全 文 ：第 wv卷 第 tu期
u s s z年 tu 月
林 业 科 学
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∂²¯1wv o‘²1tu
⁄¨ ¦qou s s z
几种森林大型真菌纯培养菌种的 • „°⁄
及 Œ×≥分子标记鉴定 3
李海波t 吴学谦t ou 魏海龙t ou 付立忠t ou 吴庆其t ou
kt1浙江省林业科学研究院 杭州 vtssuv ~u1 浙江益圣菌物发展有限公司 丽水 vuvsssl
摘 要 } 以采自野外的 w对外生菌根菌和 t对木腐菌的子实体及其各自的组织分离菌株作为研究材料 o运用
• „°⁄分子标记来分析组织分离菌株与子实体间的亲缘关系 o通过 °≤• 产物克隆测序比较二者的 Œ×≥碱基序列差
异 o最终对组织分离菌株是否为其纯培养菌种作出判定 ∀ • „°⁄分析结果表明 o彩色豆马勃 !白乳菇以及缘盖牛肝
菌的子实体及其组织分离菌株分别在 s1|w| !s1|xv以及 s1|y|的 ∆ιχε相似系数水平上聚为一类 o而正红菇 !香杯伞
的子实体及其分离菌株仅在 s1sw和 s1s{的 ∆ιχε相似系数水平上聚为一类 ∀Œ×≥序列测定分析结果显示 o彩色豆马
勃 !白乳菇以及缘盖牛肝菌子实体与其各自组织分离菌株的 Œ×≥片段在长度和碱基序列上完全一致 o而正红菇 !香
杯伞子实体与其各自分离菌株具有数量和长度均不同的 Œ×≥片段 ∀ • „°⁄分析结果与 Œ×≥分析结果相互支持 o表明
彩色豆马勃 !白乳菇以及缘盖牛肝菌的组织分离菌株为其纯培养菌种 o而正红菇 !香杯伞的组织分离菌株并非其纯
培养菌种 o• „°⁄和 Œ×≥二种分子标记的结合运用可以更加高效准确地鉴定出外生菌根菌组织分离菌株是否为其纯
培养菌种 ∀Œ×≥分析结果还提示正红菇 !香杯伞子实体内可能存在多种伴生菌 ∀
关键词 } 大型真菌 ~外生菌根菌 ~纯培养菌种 ~亲菌鉴定 ~Œ×≥ ~ • „°⁄
中图分类号 }≥zt{1{t 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kusszltu p ss|w p sz
收稿日期 }ussy p sy p tw ∀
基金项目 }浙江省重点攻关项目kussw≤uusvu !ussyƒttssvl及浙江省自然科学基金项目k≠vswwsvl ∀
3 吴学谦为通讯作者 ∀浙江林学院与浙江省林业科学研究院联合培养的硕士研究生童敏 !魏锦瑜参加了部分研究工作 o特此致谢 ∀
Ιδεντιφιχατιον οφ Πυρε Χυλτυρεφορ Μαχροφυνγι ωιτη ΡΑΠ∆ ανδ ΙΤΣ Μολεχυλαρ Μαρκερσ
¬‹¤¬¥²t • ∏÷∏¨ ¬´¤±tou • ¬¨‹¤¬¯²±ªt ƒ∏¬½«²±ªtou • ∏±¬±ª´¬tou
kt1 Ζηεϕιανγ Φορεστρψ Αχαδεµψ Ηανγζηου vtssuv ~u1 Λισηυι Εδιβλε Φυνγαλ Ρεασεαρχη ανδ ∆εϖελοπµεντ Χεντερ Λισηυι vuvsssl
Αβστραχτ } x ³¤¬µ¶¤°³¯ ¶¨o¬±¦¯∏§¬±ªw ¦¨·²°¼¦²µµ«¬½¤¯ °∏¶«µ²²°¶¤±§·«¨¬µ¬¶²¯¤·¨¶©µ²°·¬¶¶∏¨ ¬¶²¯¤·¬²±ot ¶¤³µ²·µ²³«¬¦©∏±ª¬
©µ∏¬·¬¥²§¼ ¤±§¬·¶¬¶²¯¤·¨©µ²°·¬¶¶∏¨ ¬¶²¯¤·¬²±oº«¬¦« º¨ µ¨ ¦²¯¯¨ ¦·¨§¬± ¬¶«∏¬¤µ¨¤o¬± «¨­¬¤±ª°µ²√¬±¦¨ o º¨ µ¨ ¶¨¯¨ ¦·¨§¬±·«¬¶
¶·∏§¼qײ §¨·¨µ°¬±¨ º«¨¤·«¨µ·«¨ ¬¶²¯¤·¨¶©µ²°·¬¶¶∏¨ ¬¶²¯¤·¬²± º¨ µ¨ ·«¨¬µ²º± ³∏µ¨ ¦∏¯·∏µ¨¶²µ±²·o• „°⁄ °²¯ ¦¨∏¯¤µ°¤µ®¨µº¤¶
∏¶¨§·²¤±¤¯¼¶¨ ·«¨ ª¨ ±¨ ·¬¦µ¨ ¤¯·¬²±¶«¬³¶¤°²±ªx ©∏¬·¬¥²§¬¨¶¤±§·«¨¬µ²º±¬¶²¯¤·¨¶o¤±§·«¨ §¬©©¨µ¨±¦¨¶²©·«¨ ¶¨ ∏´¨±¦¨¶²©Œ×≥
