全 文 ：第 ww卷 第 |期
u s s {年 | 月
林 业 科 学
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松树脂溃疡病菌及其近缘种 „ƒ°分析 3
廖太林t ou 叶建仁t 陈建东v
kt1 南京林业大学 南京 utssvz ~u1江苏昆山出入境检验检疫局 昆山 utxvst ~
v1 江苏出入境检验检疫局 南京 utsss|l
摘 要 } 利用 „ƒ°分子标记技术对松树脂溃疡病菌及其近缘种进行 ⁄‘„ 指纹分析 o筛选出 ts对多态性较高的
引物 ∀上述引物在供试的 |种 tz个菌株中共扩增出 u|{ 条带 o其中有多态性带 u{v 条 o多态性位点百分率为
|w1|z h ∀每对引物产生的多态性位点百分率在 {|1u| h ∗ tss h 之间 o表明松树脂溃疡病菌及其近缘种间在 ⁄‘„
水平上存在广泛变异 ∀根据 „ƒ°标记结果计算松树脂溃疡病菌及其近缘种间的相似系数 o对它们的亲缘关系进
行定量描述 ∀聚类分析结果表明 o菌株间的聚类与生物学种分类的结果一致 ∀分析引物 ∞2„×А2≤„„绘制的镰刀
菌 „ƒ°指纹图谱遗传多样性 o确定李瑟组镰刀菌各交配群的特异带 !差异带 o区分供试的 z个交配群 ∀
关键词 } 松树脂溃疡病菌 ~ „ƒ° ~亲缘关系 ~鉴定
中图分类号 }≥zyv1tt 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kuss{ls| p ss{u p sx
收稿日期 }ussz p ts p s{ ∀
基金项目 }国家质检总局科技资助项目kusswŒŽszxl ∀
3 叶建仁为通讯作者 ∀感谢复旦大学胡小华博士 !浙江林学院林新春副教授在实验中提供的支持和帮助 ∀
ΑΦΛΠ Αναλψσισ οφ Φυσαριυµ χιρχινατυµ ανδ Ρελατιϖε Σπεχιεσ
¬¤² פ¬¯¬±tou ≠¨¬¤±µ¨±t ≤«¨ ± ¬¤±§²±ªv
kt1 Νανϕινγ Φορεστρψ Υνιϖερσιτψ Νανϕινγ utssvz ~u1 Κυνσηαν Εξιτ2ΕντρψΙνσπεχτιον ανδ Θυαραντινε Βυρεαυ οφ Χηινα Κυνσηαν utxvst ~
v1 ϑιανγσυ Εξιτ2ΕντρψΙνσπεχτιον ανδ Θυαραντινε Βυρεαυ οφ Χηινα Νανϕινγ utsss|l
Αβστραχτ } „ƒ°©¬±ª¨µ³µ¬±·¬±ª¤±¤¯¼¶¬¶²© Φυσαριυµ χιρχινατυµ ‘¬µ¨±¥¨µª¤±§’. ⁄²±±¨ ¯¯ ¤±§µ¨ ¤¯·¬√¨ ¶³¨¦¬¨¶º¤¶¦¤µµ¬¨§²∏·q
× ±¨ ³µ¬°¨ µ2³¤µ¬¶·«¤·¦²∏¯§ª¨ ±¨ µ¤·¨§¤¥∏±§¤±·³²¯¼°²µ³«¬¶°©µ¤ª°¨ ±·¶º¨ µ¨ ¶¦µ¨ ±¨¨ §²∏·qײ·¤¯ u|{ ±∏¦¯¨ ²·¬§¨ ¤¦¬§©µ¤ª°¨ ±·¶
º¨ µ¨ ¤°³¯¬©¬¨§ º¬·«·«¨ ³µ¬°¨ µ¶©µ²° ·«¨ ·¨°³¯¤·¨ ²©·«¨ ¶¨√¨ ±·¨¨ ± ¶·µ¤¬±¶²© Φυσαριυµ ¶³³qo ⁄‘„ ¤±§ ¤°²±ª2·«¨ ° u{v
