∀最终油体层悬浮于 v °Š ´ ∀
t1u1u 从分离的油体中提取蛋白 参考 ×½¨ ±和 ‹∏¤±ªkt||ul提取方法并有一定改进 ∀s1x °分离的油体
按 tΒt加入石油醚 o振荡 otv sss ª离心 x °¬±后 o去除上层石油醚相 ∀重复此程序 u次以上 ∀用冷干机抽气
x °¬±o除去残余的石油醚 ∀加入 s1zx °氯仿Π甲醇kuΒt ςΠςl o振荡 otv sss ª离心 x °¬±∀富含蛋白的中间
层重悬于 s1ux °水 o加入 s1zx °氯仿Π甲醇kuΒt ςΠςl o振荡 otv sss ª离心 x °¬±∀重复加入氯仿Π甲醇
kuΒt ςΠςl振荡洗涤程序 u次以上 ∀最终 o中间层重悬于 s1x °水 o超声波处理 x °¬±∀加入 w倍体积的冷丙
酮 o于 p us ε 沉淀 ty «以上 ∀tx sss ª离心 us °¬±o所得蛋白沉淀冻干备用 ∀
t1u1v ≥⁄≥2°„Š∞ 参见¤¨ °°¯¬kt|zsl的方法 ∀每块胶电流强度为 ts °„ o当溴酚蓝指示带接近胶板下沿时
停止电泳 ∀凝胶用染色液 ≤……2• uxs染色 o脱色 o扫描 ∀
t1u1w u⁄2°„Š∞ 在 ’πƒ¤µ¨¯¯kt|zxl的方法上有所改进 o第一向等电聚焦采用 Œ°Š预制胶条ktt ¦° o³‹ w ∗ z o
³‹ y ∗ tt o„°¨ µ¶«¤° …¬²¶¦¬¨±¦¨¶o˜³³¶¤¯¤o≥º¨ §¨±l o泡涨上样 ∀电泳仪为 ∏¯·¬³«²µŒŒ ¨¯ ¦¨·µ²³«²µ¨¶¬¶ ∏±¬·
k„°¨ µ¶«¤° …¬²¶¦¬¨±¦¨¶l ous ε 恒温 o电泳程序设置为 vss ∂ t «oyss ∂ t «ot sss ∂ t «o{ sss ∂ y «k³‹ y ∗ tt的
胶条可延长至 ts «l ∀等电聚焦完成后 o取出胶条 o在 t h ⁄××的平衡缓冲液ky °²¯#pt尿素 ovs h ωΠϖ甘油 o
u1x h ωΠϖ≥⁄≥ ot h ⁄×× oxs °°²¯#pt ×µ¬¶2‹≤¯ o³‹ {1yl中平衡 tx °¬±后 o转入 u1x h Œ„„上述平衡缓冲液中
平衡 tx °¬±∀平衡好的胶条转移到第二向垂直板胶ktz h分离胶 ow h浓缩胶l的上端 o进行 ≥⁄≥2°„Š∞凝胶电
泳 o每块胶恒定电流 ux °„ ∀电泳完成后 o取下凝胶 o≤……2• uxs染色 o脱色 ∀
t1u1x 图像扫描与分析 脱色完成后凝胶用 ˜„÷ °²º¨ µ²²®utss÷扫描仪 k¤¬¬∏°× ¦¨«oפ¬³¨¬o≤«¬±¤l扫
描k分辨率 vss §³¬l o然后用 Œ°¤ª¨ ¤¶·¨µ× u⁄ °¯¤·¬±∏°软件进行图像分析 ∀
u 结果与分析
211 油体提取及其蛋白 Σ∆Σ2ΠΑΓΕ分离
采用改良 ∂ ¶¨±¤等kussyl油体提取方法从小桐子种仁中得到乳白色的油体k图 tl o再用改良 ×½¨ ±和
{v 林 业 科 学 ww卷
‹∏¤±ªkt||ul油体蛋白质分离方法从油体中提取蛋白质 o经过 ≥⁄≥2°„Š∞分离后 o共得到 {条油体蛋白带 o有
w条主带 …¤±§t !u !w !x o大小分别约为 vx !vw !uw !us ®∏k图 ul ∀种子油体蛋白质主要为油质蛋白质 o不同植物