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µ¨√¨ ¤¯ §¨·«¤··«¨ ©∏¬·¬¥²§¬¨¶ ¤±§ ·«¨¬µ ¦²µµ¨¶³²±§¬±ª ¬¶²¯¤·¨¶ ²© Πισολιτηυσ τινχτοριυσo Λαχταριυσ πιπερατυσ ¤±§ Βολετυσ
αππενδιχυλατυ󦤱 ¥¨ ¦¯∏¶·¨µ¨§¬±·²²±¨ ªµ²∏³¤··«¨ ¶¬°¬¯¤µ¬·¼¦²¨©©¬¦¬¨±·¯ √¨¨ ¯²©s1|w| os1|xv ¤±§s1|y| µ¨¶³¨¦·¬√¨ ¼¯ o¥∏·©²µ
Ρυσσυλα ϖινοσα ¤±§ Χλιτοχψβε οδοραo·«¨¼ º¨ µ¨ ¦¯∏¶·¨µ¨§¬±·²²±¨ ªµ²∏³²±¯¼ ¤··«¨ ¶¬°¬¯¤µ¬·¼¦²¨©©¬¦¬¨±·¯ √¨¨ ¯²©s1sw ¤±§s1s{
µ¨¶³¨¦·¬√¨ ¼¯q׫¨ ¶¨ ∏´¨±¦¨ ¦²°³¤µ¬±ª²©Œ×≥ µ¨√¨ ¤¯ §¨·«¤··«¨ ©∏¬·¬¥²§¬¨¶¤±§·«¨¬µ¦²µµ¨¶³²±§¬±ª¬¶²¯¤·¨¶²© Πq τινχτοριυσo Λq
πιπερατυ󤱧 Βq αππενδιχυλατυ󶫤µ¨§·«¨ ¶¤°¨ ¶¬½¨ ¤±§¦²°³¯ ·¨¯¨¼ «²°²¯²ª²∏¶¶¨ ∏´¨±¦¨ µ¨¶³¨¦·¬√¨ ¼¯ o¥∏·©²µΡ qϖινοσᤱ§
Χq οδοραo·«¨¼ º¨ µ¨ µ¨°¤µ®¤¥¯¼ §¬©©¨µ¨±·±²·²±¯¼ ¤··«¨ ¶¬½¨ ¥∏·¤¯¶²¤··«¨ ±∏°¥¨µ¶²©·«¨ Œ×≥ ¥¤±§¤°²±ª·«¨ ©∏¬·¬¥²§¬¨¶¤±§
·«¨¬µ¦²µµ¨¶³²±§¬±ª¬¶²¯¤·¨q׫¨ µ¨¶∏¯·¶²© • „°⁄¤±¤¯¼¶¬¶o¶∏³³²µ·¨§¥¼·«¨ µ¨¶∏¯·¶²©Œ×≥ ¤±¤¯¼¶¬¶o¬±§¬¦¤·¨¶·«¤··«¨ ¬¶²¯¤·¨¶²©
Πq τινχτοριυσo Λq πιπερατυ󤱧 Βq αππενδιχυλατυσ º¨ µ¨ ·«¨ ³∏µ¨ ¦∏¯·∏µ¨¶²©·«¨¬µ©∏¬·¬¥²§¬¨¶µ¨¶³¨¦·¬√¨ ¼¯ o¥∏·¬·¬¶±²··µ∏¨ ©²µ
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¬¯√¨ §¬±·«¨ ©∏¬·¬¥²§¬¨¶²© Ρ qϖινοσα ¤±§ Χq οδοραqŒ± ¦²±¦¯∏¶¬²±o·«¨ ³µ¨¶¨±·¶·∏§¼¶∏ªª¨¶·¶·«¤·• „°⁄o¦²°¥¬±¨ §º¬·«Œ×≥
¤±¤¯¼¶¬¶¦²∏¯§¥¨ ∏¶¨§·²¬§¨±·¬©¼·«¨ ³∏µ¨ ¦∏¯·∏µ¨¶²© ¦¨·²°¼¦²µµ«¬½¤¯ ©∏±ª¬°²µ¨ ©¨©¨¦·¬√¨ ¼¯ ¤±§¤¦¦∏µ¤·¨¯¼q
Κεψ ωορδσ} °¤¦µ²©∏±ª¬~ ¦¨·²°¼¦²µµ«¬½¤¯ ©∏±ª¬~³∏µ¨ ¦∏¯·∏µ¨ ~⁄‘„ ¬§¨±·¬©¬¦¤·¬²±~Œ×≥ ~ • „°⁄
外生菌根k∞¦·²°¼¦²µµ«¬½¤¨ l是外生菌根真菌k ¦¨·²°¼¦²µµ«¬½¤¯ ©∏±ª¬o∞≤ƒl与植物根部之间形成的具有特
定形态结构和功能的一种共生体 ∀据统计 o高等真菌有 ts目 !vs科 !{t属 !xvx种可与 u{s种树木形成外生
菌根k于富强等 oussul ∀外生菌根的形成不仅可以提高寄主植物对矿质元素 o特别是磷和其他微量元素的吸
收功能 o还具有提高植物抗逆能力 !苗木生长量和造林成活率的作用k花晓梅 ousstl ∀外生菌根菌不仅是形
成菌根的菌种资源 o也是食用菌中的重要资源 ∀在我国已知的 xss余种食用菌中 o可形成外生菌根的有 vxu
种k卯晓岚 ot|{{l ∀许多珍稀 !名贵的食用菌如鸡油菌k Χαντηαρελλυσ χιβαριυσl !松乳菇k Λαχταριυσ δελιχιοσυσl !黑
孢块菌k Τυβερ µελανοσπορυµl !松口蘑k Τριχηολοµα µατσυτακεl !美味牛肝菌k Βολετυσ εδυλισl等均属外生菌根菌 ∀
外生菌根菌长期以来一直是根据子实体的形态解剖特征来进行菌种的分类鉴定k黄亦存等 ot||ul ∀但
对于一些不产生子实体或尚未找到子实体的外生菌根菌则无法进行 ∀此外 o象木腐菌一样采用经典的柯赫