©µ¤ª°¨ ±·¶¤°²±ª º¨ µ¨ ³²¯¼°²µ³«¬¦q °¨ µ¦¨±·¤ª¨ ²© ³²¯¼°²µ³«¬¶° ©µ¤ª°¨ ±·¶³µ²§∏¦¨§¥¼ ¤¨¦« ³¤¬µ²© „ƒ° ³µ¬°¨ µ³¤¬µº¤¶
|w1|z h ¬± ¤√¨ µ¤ª¨ o¤±§√¤µ¬¨§©µ²° {|1u| h ∗ tss h q „¯¯·«¨¶¨ §¤·¤¬±§¬¦¤·¨§·«¤·¦²±¶¬§¨µ¤¥¯¨ ª¨ ±¨·¬¦√¤µ¬¤·¬²± ¬¨¬¶·¨§
¤°²±ª Φqχιρχινατυµ ¤±§µ¨ ¤¯·¬√¨ ¶³¨¦¬¨¶¤·⁄‘„ ¯¨ √¨ ¯q²¯ ¦¨∏¯¤µª¨ ±¨·¬¦§¬¶·¤±¦¨¶¤°²±ª Φυσαριυµ ¶³³qº¨ µ¨ ¦¤¯¦∏¯¤·¨§o¤±§
·«¨ µ¨ ¤¯·¬²±¶«¬³¤°²±ª·«¨ ° º¤¶§¨¶¦µ¬¥¨§ ∏´¤±·¬·¤·¬√¨ ¼¯q≤²°³¤µ¨§º¬·«¥¬²¯²ª¬¦¤¯ ¶³¨¦¬¨¶q׫¨ µ¨¶∏¯·²©¦¯∏¶·¨µ¤±¤¯¼¶¬¶º¨ µ¨
¥¤¶¬¦¤¯ ¼¯ ¶¬°¬¯¤µ·²·«¨ ³«¨ ±²·¼³¬¦¦¯¤¶¶¬©¬¦¤·¬²± ²©¶³¨¦¬¨¶q„±¤¯¼¶¬¶²©ª¨ ±¨·¬¦§¬√¨ µ¶¬·¼ ²©∞2„×А2≤„„ „ƒ°©¬±ª¨µ³µ¬±·¬±ª²©
Φυσαριυµ ¶³³q§¨·²µ°¬±¨ §o∏±¬´∏¨ ¤±§§¬©©¨µ¨±·¥¤±§¶©²µ ¤¨¦«¶³¨¦¬¨¶¤±§¤¯¯ Φυσαριυµ ¶¨¦·¬²± Λισεολα·¨¶·¨§º¨ µ¨ ¬§¨±·¬©¬¨§
¥¤¶¨§²±·«¨ ∞2„×А2≤„„ „ƒ°©¬±ª¨µ³µ¬±·¬±ªq
Κεψ ωορδσ} Φυσαριυµ χιρχινατυµ ~„ƒ°~ª¨ ±¨·¬¦µ¨ ¤¯·¬²±¶«¬³~¬§¨±·¬©¬¦¤·¬²±
松树脂溃疡病菌k Φυσαριυµ χιρχινατυµl为农业部公布进境检疫性有害生物名单中新增加的病原真菌 o该
病菌 t|wy年于美国北卡罗莱那州矮松k Πινυσϖιργινιαναl上首次发现k‹ ³¨·¬±ª ετ αλqot|wyl ∀近年来 o松树脂
溃疡病菌在世界各地呈现迅速蔓延之势 ot|{|年日本 !t||t年墨西哥 !t||w年南非 !usst年智利等地相继发
现k廖太林等 ousszl ∀以美国南方种子园内湿地松k Πq ελλιοττιιl !加利福尼亚州辐射松k Πq ραδιαταl !加州沼
松k Πq µυριχαταl !瘤果松k Πqαττενυαταl以及南非展叶松k Πq πατυλαl上为害最为严重 o引起树干流脂溃疡 !雌
花和球果坏死 !种子变质以及苗木枯死k∂¬¯­²¨ ± ετ αλqot||w ~Š²µ§²± ετ αλqousst ~廖太林等 ousswl ∀
因该菌培养过程不产生厚垣孢子和链状小型分生孢子 o松树脂溃疡病菌最早被认为是砖红镰刀菌k Φq
λατεριτιυµlk≥±¼§¨µετ αλqot|w|l ∀随着 …²²·«引入瓶梗作为镰刀菌重要分类特征 o因可产生单瓶梗和复瓶梗
其又被认为是串珠镰刀菌胶孢变种k Φq µονιλιφορµε √¤µq συβγλυτινανσlkŽ∏«¯°¤± ετ αλqot|z{l ∀通过对胶孢镰