油质蛋白的分子量范围均在 tx ∗ uy ®∏o被子植物中普遍存在 u种不同分子量大小的油质蛋白异构体 o且已
证实异构体可在被子植物的同一油体上同时存在k×½¨ ± ετ αλqot||{l ∀参考²¯¬√¨ ·等kusswl和 ∂ ¶¨±¤等kussyl
的研究结果 o认为 …¤±§t !u可能为 u种油质蛋白异构体 o分子量分别约为 us ®∏和 uw ®∏o后者的表达量为前
者的 u倍 ∀表达量丰富的 …¤±§w !x分子量分别为 vw !vx ®∏左右 o相似大小的蛋白 °vw已从大豆k Γλψχινε
µαξl种子油体中分离得到 o并且克隆了编码该蛋白的基因 o核酸序列比对表明这种蛋白类似木瓜蛋白酶家
族中的硫基蛋白酶k‹ µ¨°¤±ot|{z ~ ‹ µ¨°¤± ετ αλqot||s ~„±§µ½¨ ­ ετ αλqot||sl ∀
图 t 油体
ƒ¬ªqt ’¬¯ ¥²§¼
图 u 油体蛋白 ≥⁄≥2°„Š∞图谱
ƒ¬ªqu ≥⁄≥2°„Š∞ ²©³µ²·¨¬±¶¬¶²¯¤·¨§©µ²° ϑq χυρχασ
¶¨ §¨²¬¯ ¥²§¬¨¶
  } ²¯ ¦¨∏¯¤µ°¤¶¶q下同 ∀ ׫¨ ¶¤°¨¥¨ ²¯º q
212 油体蛋白 2 ∆2ΠΑΓΕ分离
利用双向电泳技术 o进一步分析小桐子种子油体蛋白质组二维表达谱 ∀首先用等电点为 w ∗ z的预制胶
条分离小桐子种子油体中的酸性蛋白 oŒ°¤ª¨ ¤¶·¨µ× u⁄ °¯¤·¬±∏°软件扫描分析共得到 zw个可重复的蛋白点
k图 vl ∀其中 o表达最丰富的 y个蛋白点的表达量占酸性蛋白的 ws h以上 ∀再用等电点为 y ∗ tt的预制胶
条分离小桐子种子油体中的碱性蛋白 o经 Œ°¤ª¨ ¤¶·¨µ× u⁄ °¯¤·¬±∏°软件扫描分析共得到 z|个可重复的蛋白
点k图 wl o其中 tu个蛋白点与图 v中重复 ∀表达最丰富的 y个碱性蛋白点占碱性蛋白总量一半以上 ∀
v 结论与讨论
本研究首次从重要的能源植物小桐子种子中分离油体和提取油体蛋白 o并用电泳技术得到油体蛋白质
组单向和双向电泳表达谱 ∀≥⁄≥2°„Š∞结果显示 o小桐子种子油体中包含油质蛋白的 u种异构体 o分子量分
别约为 us ®∏和 uw ®∏o后者的表达量约为前者的 u倍 ∀作为油体最主要的相关蛋白 o可以推测从油体的发生
到分解消失过程中油质蛋白起着重要的生物学作用 ∀当种子萌发需要动员贮藏在油体内的脂类时 o油质蛋
白可能作为脂酶与油体结合的识别信号 o也可能是脂酶的活化剂 o促进油体解体k‹∏¤±ªot||u ~×½¨ ± ετ αλqo
t||z ~׫²°³¶²± ετ αλqot||{ ~∏µ³«¼ ετ αλqot|||l ∀在种子干化过程及储藏时 o油质蛋白对稳定油体有十分重
要的作用k×½¨ ± ετ αλqot||u ~ ∏µ³«¼ ετ αλqot|||l o油质蛋白的数量直接影响油体的大小 o从而影响油体的稳
定性k•²§µ¬ª² ετ αλqoussyl ∀
进一步采用双向电泳的方法从小桐子种子油体中分离到 zw个酸性蛋白和 yz个碱性蛋白 o共 twt个蛋
白点 o等电点分布在 x ∗ ts之间 ∀由于油质蛋白在油体蛋白中含量丰富 o且分子量为 tx ∗ uy ®∏o因此推测图