法则kŽ²¦«. ¶°²¶·∏¯¤·¨l 对外生菌根菌纯培养菌种进行真伪鉴定 o回接试验的执行难度很大 ∀因此 o对外生菌
根菌及其纯培养的分类鉴定需借助现代分子生物学的技术手段 o即开展 ⁄‘„亲菌鉴定 ∀
与真菌表型特征相比 o遗传物质 ⁄‘„实际上更能客观和真实地反映其系统发育特性和亲缘关系 o且不
受环境条件变化的影响 o在菌种鉴定和系统分类上同样可作为重要的依据 ∀建立在 °≤• 基础上的 • „°⁄分
子标记以其对模板 ⁄‘„的用量及纯度要求不高 !操作简单 !经济快捷等优点在大型真菌尤其是食药用菌的
分类鉴定 !种质资源评估以及遗传多样性和亲缘关系分析上得到了较为广泛的应用k李继东等 oussul ∀利用
• „°⁄指纹技术对外生菌根菌组织分离菌株进行亲菌鉴定在鳞盖红菇k Ρυσσυλα ¶³ql !点柄乳牛肝菌k Συιλλυσ
γρανυλατυσl !细裂硬皮马勃kΣχλεροδερµα αρεολατυµl和大红菇k Ρυσσυλα ρυβραl上有报道k孙文波等 ousss ~曾东方
等 ousstl ∀Œ×≥kµ⁄‘„内转录间隔区 o¬±·¨µ±¤¯ ·µ¤±¶¦µ¬¥¨§¶³¤¦¨µl是核糖体 ⁄‘„中的非编码转录间隔区 oŒ×≥作
为分子标记主要是通过 ⁄‘„序列测定和 °≤•2• ƒ°分析的方法用于属内种间或种内群体的系统学研究 ∀根
据文献报道 oŒ×≥ 已成功用于对松茸k Τριχηολοµα µατσυτακεl !正红菇k Ρυσσυλα ϖινοσl !松乳菇 !致命鹅膏菌
kΑµανιτα εξιτιαλισl !乳牛肝菌k Συιλλυσ βοϖινυσl等外生菌根菌纯培养菌种的鉴定k沙涛等 oussw ~王桂文等 o
ussw ~熊涛等 oussy ~«¤±ª等 oussx ~佟丽华等 oussxl ∀
在前期的资源调查中 o笔者共采集到了 v{种源自浙江丽水地区的外生菌根菌子实体 o并明确了其主要
的共生树种k李海波等 oussxl ∀其中 o彩色豆马勃k Πισολιτηυστινχτοριυσl 和缘盖牛肝菌k Βολετυσ αππενδιχυλατυσl
主要与马尾松k Πινυσ µασσονιαναl !黄山松k Πq ταιωανενσισl和赤松k Πq δενσιφλοραl等松属树种共生 ~正红菇
k Ρυσσυλα ϖινοσαl主要与甜楮k Χαστανοπσισ εψρειl !栲属k Χαστανοπσισl等壳斗科树种共生 o也可与红椎k Χαστανοπσισ
ηψστριξl形成外生菌根 ~白乳菇kΛαχταριυσ πιπερατυσl可与蒙古栎k Θυερχυσ µονγολιχυσl等栎属k Θυερχυσl树种形成
外生菌根 ∀本文即以上述 w种外生菌根菌子实体及其组织分离菌株和 t对木腐菌香杯伞k Χλιτοχψβε οδοραl的
子实体及其组织分离菌株作为研究材料 o采用 • „°⁄结合 Œ×≥ u种 ⁄‘„分子标记对子实体及其组织分离菌
株的基因组 ⁄‘„进行比较分析 o通过 • „°⁄分子数据统计 !聚类分析明确分离菌株与其对应子实体间的亲
缘关系 o通过Œ×≥测序比较二者的µ⁄‘„ Œ×≥区段的碱基序列 o以最终明确子实体组织分离菌株是否为其纯培
养菌种 ∀
t 材料与方法
111 试验材料
t1t1t 子实体及分离菌株 有 w对外生菌根菌 !t对木腐菌子实体及其分离菌株 o分离菌株为当日采集的子
实体组织分离培养物k表 tl ∀组织分离及培养采用  ‘培养基k赵志鹏等 ot|{|l ∀
表 1 大型真菌子实体及其分离菌株的来源及编号 ≠
Ταβ .1 Ρεσουρχε ανδ νυµ βερσ οφ τηε µιχρο2φυνγι φρυιτβοδψ ανδ τηειρ ισολατεσ
菌株 ≥·µ¤¬± 彩色豆马勃
f
Πq τινχτοριυσ
正红菇 f
Ρ qϖινοσα
香杯伞
Χq οδορα
白乳菇 f
Λq πιπερατυσ
缘盖牛肝菌 f
Β qαππενδιχυλατυσ
子实体来源
ƒµ∏¬·¥²§¼ µ¨¶²∏µ¦¨
百果园
…¤¬ª∏²¼∏¤±
百山祖
…¤¬¶«¤±½∏
大洋林场
⁄¤¼¤±ªƒ²µ¨¶·ƒ¤µ°
大洋林场
⁄¤¼¤±ªƒ²µ¨¶·ƒ¤µ°
庆元举水
∏¶«∏¬o ±¬±ª¼∏¤±