刀菌k Φq συβγλυτινανσl松树与其他寄主上分离物致病性研究表明 o松树上分离物间明显具有寄主专化性 ~
°·⁄‘„的 • ƒ°研究也表明 o松树脂溃疡病菌为胶孢镰刀菌在松树上的一个专化型 o即胶孢镰刀菌松树专化
型k Φq συβγλυτινανσ©q¶³q πινιlk≤²µµ¨¯¯ ετ αλqot||tl ∀ ‘¬µ¨±¥¨µª等kt||{l综合镰刀菌形态和分子生物学等方
面的研究 o认为松树脂溃疡病菌为单独的一个种 o并将其命名为 Φυσαριυµ χιρχινατυµ ∀松树脂溃疡病菌为李
瑟组镰刀菌k Φυσαριυµ σεχτιονl的一个种 o其有性阶段为 Γιββερελλα φυϕικυροι k¶¤º¤§¤l Œ·² i Ž¬°∏µ¤中的交配群 ‹
k≥·¨¨ ±®¤°³ ετ αλqot|||l ∀除上述交配群k生物学种l外 oΓ q φυϕικυροι至少还包括另外 z个在遗传上完全不同
的交配群 o分别以 „ !… !≤ !⁄!∞ !ƒ !Š命名k…µ¬·½ ετ αλqot|||l ∀本文应用 „ƒ°标志技术对松树脂溃疡病菌及
其近缘种多态性进行分析 o试图能找出交配群 ‹与其他交配群间亲缘关系 o确定区分不同交配群的特异带
和差异带 o为松树脂溃疡病菌分类鉴定提供理论基础 ∀
t 材料与方法
111 供试菌株
松树脂溃疡病菌由美国应用农业研究中心k‘˜„≤• l提供 o李瑟组镰刀菌交配群 „ !… !≤ !⁄!∞ !ƒ及其他
对照菌株由南京农业大学植物病理教研组k‘„˜l提供k表 tl ∀
表 1 供试菌株及来源
Ταβ .1 Στραινστεστεδ ανδ τηειρ οριγινσ
交配群类型
¤·¬±ª·¼³¨
菌种
’µª¤±¬¶°
菌株编号
‘²q²©¶·µ¤¬±¶
寄主
‹²¶·
来源
• ¶¨²∏µ¦¨
‹ Φυσαριυµ χιρχινατυµ ‘ƒ˜‹2t Πινυσ χαριβαεα ‘≤„˜• k‘²µ·« ≤¤µ²¯¬±¤o˜≥„l
‹ Φq χιρχινατυµ ‘ƒ˜‹2u Πqλυχηεενσισ ‘≤„˜• k¤³¤±l
‹ Φq χιρχινατυµ ‘ƒ˜‹2v Πq ραδιατα ‘≤„˜• kŠ¨ ²µª¬¤o˜≥„l
‹ Φq χιρχινατυµ ‘ƒ˜‹2w Πq πατυλα ‘≤„˜• k≥²∏·« „©µ¬¦¤l
„ Φq µονιλιφορµε ‘„˜„2t ‘„˜
„ Φq µονιλιφορµε ‘„˜„2u ‘„˜
… Φq συβγλυτινανσ ‘„˜…2t ‘„˜
≤ Φq µονιλιφορµε ‘„˜≤2t ‘„˜
≤ Φqµονιλιφορµε ‘„˜≤2u ‘„˜
⁄ Φq προλιφερατυµ ‘„˜⁄2t ‘„˜
⁄ Φq προλιφερατυµ ‘„˜⁄2u ‘„˜
∞ Φq συβγλυτινανσ ‘„˜∞2t ‘„˜
∞ Φq συβγλυτινανσ ‘„˜∞2u ‘„˜
∞ Φq συβγλυτινανσ ‘„˜∞2v ‘„˜
ƒ Φqµονιλιφορµε ‘„˜ƒ2t ‘„˜
) Φq γραµινεαρυµ ‘„˜Š ‘„˜
) Φq σολανι ‘„˜≥ ‘„˜
112 试验方法
t1u1t 菌株培养和菌丝体收
集 同廖太林等kusszl的方
法 ∀
t1u1u 菌丝体基因组 ⁄‘„ 的
