全 文 ：第 wt卷 第 y期
u s s x年 tt 月
林 业 科 学
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疫木切面上松材线虫抗原的免疫学检测方法
白 钢t 李海燕u 马洪周t 王玉 u 杨文博t 张 奇t
kt1南开大学生命科学学院 天津 vssszt ~ u1 国家林业局森林病虫害防治总站 沈阳 ttssvwl
摘 要 } 利用抗松材线虫血清建立在疫木切面上直接进行免疫组化染色检测松材线虫抗原的方法 ∀ ∞Œ≥„和免
疫斑点印迹的结果表明 }该方法对松材线虫具有较好的特异性 o可以检测出木材表面 s1t Λª的线虫抗原 o显示了较
好灵敏度 ∀自然感染松材线虫的黑松疫木免疫组化的染色结果表明 }该方法可以清晰地检出管胞处松材线虫蛋白
抗原的存在 ∀
关键词 } 松材线虫 ~线虫分析 ~免疫组化 ~∞Œ≥„
中图分类号 }≥wvu1wn x 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kussxlsy p stst p sw
收稿日期 }ussv p tu p tu ∀
基金项目 }国家/十五0重点科技攻关子项目/林业重大病虫害预警及控制技术研究0中的专题 t ∀
Αν Ιµ µ υνοχψτοχηεµιχαλ Μετηοδ φορ Ιδεντιφιχατιον οφ Βυρσαπηελενχηυσ ξψλοπηιλυσ
Αντιγεν ον τηε Συρφαχε οφ Πινεωοοδ Σεχτιον
…¤¬Š¤±ªt ¬‹¤¬¼¤±u ¤ ‹²±ª½«²∏t • ¤±ª≠∏¼¤±u ≠¤±ª • ±¨¥²t «¤±ª ±¬t
kt1 Χολλεγε οφ Λιφε Σχιενχε o Νανκαι Υνιϖερσιτψ Τιανϕιν vssszt ~u1 ΓενεραλΣτατιον οφ Φορεστ Πεστ ΜαναγεµεντoΣτατε Φορεστρψ Αδµινιστρατιον Σηενψανγ ttssvwl
Αβστραχτ } ׫¨µ¨ ¤µ¨·«µ¨¨§¬©©¨µ¨±·√¬¨º¶µ¨ª¤µ§¬±ª³¤·«²ª¨±¬¦°¨ ¦«¤±¬¶°²©³¬±¨ º²²§±¨ °¤·²§¨ §¬¶¨¤¶¨ } ±¨½¼°¨ ¶o¦¤√¬·¤·¬²±o
·²¬¬±¶q²¶·¦²±¦¯∏¶¬²±¶¤µ¨ ¥¤¶¨§∏³²± ·«¨ ¦«¤±ª¨ ²©·«¨ °²µ³«²¯²ª¼ ²©¬±©¨¦·¨§ º²²§o¥∏·©¤¬¯ ¬± ¬¨³²∏±§¬±ª·«¨ ¬±·¨µ±¤¯
°¨ ¦«¤±¬¶° ²±·«¨ °²¯ ¦¨∏¯¤µ¯¨ √¨ ¯q „ ¬°°∏±²p¦¼·²¦«¨ °¬¦¤¯ °¨ ·«²§©²µ§¨·¨¦·¬±ª …÷ k Βυρσαπηελενχηυσ ξψλοπηιλυσl¤±·¬ª¨± ¬±
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¶³¨¦¬©¬¦·² ±¨ °¤·²§¨ ¤±·¬ª¨±·º²¶³¨¦¬¨¶²© Βυρσαπηελενχηυσ ª¨ ±∏¶o¤±§¦²∏¯§¬§¨±·¬©¼s1t Λª±¨ °¤·²§¨ ³µ²·¨¬±²±·«¨ ¶∏µ©¤¦¨ ²©