子实体编号 ƒµ∏¬·¥²§¼ ‘²q °· ©vt ©ux ©w{ ©¥
分离菌株编号 Œ¶²¯¤·¨ ‘²q °t °u °v °w °¥
≠ f }外生菌根菌 ∞¦·²°¼¦²µµ«¬½¤¯ ©∏±ª¬o∞≤ ƒ
t1t1u 主要试剂及引物 °≤• 扩增所用试剂 !⁄‘„纯化试剂盒和 ⁄‘„凝胶回收试剂盒均购自杭州博日科
技有限公司 ∀ • „°⁄分析所用的 ts碱基 ≥系列随机引物和 µ⁄‘„ Œ×≥分析所用的 Œ×≥xЌ×≥w 引物k • «¬·¨ ετ
x| 第 tu期 李海波等 }几种森林大型真菌纯培养菌种的 • „°⁄及 Œ×≥分子标记鉴定
¤¯ qot||sl 购自上海生工公司 ∀
112 试验方法
t1u1t 子实体与菌丝体基因组 ⁄‘„的提取及检测 子实体的菌盖部分k含菌褶l来提取基因组 ⁄‘„ ~组织
分离菌株先从  ‘培养基试管斜面转接到  ‘培养基平皿培养 o待菌丝长满平皿后 o刮取平皿上的菌丝
体来提取基因组 ⁄‘„ ∀基因组 ⁄‘„的提取参照曾大兴kussvl的 ≥⁄≥2≤ׄ…法 o并使用杭州博日公司的 ⁄‘„
纯化试剂盒对提取的 ⁄‘„ 进行纯化 ∀纯化的基因组 ⁄‘„ 先用 t1x h的琼脂糖凝胶电泳定性检测 o再用
⁄‘„Π• ‘„紫外分光光度计kŠ¨ ±¨ ±∏¤±·°µ²oŠ∞ ‹ ¤¨¯·«¦¤µ¨公司l定量检测 ∀
t1u1u • „°⁄2°≤• 分析 • „°⁄2°≤• 分析的扩增体系为 }ts ≅ °≤• …∏©©¨µu ˏots °°²¯ #pt §‘×°¶u ˏoux
°°²¯#pt ª≤¯ u u ˏox ˜#ˏpt פ´ ⁄‘„ 酶 s1v ˏos1u Λ°°²¯#pt随机引物 v ˏo模板 ⁄‘„ v ˏkxt ±ªl o
§§‹u ’ z1z ˏo反应总体积为 us ˏ∀扩增反应在杭州博日k…¬²¨µl公司的 ×≤2÷°型扩增仪上进行 o|w ε 预变
性 y °¬±后 o随即进入 |u ε 变性 ws ¶!v{ ε 退火 ws ¶!zu ε 延伸 u °¬±的循环 o共进行 vs个循环 o最后于 zu ε
补平 z °¬±o终止温度为 w ε ∀以 x对供试材料中的子实体 ⁄‘„作为模板 o通过对随机挑选的 tyx个随机引
物进行 • „°⁄分析 o从中筛选出了 |y个对供试材料的 ⁄‘„能进行有效扩增且稳定性较好的随机引物k表 ul
用于进一步分析 ∀
表 2 随机引物编号及核苷酸序列(5χ ψ 3χ)
Ταβ .2 Χοµ µερχιαλ νυµ βερσ ανδ νυχλεοτιδε σεθυενχεσ οφ ρανδοµ πριµερσ
编号
°µ²§∏¦·‘²q
核苷酸序列
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编号
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核苷酸序列
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核苷酸序列
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编号
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核苷酸序列
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t1u1v µ⁄‘„ Œ×≥分析 Œ×≥2°≤• 的扩增体系为 }ts ≅ °≤• …∏©©¨µu1x ˏots °°²¯#pt §‘×°¶u ˏoux °°²¯#pt
ª≤¯ u u ˏox ˜#ˏpt פ´ ⁄‘„ 酶 s1v ˏots Λ°²¯ #pt Œ×≥xЌ×≥w 引物各 t ˏotz ±ª#ˏpt模板 ⁄‘„ v ˏo
§§‹u ’tw1u ˏo反应总体积为 ux ˏ∀扩增反应在杭州博日公司的 ×≤2÷°型扩增仪上进行 o|w ε 预变性 t °¬±
后 ~|u ε 变性 tx ¶oyt ε 退火 tx ¶ozu ε 延伸 t °¬±o共 vs个循环 ~最后于 zu ε 补平 x °¬±o终止温度为w ε ∀
t1u1w °≤• 产物的检测 !扩增图谱的摄取和片段长度估算 采用 t1x h的琼脂糖凝胶电泳检测 • „°⁄2°≤•