抽提 参照 „∏¶∏¥¨¯等kt||{l
的 ≤ׄ…法 ∀
t1u1v 模板 ⁄‘„ 浓度及纯度
检测 取 ts ˏ⁄‘„溶液 o用 t
≅ ×∞k³‹{1sl稀释至 u °o在
紫外分光光度计上测定波长
uys ±°和 u{s ±°的光吸收值
k’⁄值l o根据公式 }样品 ⁄‘„
浓度k±ª#ˏptl € xs ≅ ’⁄uys ≅
稀释倍数 o计算样品 ⁄‘„的浓
度 ∀根据 ’⁄uysΠ’⁄u{s的比值判
断 ⁄‘„的纯度 ∀
t1u1w „ƒ° 的分析 „ƒ°
分析过程基因组 ⁄‘„消化 !接
头连接 !预扩增以及选择性扩增程序按 „ƒ°试剂盒 µ操作说明进行 ∀试剂盒由美国 Œ±√¬·µ²ª¨±公司生产 ∀
t1u1x 电泳 选择性扩增产物经变性后在变性聚丙烯酰胺序列分析胶上电泳分离 o条件是 xx ε ot uss ∂ o
tss • o约 w1x «∀电泳后采用 ׬¬¬¨µ等kt||zl的银染检测方法进行 „ƒ°指纹显色反应 ∀
t1u1y 结果记录 数据以如下方式记录 }有带的记为/ t0 o无带的记为/ s0 o数据缺失或条带模糊的记为/ u0 ∀
113 数据统计分析
参照周延清kussxl方法进行数据统计分析 ∀多态性 }多态性k h l €扩增多态性片段数Π总扩增片段数 ≅
tss h € k Νι n Νϕ p u ΝιϕlΠk Νι n Νϕ p Νιϕl o式中 oΝιϕ代表样本 ι和ϕ的公共条带 oΝι !Νϕ分别是样本 ι !ϕ的带数 ∀
相似系数 }采用简单匹配系数k Σ¶°l计算相似系数 o其计算公式为 Σ¶° € k Νιϕ n ΝslΠk Νι n Νϕ n Νιϕ n Νsl o式
中 oΝι !Νϕ !Νιϕ同上 oΝs 代表样本 ι和ϕ均无的带 ∀聚类分析 }利用 ‘×≥≠≥³¦分析软件 o采用非加权配对算术
平均法k˜°Š„l进行聚类 ∀
u 结果与分析
211 多态性引物的筛选
从试剂盒中提供的 yw对引物对 o筛选到 ts对在镰刀菌中有较高多态性的引物组合k表 ul o其扩增的谱
v{ 第 |期 廖太林等 }松树脂溃疡病菌及其近缘种 „ƒ°分析
带在凝胶上均匀分布 o且各条带之间的亮度相当 ∀
表 2 适合于镰刀菌属 ΑΦΛΠ分析的引物组合
Ταβ .2 Σχρεενεδ πριµερ παιρσσυιταβλεφορ ΑΦΛΠ αναλψσισιν Φυσαριυµ
引物
°µ¬°¨ µ 2≤„„ 2≤„≤ 2≤„Š 2≤„× 2≤ׄ 2≤×≤ 2≤׊ 2≤××
∞2„„ n n n
∞2„≤ n
∞2„Š n
∞2„× n
∞2ׄ n n
∞2×≤
∞2׊ n n
∞2××
212 ΑΦΛΠ多态性分析
用 ts对 „ƒ°引物组
合对供试样品进行分析 o
共检测到了 u|{个标记 o
其中多态性标记 u{v 个 o
多态位点的百分率为
|w1|z h ~每对引物组合
产生的多态性标记数量不
等 o最少的是检测到 uw条
谱带 o最多的是检测到 vv
条谱带 o平均每对引物组
合扩增出 u{1v条谱带 o多态性位点的百分率在 {|1u| h ∗ tss h之间k表 vl ∀引物组合 ∞2×ŠΠ2≤ׄ和 ∞2׊Π
2≤×≤对每个镰刀菌菌株扩增产生的标记位点见图 t ∀
表 3 不同引物组合在 ΑΦΛΠ分析中的效果
Ταβ .3 Τηε εφφεχτ οφ διφφερεντ πριµερ χοµ βινατιονσ ον ΑΦΛΠ αναλψσισ