³¬±¨ º²²§¶¨¦·¬²±q •¬·«·«¬¶ °¨ ·«²§o¬·º¤¶§¨·¨¦·¨§·«¤··«¨ …÷ ¤±·¬ª¨± ¬± ·µ¤¦«¨¬§·¬¶¶∏¨ ²© Πινυσ τηυνβεργιι º«¬¦« º¨ µ¨
µ¨³µ¨¶¨±·¤·¬√¨ ²©¤±¤·∏µ¤¯ ¬±©¨¶·¤·¬²±q
Κεψ ωορδσ} Βυρσαπηελενχηυσ ξψλοπηιλυσ~±¨ °¤·²§¨ ¤±¤¯¼¶¬¶~¬°°∏±²¦¼·²¦«¨ °¬¶·µ¼~∞Œ≥„
松材线虫k Βυρσαπηελενχηυσ ξψλοπηιλυσl病是引起松树灾难性毁灭的重要林木检疫对象之一 ∀目前国内外
在致病机理研究方面 o多数局限在利用影响因子直接接触松树并致病后 o根据病木在形态学方面的变化间接
地分析松材线虫的致病机理 o可见松材线虫的致病机理实际尚未定论k朱克恭 ot||xl ∀ ’§¤±¬kt|{xl和
≠¤°¤°²·²kt|{yl分别对松材线虫体外分泌酶的致病性进行了研究 o认为松材线虫的纤维素酶使松树薄壁细
胞的细胞壁和细胞膜遭到破坏 o导致树脂不能正常地从树脂道中渗漏并扩散到相邻的管胞中 o使水分输导
受阻 o导致萎蔫 ∀ ¼¨ µ¶kt|{yl认为松树感染了松材线虫后 o木质部内挥发性萜烯类物质的含量增加 o这些物
质进入管胞在管胞中形成空洞 o致使水分输导受阻 ∀而 ’®∏kt||sl则认为松树感染松材线虫后 o体内产生有
毒物质 o这些毒素导致了松树的枯萎 ∀本研究利用免疫学手段 o以抗松材线虫血清直接在疫木切面上进行免
疫学染色 o建立疫木切面松材线虫抗原的检测方法 o为松材线虫的检疫以及松材线虫病的病理学研究提供更
直观的检测手段 ∀
t 材料与方法
111 材料
试剂 }弗氏佐剂kŠŒ…≤’ …• l ~辣根过氧化物酶k‹• °l标记羊抗兔 ŒªŠ ~邻苯二胺k’°⁄l ~v ovχ p二氨基联苯
胺k⁄„…l ~w p氯萘酚 ~羊血清及牛血清白蛋白k…≥„l均购于灏洋生物工程公司 o其他试剂均为分析纯 ∀
主要仪器 }酶标仪k…Œ’×∞≤‹ o∞÷{ssl ~冷冻干燥机k≤«µ¬¶·o„°‹„t p wl ~高速冷冻离心机k…¨ ¦®°¤±o
us• °xu⁄l ~∂⁄≥分析仪kŒ°¤ª¨ ¤¶·¨µ∂⁄≥ o°«¤µ°¤¦¬¤…¬²·¨¦«l o木材切片机k国产l ~超声波细胞粉碎仪k国产l ∀
112 抗线虫血清的制备
分别取贝尔曼漏斗法收集的松材线虫和拟松材线虫k Β qµυχρονατυσlktsw ∗ tsx 条l于 u °°…≥ ks1st °²¯
#pt磷酸缓冲液 os1t °²¯#pt ‘¤≤¯ o³‹ € z1ul中 o冰水浴 o超声波粉碎虫体kuss • ots °¬±l ∀w ε !v sss µ#
°¬±pt离心 ts °¬±o用 ²ºµ¼法检测上清液中蛋白含量k²ºµ¼ ετ αλqot|xtl o作为标准线虫蛋白抗原 ∀
取 t °ª#°pt松材线虫蛋白抗原 t °与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化后 o于家兔皮下进行多点注
射 ∀每隔 u周加强注射 t次 o定期测定抗血清效价 o待获得最高效价后 o收集血清 o灭活 o作为抗松材线虫血
清k„±·¬2…÷l op us ε 保存备用 ∀
113 抗血清的特异性分析(ΕΛΙΣΑ法)