和Œ×≥2°≤• 扩增产物 o采用上海培清科技有限公司的 ≥2v{s„ 自动凝胶图像分析仪摄取扩增图谱 o采用
±∏¤±·¬·¼ ’±¨ t2⁄ „±¤¯¼¶¬¶≥²©·º¤µ¨k∂ µ¨¶¬²± w1w o美国 …¬²2•¤§公司l估算扩增产物中的片段长度 ∀
t1u1x µ⁄‘„ Œ×≥片段的回收 !克隆及测序 采用杭州博日k…¬²¨µl公司的 …¬²¶³¬±凝胶回收 Ž¬·o从 t1x h的琼
y| 林 业 科 学 wv卷
脂糖凝胶中回收鹅膏菌的 Œ×≥片段 o并用 Š¨ ±¨ ±∏¤±·°µ² ⁄‘„Π• ‘„紫外分光光度计kŠ¨ ±¨ ±∏¤±·°µ²o英国 Š∞
‹ ¤¨¯·«¦¤µ¨公司l检测浓度 ∀回收产物用大连宝生物工程公司的 ³⁄2t{× ∂ ¦¨·²µ连接 o转化于大肠杆菌k Ε q
χολιl⁄‹ xΑ菌株感受态细胞 o经蓝白斑筛选和 °≤• 鉴定后 o每个样品均随机挑选 v个阳性单克隆交付大连宝
生物工程公司完成测序 ∀
113 数据统计与分析方法
将子实体与分离菌株的 • „°⁄2°≤• 图谱中相对分子质量不同的 ⁄‘„条带作为多态性状 o有性状记为 t o
无性状记为 s o转换为数字矩阵 ∀用 ‘×≥≠≥³¦u1ts¨版软件包k∞¬¨·¨µ≥²©·º¤µ¨ }≥¨ ·¤∏®¨·o‘≠ o˜≥„l中的 ≥¬° ∏´¤¯
程序计算子实体与对应分离菌株间的 ⁄¬¦¨ 相似系数 o˜°Š„法聚类分析 o构建亲缘关系树状图 ∀
u 结果与分析
211 子实体及其分离菌株的 ΡΑΠ∆多态性分析
用筛选出的 |y个随机引物对 x对供试材料进行 • „°⁄多态性分析 ∀结果显示 o同一引物对 x对供试材
料以及不同引物对同一对供试材料的扩增效果均存在显著的不同 o所产生的 ⁄‘„片段数目 !⁄‘„片段大小
以及多态性也不尽相同k图 tl ∀统计和片段大小测定表明 }每一引物对每对供试材料扩增的条带数介于 t ∗
ut条 o一般为 x ∗ tx条 o⁄‘„片段的大小介于 s1u ∗ v1t ®¥o|y个引物对 x对供试材料扩增所产生的 ⁄‘„片
段均在 uss条以上 ∀ • „°⁄扩增所产生的多态片段数量在 x对供试材料间的差异极其显著 o最低的有 t条 o
最高的达到 tx条 ∀所有这些数据用于对 x对供试材料进行相似性分析 o构建亲缘关系树状图 ∀
图 t 子实体及其组织分离菌株的 • „°⁄2°≤• 图谱
ƒ¬ªqt • „°⁄¤°³¯¬©¬¦¤·¬²± ³¤·¨µ±¶²©·«¨ ©µ∏¬·¥²§¼ ¤±§·«¨¬µ·¬¶¶∏¨ ¬¶²¯¤·¨¶
 qtss¥³ ⁄‘„ ¤¯§§¨µq下同 ׫¨ ¶¤°¨ ¤¶¥¨ ²¯º ~泳道上方代表子实体及其组织分离菌株 ’±·²³²© ¤¯±¨ ¶¬¶·«¨ ©µ∏¬·¥²§¼ ¤±§·«¨¬µ·¬¶¶∏¨ ¬¶²¯¤·¨¶~
泳道下方的 ≥数值为随机引物编号 Œ±·«¨ ¥²·²° ²© ¤¯±¨ ¶o·«¨ ±∏°¥¨µ²©µ¤±§²° ³µ¬° µ¨¶º µ¨¨ ¬±§¬¦¤·¨§q
212 遗传相似系数的估算和聚类分析
依照 t1v的方法 o将对 x对供试材料分析获得的 • „°⁄2°≤• 图谱转换为数字矩阵 o应用 ‘×≥≠≥³¦u1ts¨版
软件包中的 ≥¬° ∏´¤¯ 程序计算子实体与对应分离菌株间的 ⁄¬¦¨ 相似系数 o用 ˜°Š„法进行聚类分析 o生成
供试子实体与其分离菌株的亲缘关系树状图k图 ul ∀结果显示 o彩色豆马勃子实体及其分离菌株k°·2°tl !白
乳菇子实体及其分离菌株k©w{2°wl以及缘盖牛肝菌子实体及其分离菌株k©¥2°¥l分别在 s1|w| !s1|xv以及
s1|y|的 ⁄¬¦¨ 相似系数水平上聚为一类 o而正红菇子实体及其分离菌株k©vt2°ul和香杯伞子实体及其分离菌
株k©ux2°vl仅在 s1sw和 s1s{的 ⁄¬¦¨ 相似系数水平上才聚为一类 ∀
213 供试子实体及其分离菌株的 ρ∆ΝΑ ΙΤΣ区段分析
x对供试材料的 Œ×≥2°≤• 扩增结果k图 vl显示彩色豆马勃 !白乳菇以及缘盖牛肝菌子实体及其分离菌株
z| 第 tu期 李海波等 }几种森林大型真菌纯培养菌种的 • „°⁄及 Œ×≥分子标记鉴定
图 u 菌株间 ⁄¬¦¨ 系数 ˜°Š „聚类法产生的聚类图
ƒ¬ªqu ⁄¨ ±§µ²ªµ¤° µ¨¶∏¯·¬±ª©µ²° ˜°Š „ ¦¯∏¶·¨µ¤±¤¯¼¶¬¶¥¤¶¨§²± ⁄¬¦¨ ¦²¨©©¬¦¬¨±·