引物组合
°µ¬° µ¨
¦²°¥¬±¤·¬²±
扩增带数
‘∏°¥¨µ²©
¥¤±§¶
多态性带数
‘∏°¥¨µ²©
³²¯¼°²µ³«¬¦¥¤±§¶
多态性带百分率
°¨ µ¦¨±·²©
³²¯¼°²µ³«¬¦ ²¯¦¬Πh
∞2„„А2≤„„ vu vt |y1{{
∞2„„А2≤„≤ u| uy {|1yy
∞2„„А2≤×≤ u| u{ |y1xx
∞2„≤А2≤×× u{ u{ tss
∞2„ŠΠ2≤׊ vw vv |z1sy
∞2„×А2≤„„ vt u| |v1xx
∞2×„Π2≤„„ uy uw |u1vt
∞2×„Π2≤„× u{ ux {|1u|
∞2×ŠΠ2≤ׄ vs u| |y1yz
∞2×ŠΠ2≤×≤ vt vs |y1zz
213 镰刀菌属种及种内遗传变异
根据 ts对引物扩增结果 o计算供
试菌株间相似系数 ∀由此数据计算得
到各李瑟组镰刀菌种间以及松树脂溃
疡病菌种群间相似系数变幅及其均
值 ∀菌株之间的相似系数为 s1wzz t
∗ s1|{w z o平均相似系数为 s1yuw u ~
李瑟组镰刀菌株之间的相似系数为
s1xus { ∗ s1|{w z o均值为 s1ywy z ∀种
内种群间的相似系数较大 o如交配群
„的 u个种群的相似系数为 s1|{w z o
交配群 ≤ 的 u个种群的相似系数为
s1|{s w o交配群 ⁄的 u个种群的相似系数为 s1|wz | o交配群 ∞的 v个种群的相似系数变幅为 s1{|| y ∗ s1|yt
x o交配群 ‹的 w个种群的相似系数变幅为 s1z|z u ∗ s1|su w ∀
214 聚类分析
用各菌株间的遗传相似系数 o采用非加权配对算术平均法k˜°Š„l进行聚类分析k图 ul o结果 tz个供
试菌株在遗传相似性系数 s1x{处可将李瑟组镰刀菌与 Φq γραµινεαρυµ !Φq σολανι进行区分 o李瑟组镰刀菌
各交配型间的遗传相似性较高 ∀在遗传相似性系数 s1yx处可将李瑟组镰刀菌划分 v个遗传相似组 o其中交
配群 „和 …为一组 o交配群 ≤ !⁄和 ƒ为一组 o交配群 ∞和 ‹为一组 ∀在遗传相似性系数 s1z|处可进一步对
李瑟组镰刀菌不同交配型完全分开 o上述菌株间的聚类分析结果与生物学种的分类结果一致 ∀
215 差异带鉴定
在应用引物 ∞2„×А2≤„„构建的李瑟组镰刀菌 „ƒ°指纹图谱中 o供试的交配群 „kvws ¥³l !交配群 ∞
kzss ¥³l !交配群 ‹kv{s ¥³l均有特异带 ∀其他供试的李瑟组镰刀菌可以采用二歧分类法确定各自在该 „ƒ°
图谱中的差异带 o根据各自的特异带或差异带可以将该组供试的李瑟组镰刀菌 z个交配群进行区分 ∀上述
条带一旦被确认为具有菌种的特异性 o即可通过特征指纹快速鉴定李瑟组镰刀菌 o从而大大提高鉴定效率 ∀
v 结论与讨论
利用 ts对 „ƒ°引物组合对李瑟组镰刀菌中的交配群 „ !… !≤ !⁄!∞ !ƒ !‹以及 Φq γραµινεαρυµ !Φqσολανι
等 |种 tz个菌株进行分析 o检测到的多态位点为 |w1|z h o表明供试菌株在分子水平存在广泛变异 ∀聚类分
析结果表明 o在李瑟组镰刀菌中交配群 ≤ !⁄以及 ƒ间亲缘关系较近 o交配群 ∞ !‹间亲缘关系较近 ∀该研究