|v 第 {期 刘玉君等 }小桐子种子油体蛋白的提取及其电泳分析
图 v 小桐子种子油体蛋白双向电泳分析
ƒ¬ªqv „±¤¯¼¶¬¶²©³µ²·¨¬±¶¬¶²¯¤·¨§©µ²° ϑq χυρχασ ¶¨ §¨²¬¯ ¥²§¬¨¶¥¼ u⁄2°„Š∞
蛋白通过线性的 Œ°Š预制胶条k³‹w ∗ zl分离 o分子量标注于图上 ∀
°µ²·¨¬±¶º µ¨¨ ¤±¤¯¼½¨ §∏¶¬±ª ¬¯±¨ ¤µŒ°Š ¶·µ¬³¶º¬·«³‹ µ¤±ª¨ ©µ²° w·²z ³Œ¤±§°²¯ ¦¨∏¯¤µ°¤¶¶k¬± ®∏l ¤µ¨ ±²·¨§q
图 w 小桐子种子油体蛋白双向电泳分析
ƒ¬ªqw „±¤¯¼¶¬¶²©³µ²·¨¬±¶¬¶²¯¤·¨§©µ²° ϑq χυρχασ ¶¨ §¨²¬¯ ¥²§¬¨¶¥¼ u⁄2°„Š∞
蛋白通过线性的 Œ°Š预制胶条k³‹y ∗ ttl分离 o分子量标注于图上 ∀
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sw 林 业 科 学 ww卷
v !图 w中含量最丰富的蛋白点有可能为油质蛋白 ∀分析得知小桐子种子油体蛋白还具有如下特点 }tl酸性
和碱性蛋白种类相当 o但碱性蛋白表达量更丰富 ~ul以低分子量蛋白为主 o蛋白点集中在 vx ®∏以下 ∀
比较 ≥⁄≥2°„Š∞与 u⁄2°„Š∞的结果 o可以看到 o≥⁄≥2°„Š∞仅能将油体蛋白粗略分为 {条带 o定性地反映
油体蛋白分子量的组成情况 ∀而 u⁄2°„Š∞可以根据分子量和等电点的不同将其分离 o清晰地呈现在二维凝
胶上 o再利用凝胶成像软件分析每个蛋白点的表达量 o提供更大量的信息 o成为小桐子种子油体蛋白的指纹
图谱 ∀因此 o双向电泳具有更强大的分离分析蛋白质的能力 ∀
要找到小桐子种子油体中参与油脂储存及利用的关键蛋白 o需要对分离得到的蛋白作进一步的质谱鉴
定来筛选出有意义的蛋白 o如参与油脂生物合成的关键酶 o在动员利用油脂过程中起作用的蛋白等 ∀找到编
码这些蛋白的基因 o就能在分子水平上深入研究 o改良小桐子种子品质 o使之更适于大规模产业化生产 ∀
参 考 文 献
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„®¬±·¤¼² ∞ × qussw q≤«¤µ¤¦·¨µ¬¶·¬¦¶¤±§¦²°³²¶¬·¬²± ²© Παρκια βιγλοββοσσα ¤±§ ϑατροπηα χυρχασ ²¬¯¶¤±§¦¤®¨ ¶q…¬²µ¨¶²∏µ× ¦¨«±²¯ o|u }vsz p vts q
„±§µ½¨ ­Žo• ¬¨¶¨ °¤±±o…¨ ±­¤°¬± ƒ  oετ αλqt||s q ²¯ ¦¨∏¯¤µ¦¯²±¬±ª²©¤³µ²·¨¬± ¤¶¶²¦¬¤·¨§º¬·«¶²¼¥¨¤± ¶¨ §¨²¬¯ ¥²§¬¨¶·«¤·¬¶¶¬°¬¯¤µ·²·«¬²¯ ³µ²·¨¤¶¨¶²©·«¨
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k责任编辑 徐 红l
tw 第 {期 刘玉君等 }小桐子种子油体蛋白的提取及其电泳分析