图 v 子实体及其分离菌株的 Œ×≥2°≤• 图谱
ƒ¬ªqv Œ×≥ ¤°³¯¬©¬¦¤·¬²± ³¤·¨µ±¶²©·«¨
©µ∏¬·¥²§¼ ¤±§·«¨¬µ¬¶²¯¤·¨¶
k°·2°t !ƒw{2°w !©¥2°¥l彼此的 Œ×≥片段长度基本一致 o均介
于 zss ∗ {xs ¥³∀而正红菇子实体及其分离菌株k©vt2°ul各
有 v个和 t个长度不同 Œ×≥片段 o香杯伞子实体及其分离菌
株©ux2°v也各有 v个和 t个 Œ×≥片段 o且彼此片段的长度
均不一致 ∀
进一步对 °·2°t !©w{2°w及 ©¥2°¥v对供试材料的各 v
个Œ×≥区段阳性单克隆进行测序 o并对测序结果进行修正
分析 o得出二者的 Œ×≥序列 ∀序列比较显示 ov个子实体与
其各自的组织分离菌株不仅 Œ×≥序列长度相同 o而且碱基
排列完全一致 ∀其中 °·2°t为 zs| ¥³o©w{2°w为 zvu ¥³o©¥2
°¥为 {ts ¥³k图 wl o这一结果再次表明彩色豆马勃 !白乳菇
以及缘盖牛肝菌的 v个组织分离菌株皆为其各自的纯培养菌种 ∀
v 讨 论
tl真菌个体不同组织的 ⁄‘„应该是均一性的 o子实体组织与其组织分离的菌丝体是 t个无性克隆系的
的 u种不同表达形态 o应该具有完全相同的 ⁄‘„组成 ∀这是本研究利用 ⁄‘„分子标记对子实体组织分离
菌株进行/亲菌鉴定0的理论基础 ∀
• „°⁄k • ¬¯¯¬¤° ετ αλqot||s ~ • ¨¯¶« ετ αλqot||sl是一种能快速 !简便而且准确地检测基因组 ⁄‘„多态性
的分子标记 ∀通过选取足够多的随机引物对整个基因组进行地毯式的多态分析 o理论上可揭示出 u个基因
组间的微小差异 ∀引物越多 o基因组 ⁄‘„ 上被检测到的多态结合位点则越多 o结果越真实可信k鲁亮等 o
t||xl ∀通过优化 • „°⁄2°≤• 反应体系 o本研究共筛选了 |y个对供试材料的 ⁄‘„能进行有效扩增且稳定性
较好的随机引物 ∀利用这些引物 o对 w个外生菌根菌 !t个腐生菌子实体与其对应的组织分离菌株的基因组
⁄‘„进行 • „°⁄指纹分析比较 ∀分析结果显示 o在所有筛选的随机引物中 o彩色豆马勃 !白乳菇和缘盖牛肝
菌的子实体及其分离菌株彼此的 • „°⁄指纹图谱极其相似 o且皆在较高的 ⁄¬¦¨ 相似系数ks1|w| !s1|xv !
s1|y|l水平上聚为一类 o表明这 v个子实体与其各自的组织分离菌株应该皆为同 t个种 ~相反 o在所有筛选
的随机引物中 o正红菇和香杯伞的子实体及其分离菌株彼此的 • „°⁄指纹图谱几乎完全不同 o且皆在极低的
{| 林 业 科 学 wv卷
图 w 子实体及其组织分离菌株的 Œ×≥序列图
ƒ¬ªqw Œ×≥ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨¶²©·«¨ ©µ∏¬·¥²§¼ ¤±§¬·¶¬¶²¯¤·¨
两端阴影部分为 Œ×≥引物序列 ׫¨ ¶«¤§²º §¨³¤µ·²±·«¨ ¥²·« ±¨§¶²©¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ¬¶·«¨ Œ×≥ ³µ¬° µ¨¶¨ ∏´¨ ±¦¨ q
⁄¬¦¨ 相似系数ks1sw !s1s{l水平上才聚为一类 o表明这 u个子实体与其各自的组织分离菌株并非同一个种 ∀
根据 • „°⁄指纹图谱比较分析 o本研究得出彩色豆马勃 !白乳菇和缘盖牛肝菌的子实体及其分离菌株的
⁄¬¦¨ 相似系数分别为 s1|w| !s1|xv !s1|y| o贺冬梅等kt||zl利用 • „°⁄研究香菇不同部位子实体组织分离物
与菌丝体的遗传相关性 o得出二者的 ⁄¬¦¨ 相似系数为 s1{{u !s1|zt o相似系数均没有达到理论上 t1s的水平 ∀
这表明尽管组织分离是一种无性繁殖技术 o遗传变异小 o但在无性繁殖过程中可能产生某些自然变异和突
变 o变异是绝对的 o稳定是相对的 ∀另外不容忽视的因素是 o尽管 • „°⁄标记具有经济 !快捷 !操作简单的优
点 o但 • „°⁄同时也具有重复性和稳定性差的缺陷 o也可能造成在扩增条带的判读上出现一定的偏差 o进而
导致相似系数偏低 ∀
ul 真菌核糖体 ⁄‘„kµ⁄‘„l的 Œ×≥区为高度可变区 o进化速率较快且长度适中 o在绝大多数真菌的属间