结果与 ’. ⁄²±±¨ ¯¯ 等kt||{l以 Βp微管蛋白基因和线粒体 ⁄‘„碱基序列 !≥·¨¨ ±®¤°³等kt|||l以组蛋白 ‹v编
w{ 林 业 科 学 ww卷
图 t 引物组合 ∞2×ŠΠ2≤×≤k左l和 ∞2×ŠΠ2≤ׄk右l
扩增产生的标记位点
ƒ¬ªqt ¤µ®¨ µ¯ ²¦¬ª¨ ±¨ µ¤·¨§¥¼ „ƒ° ³µ¬° µ¨¶¦²°¥¬±¤·¬²± ²©
∞2×ŠΠ2≤×≤ k¯ ©¨·l ¤±§∞2×ŠΠ2≤ׄ kµ¬ª«·l
t1 ‘„˜„2t ou1 ‘„˜„2u ov1 ‘„˜…2t ow1 ‘„˜≤2t ox1 ‘„˜≤2u o
y1 ‘„˜⁄2t oz1 ‘„˜⁄2u o{1 ‘„˜∞2t o|1 ‘„˜∞2u ots1 ‘„˜∞2v o
tt1 ‘„˜ƒ2t otu1 ‘ƒ˜‹2t otv1 ‘ƒ˜‹2u otw1 ‘ƒ˜‹2v o
tx1 ‘ƒ˜‹2w ot1 ty1 ‘„˜Š otz1 ‘„˜≥ o q⁄t xss ¤µ®¨µ
图 u 镰刀菌属 t{个菌株系统聚类树形图
ƒ¬ªqu °«¼¯²ª¨ ±¨ ·¬¦·µ¨¨²© Φυσαριυµ στραινσ
码基因的碱基序列聚类分析结果一致 ∀由于交
配群 Γ在国内未见有发现的报道 ,而从国外引
进又极其困难 ,本研究的供试材料缺少交配群
Γ ,导致研究结果无法全面反映李瑟组镰刀菌各
种群间的亲缘关系 ∀
松树脂溃疡病菌早期被归为交配群 …o但从
本研究的 „ƒ°聚类分析结果来看 o交配群 … !‹
之间的遗传相似系数较小k  s1yslk≥º²©©²µ§o
t||{l ∀松树脂溃疡病菌在李瑟组镰刀菌中代
表一个独立的交配群 o该研究结果进一步证实
了 ’. ⁄²±±¨ ¯¯ 等kt||{l和 …µ¬·½等kt|||l人的研
究观点 ∀不同地理来源松树脂溃疡病菌 w个菌
株间遗传差异较大 o表明美国佐治亚州 !北卡罗
莱那州 !南非以及日本的松树脂溃疡病菌已形
成了相对独立的类群 ∀
分子标记技术作为菌种鉴定技术要应用于
生产实际 o必须满足重复性好 !分辨率高 !多态
性强以及效率高等要求 ∀本试验研究结果表
明 } „ƒ° 技术是稳定可靠的 o引物 ∞2„×А2
≤„„对松树脂溃疡病菌及其相关种进行分析 o
检出 vt个标记中多态性标记有 u|个 o被检测位
点中 |v1xx h位点种间存在差异 ∀构建的李瑟
组镰刀菌指纹图谱中 o交配群 „ !交配群 ∞ !交配
群 ‹均有特异带 o而其他供试李瑟组镰刀菌采
用二歧分类法可确定各自在该 „ƒ°图谱中的差异带 o根据各自的特异带或差异带可对相关菌种进行鉴定 ∀
x{ 第 |期 廖太林等 }松树脂溃疡病菌及其近缘种 „ƒ°分析
参 考 文 献
廖太林 o李百胜 o叶建仁 o等 qussw1 进境木质材料携带松树脂溃疡病的可能性及风险分析 q南京林业大学学报 }自然科学版 ou{kyl }ts p tw q
廖太林 o李百胜 o叶建仁 o等 qussz1 松树脂溃疡病菌的分子检测 q林业科学 owvktl }ttt p ttx q
周延清 qussx1 ⁄‘„分子标记技术在植物研究中的应用 q北京 }化学工业出版社 q
„∏¶∏¥¨¯ ƒ o…µ¨±·• oŽ¬±ª¶·²±¨ • ∞oετ αλqt||{1 精编分子生物学实验指南 q颜子颖 o王海林 o译 q北京 }科学出版社 q