和种间表现出了极为广泛的序列多态性 ∀因而 Œ×≥序列的 °≤• 扩增及 • ƒ°分析一直被用于真菌的分类鉴
定及系统发育关系研究k•²¼¶¨ ετ αλqot||x ~…∏±¼¤µ§ ετ αλqot||yl ∀为了进一步验证 • „°⁄分子标记对 x对
供试材料的鉴定结果 o笔者又对 x对供试材料进行了µ⁄‘„ Œ×≥分析 ∀分析结果显示 o彩色豆马勃子实体及
其分离菌株 !白乳菇子实体及其分离菌株以及缘盖牛肝菌子实体及其分离菌株不仅 Œ×≥序列长度相同 o而且
碱基排列完全一致 o这一结果再次表明 v个组织分离菌株应该皆为其纯培养菌种 ∀相反 o正红菇和香杯伞子
|| 第 tu期 李海波等 }几种森林大型真菌纯培养菌种的 • „°⁄及 Œ×≥分子标记鉴定
实体与其各自的组织分离菌株具有完全不同的 Œ×≥片段扩增图谱 o体现在二者的 Œ×≥片段数量和大小皆不
同 o提示正红菇和香杯伞子实体中可能包含了至少三种/伴生0的微生物 o而分离菌株则是另外一种微生物 ∀
x对供试材料的µ⁄‘„ Œ×≥序列分析结果不仅与 • „°⁄分析得出的结论相互支持 o而且补充解释了正红
菇和香杯伞 u对材料彼此的 • „°⁄指纹图谱几乎完全不同的机理在于其子实体中可能存在多种/伴生0的微
生物 o子实体的 ⁄‘„模板实际上一个多种微生物的混合 ⁄‘„ 模板 o而分离菌株则是另外一种微生物的菌
株 ∀可见 o对外生菌根菌子实体组织分离菌株的准确鉴定 oŒ×≥和 • „°⁄二种分子标记的结合运用是一种高
效可行的方法 ∀
vl 研究表明 o外生菌根菌鸡油菌k Χαντηαρελλυσ χιβαριυσlk辛智海 ot||{l !腐生菌羊肚菌k Μορχηελλα ¶³qlk廖
志勇等 oussvl的子实体中皆有多种伴生细菌或真菌共存 ∀银耳k Τρεµελλα φυχιφορµισl的生长发育需要香灰菌
的伴生k汪国莲等 ousssl o猪苓k Γριφολα υµβελλατεl菌核的形成和持续生长发育离不开伴生菌和蜜环菌k邢晓科
等 oussvl o研究还发现干巴菌k Τηελεπηορα γανβαϕυl的子实体中至少包含了毛霉 !赤霉 !交链孢霉等 us余种真
菌k杨大智等 ot||zl ∀这些伴生细菌或真菌的重要性显而易见 o因此势必要借助 ⁄‘„分子标记首先搞清伴
生菌的数目 !种类 !归属 !伴生菌与宿主以及多种伴生菌间的亲缘关系 o进而才有可能对它们在外生菌根菌的
菌根化甚至子实体形成中的具体作用进行深入研究 ∀邢晓科等kusswl从 Œ×≥序列探讨猪苓与其伴生菌的亲
缘关系 o发现猪苓与其伴生菌的 Œ×≥序列同源性达 ||1vy h ∀本研究结果也提示了 Œ×≥分子标记可以用来对
外生菌根菌子实体中存在的伴生菌数目作出初步的评价 o但要明确伴生菌的种类 !归属甚至亲缘关系 o尚需
要做大量的研究工作 o这将成为今后研究工作中一个新的方向 ∀
参 考 文 献
贺冬梅 o陈明杰 o汪昭月 o等 qt||z1香菇子实体组织分离物与菌丝体的遗传相关性 q上海农业学报 otvkwl }{x p {{
花晓梅 qusst1林木菌根生物工程 q世界林业研究 otwktl }uu p u|
黄亦存 o沈崇尧 o裘维蕃 qt||u1 外生菌根的形态学 !解剖学及分类学研究进展 q真菌学报 ottkvl }ty| p t{t
李海波 o吴学谦 o魏海龙 o等 qussx1 浙江丽水地区外生菌根菌资源调查初报 q中国食用菌 ouwkxl }ts p tw
李继东 o林跃鑫 qussu1 • „°⁄技术在我国食用菌研究中的应用 q中国食用菌 outkyl }y p {
廖志勇 o苟才明 曾先富 o等 qussv1 羊肚菌的人工驯化栽培研究初报 q阿坝科技 otkztl }v| p ws
鲁 亮 o归 鸿 qt||x1 • „°⁄技术的特点及其在昆虫分类中的应用 q昆虫学报 ov{ktl }ttz p tuu
卯晓岚 qt|{{1 中国野生食用真菌种类及生态习性 q真菌学报 ozktl }vy p wv
沙 涛 o丁骅孙 o张汉波 o等 qussw1 利用松茸 Œ×≥特异性引物对松茸分离物进行鉴定 q云南植物研究 ouykxl }xuw p xu{
孙文波 o李海鹰 o王桂文 o等 qusss1 应用 • „°⁄鉴定红菇组织分离菌株的探索试验 q广西科学 ozkvl }uuu p uuw