…µ¬·½ ‹ × „ o≤²∏·¬±«²  o •¬±ª©¬¨ §¯ • ƒ ’ o ετ αλqt|||1 Φυσαριυµ συβγλυτινανσ©q¶³q πινι µ¨³µ¨¶¨±·¶¤§¬¶·¬±¦·°¤·¬±ª³²³∏¯¤·¬²±¬±·«¨ Γιββερελλαφυϕικυροι
¶³¨¦¬¨¶¦²°³¯ ¬¨q „³³¯¬¨§¤±§∞±√¬µ²° ±¨·¤¯ ¬¦µ²¥¬²¯²ª¼oyx }tt|{ p tust q
≤²µµ¨¯¯  ≤ oŠ²µ§²± × • o ¦≤¤¬± „ ‹ o ετ αλqt||t1 °¬·¦«¦¤±®¨µ§¬¶¨¤¶¨ ¬± ≤¤¯¬©²µ±¬¤}³¤·«²ª¨ ±¬¦¬·¼o§¬¶·µ¬¥∏·¬²± ¤±§¦¤±®¨µ§¨√¨¯²³°¨ ±·²± ²±·¨µ¨¼ ³¬±¨
k Πινυσραδιαταl q°¯ ¤±·§¬¶¨¤¶¨ ozx }yzy p y{u q
Š²µ§²± × • o≥·²µ¨µ„ o • ²²§⁄qusst1 ׫¨ °¬·¦« ≤¤±®¨µ∞³¬§¨ °¬¦¬± ≤¤¯¬©²µ±¬¤q°¯ ¤±·§¬¶¨¤¶¨ o{xkttl }ttu{ p ttv| q
‹ ³¨·¬±ª Š × o •²·« ∞ • qt|wy1 °¬·¦«¦¤±®¨µo¤ ±¨ º §¬¶¨¤¶¨ ²©¶²°¨¶²∏·«¨µ± ³¬±¨ q²∏µ±¤¯ ²©ƒ²µ¨¶·µ¼oww }zwu p zww q
Ž∏«¯°¤± ∞ Š o⁄º¬±¨ ¯¯ ⁄o ‘¨ ¶¯²± ° ∞o ετ αλqt|z{1 ≤«¤µ¤¦·¨µ¬½¤·¬²± ²©·«¨ Φυσαριυµ ¦¤∏¶¬±ª³¬·¦«¦¤±®¨µ²©¶²∏·«¨µ± ³¬±¨ ¶q ¼¦²¯²ª¬¤ozs }ttvt p ttwv q
‘¬µ¨±¥¨µª ‹ Œo’. ⁄²±±¨ ¯¯ Žqt||{1 ‘¨ º Φυσαριυµ ¶³¨¦¬¨¶¤±§¦²°¥¬±¤·¬²±¶º¬·«·«¨ Γιββερελλα φυϕικυροι ¶³¨¦¬¨¶¦²°³¯ ¬¨q ¼¦²¯²ª¬¤o|skvl }wvw p wx{ q
’. ⁄²±±¨ ¯¯ Ž∞o≤¬ª¨ ±¯¬® ∞o‘¬µ¨±¥¨µª ‹ Œqt||{1 ²¯ ¦¨∏¯¤µ¶¼¶·¨°¤·¬¦¶¤±§³«¼¯²ª¨²ªµ¤³«¼ ²©·«¨ Γιββερελλαφυϕικυροι ¶³¨¦¬¨¶¦²°³¯ ¬¨q ¼¦²¯²ª¬¤o|s }wyx p
w|v q
≥±¼§¨µ• ≤ oײ²¯¨ ∞ • o ‹ ³¨·¬±ª Š ‹ qt|w|1 ƒ∏¶¤µ¬¤¤¶¶²¦¬¤·¨§º¬·« °¬°²¶¤ º¬¯·o¶∏°¤¦º¬¯·o¤±§³¬±¨ ³¬·¦«¦¤±®¨µ²©¶²∏·«¨µ± ³¬±¨ q²∏µ±¤¯ ²©¤ªµ¬¦∏¯·∏µ¤¯
µ¨¶¨¤µ¦«oz{ }vyx p v{ q
≥·¨ ±¨®¤°³ ∞ × o •¬±ª©¬¨ §¯ … ⁄o≤²∏·¬±«² × „ o ετ αλqt|||1 ⁄¬©©¨µ¨±·¬¤·¬²± ²© Φυσαριυµ συβγλυτινανσ©q¶³q πινι ¥¼ ‹¬¶·²±¨ Š¨ ±¨ ≥¨´ ∏¨ ±¦¨ ⁄¤·¤q„³³¯¬¨§¤±§
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