佟丽华 o连 宾 qussx1 一株食用外生菌根菌乳牛肝菌的分子鉴定 q食品科学 ouyk{l }vt{ p vus
汪国莲 o陈立国 o陈 明 qusss1 银耳菌丝体生长营养条件的初步研究 q中国食用菌 ouskwl }tu p tw
王桂文 o孙文波 qussw1 广西红菇子实体及分离株的µ⁄‘„ Œ×≥序列分析 q广西科学 ottkvl }uyt p uyx
辛智海 qt||{1鸡油菌及其伴生细菌的组织分离 q山地农业生物学报 otzkul }|u p |x
邢晓科 o郭顺星 qussv1 猪苓 !伴生菌及蜜环菌共培养的形态学研究 q菌物系统 ouukwl }yxv p yys
邢晓科 o郭顺星 qussw1 从 Œ×≥序列探讨猪苓与其伴生菌的亲缘关系 q微生物学通报 ovtkul }vw p vy
熊 涛 o肖 满 o曾哲灵 o等 qussy1 松乳菇组织分离菌株的µ⁄‘„ Œ×≥序列分子鉴定 q微生物学通报 ovvkwl }t p w
杨大智 o朱启顺 o杨正斌 o等 qt||z1 干巴菌子实体内伴生真菌的研究 q中国食用菌 otykul }{ p |
于富强 o刘培贵 qussu1 外生菌根研究及应用的回顾与展望 q生态学报 ouuktul }uutz p uuuy
曾东方 o罗信昌 qusst1 应用 • „°⁄分析快速鉴定外生菌根蘑菇分离物的真伪 q林业科学 ovzkyl }x| p yx
赵志鹏 o郭秀珍 qt|{|1 外生菌根真菌纯培养的生态学研究 q林业科学研究 oukul }tvy p twt
曾大兴 qussv1 适于 • „°⁄分析的真菌 ⁄‘„提取方法 q生物技术 otvkul }us p ut
…∏±¼¤µ§… „ o≤«¤¬¦«∏¦«²·¨ ≥ o‘¬¦«²Œ¶²±  ≥ o ετ αλ1 t||y1 •¬¥²¶²°¤¯ ⁄‘„ ¤±¤¯¼¶¬¶©²µµ¨¶²¯∏·¬²± ²©ª¨ ±²·¼³¬¦¦¯¤¶¶¨¶²© Πλευροτυσq ¼¦²¯ • ¶¨otsskul }twv
p txs
•²¼¶¨ ⁄o‘¬¦«²¯¶²±  ≥ o…∏±¼¤µ§… „ o ετ αλqt||x1 •¬¥²¶²°¤¯ ⁄‘„ ©²µ°²¯ ¦¨∏¯¤µ¶¼¶·¨°¤·¬¦¶¤±§ª¨ ±¨ ·¬¦¤±¤¯¼¶¬¶²©³²³∏¯¤·¬²±¶²© §¨¬¥¯¨©∏±ª¬Μ∏² ÷ ≤ o
¤±ª  q׫¨ …¬²¯²ª¼ ¤±§× ¦¨«±²¯²ª¼ ²© Λεντινυλα ∏¶«µ²²° q …¨ ¬­¬±ª}≤«¬±¤ „ªµ¬¦∏¯·∏µ¤¯ ≥¦¬¨±·¨¦«°µ¨¶¶otut p tuz
• ¨¯¶«o ¦≤¯¨ ¯¯¤±§  qt||s1 ƒ¬±ª¨µ³µ¬±·¬±ªª¨ ±²°¨ ¶∏¶¬±ª°≤• º¬·«¤µ¥¬·µ¤µ¼ ³µ¬° µ¨¶q‘∏¦¯ „¦¬§¶• ¶¨ot{ }zutv p zut{
• «¬·¨ × o…µ∏±¶× ⁄o¨¨≥ oפ¼¯²µ • ot||s1 „°³¯¬©¬¦¤·¬²±¤±§§¬µ¨¦·¶¨ ∏´¨ ±¦¬±ª²©©∏±ª¤¯ µ¬¥²¶²°¤¯ • ‘„ ª¨ ±¨ ¶©²µ³«¼¯²ª¨ ±¨ ·¬¦¶ΜŒ±±¬¶ „ oŠ¨ ©¯¤±§‹ o
≥±¬±¶®¼ ≥ o ετ αλq°≤• °µ²·²¦²¯¶} „ Š∏¬§¨ ·²  ·¨«²§¶¤±§ „³³¯¬¦¤·¬²±¶q ‘¨º ≠²µ®}„¦¤§¨ °¬¦°µ¨¶¶ovtx p vuu
• ¬¯¯¬¤° Š Žo‹¤±¤©¨ ¼  Žo •∏¥¨ ¬¯® „ • o ετ αλqt||s1 ⁄‘„ ³²¯¼°²µ³«¬¶°¶¤°³¯¬©¬¨§¥¼ ¤µ¥¬·µ¤µ¼ ³µ¬°¨ µ¶¤µ¨ ∏¶¨©∏¯ ¤¶ª¨ ±¨ ·¬¦°¤µ®¨µ¶q‘∏¦¯ „¦¬§¶• ¶¨o
t{ }yuvt p yuvx
«¤±ª° o≤«¨ ±  ‹ o‹∏≥ o ετ αλ1 ussx1 °µ²§∏¦·¬²±¤±§¦«¤µ¤¦·¨µ¬½¤·¬²±²©„°¤±¬·¬±·²¬¬±¶©µ²° ¤³∏µ¨ ¦∏¯·∏µ¨ ²© Αµανιτα εξιτιαλισqƒ∞≥ ¬¦µ²¥¬²¯ ¨·ouxu
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k责任编辑 朱乾坤l
sst 林 业 科 学 wv卷