分别取线虫蛋白抗原溶液于 s1sx °²¯#pt ‘¤‹≤’v 缓冲液k³‹ € |1yl中 o制成 ts Λª#°pt包被液 ∀取 tss
ˏ包被酶标板 o经封闭液ks1st °²¯#pt磷酸缓冲液 os1t °²¯#pt ‘¤≤¯ ots h羊血清 os1t h ‘¤‘v o³‹ € z1ul封
闭后 o加入以稀释液ks1st °²¯#pt磷酸缓冲液 os1st °²¯#pt ∞⁄ׄ os1t h …≥„ o³‹ € z1wlts sss倍稀释的
„±·¬2…÷ 血清 tss ˏo室温反应 v «∀用 uss ˏ°…≥×ks1st °²¯ #pt磷酸缓冲液 os1t °²¯ #pt ‘¤≤¯ os1t h
׺¨ ±¨us o³‹ € z1ul清洗 w次后 o再加入 u sss倍稀释的 ‹• °标记羊抗兔 ŒªŠ的酶标二抗 tss ˏo室温反应 t
«∀°…≥×清洗 w次后 o加入新配 ’°⁄底物溶液ks1x °ª#°pt邻苯二胺 os1stu h ‹u ’u os1t °²¯#pt柠檬酸缓冲
液 o³‹ € x1ultss ˏo反应 x °¬±后 o加入 t °²¯#pt ‹u≥’w xs ˏ终止反应 o于 w|s ±°处测定吸光度 ∀
114 木材表面线虫抗原的固定及封闭
表 1 ΕΛΙΣΑ法检测线虫蛋白抗原的交叉反应考察
Ταβ . 1 Τηε χροσσ ρεαχτιϖιτψ οφ νεµατοδε προτειν
δετερµινεδ βψ ΕΛΙΣΑ µετηοδ
线虫样品
‘¨ °¤·²§¨ ¶¤°³¯¨
采集地
∞³¬§¨ °¬¦¤µ¨¤¶
寄主
‹²¶·
’⁄w|s ±°吸光度
’⁄w|s ±° ¤¥¶²µ¥¨ ±¦¼
松材线虫
Β q ξψλοπηιλυσ
…÷t 浙江宁波‘¬±ª¥²o«¨­¬¤±ª
黑松
Πινυστηυνβεργιι s1wy|
…÷u 江苏南京‘¤±­¬±ªo¬¤±ª¶∏
黑松
Πq τηυνβεργιι s1wwu
…÷v 安徽巢湖≤«¤²«∏o„±«∏¬
马尾松
Πq µασσονιανα s1wsz
…÷w 江苏南京‘¤±­¬±ªo¬¤±ª¶∏
马尾松
Πq µασσονιανα s1xx|
拟松材线虫
Β q µυχρονατυσ
…t 安徽黄山‹∏¤±ª¶«¤±o„±«∏¬
马尾松
Πq µασσονιανα s1vx{
…u 浙江绍兴≥«¤²¬¬±ªo«¨­¬¤±ª
马尾松
Πq µασσονιανα s1ws|
…v 四川邻水¬±¶«∏¬o≥¬¦«∏¤±
马尾松
Πq µασσονιανα s1wys
…w 浙江绍兴≥«¤²¬¬±ªo«¨­¬¤±ª
马尾松
Πq µασσονιανα s1syx
双胃线虫
∆ιπλογαστερ¶³q
湖北孝感
÷¬¤²ª¤±o ‹∏¥¨¬
马尾松
Πq µασσονιανα s1sz|
湖南伞滑刃线虫
Β qηυνανενσισ
湖北孝感
÷¬¤²ª¤±o ‹∏¥¨¬
马尾松
Πq µασσονιανα s1s{u
取 s1x !s1ux !s1tux !s1t !s1sx Λª松材线虫抗原蛋白 o以及 t1s Λª的松木腐生线虫蛋白 o分别点样于干燥
的白皮松k Πινυσ βυνγεαναl木片表面上ky ¦° ≅ v ¦° ≅ s1u ¦°l o晾干后微波k{ss • l高火加热 t1x °¬±o固定木
材表面抗原k¤º¯ µ¨ ετ αλqot||vl ∀将上述木片
加入 us °封闭液中 ow ε o封闭过夜后用于免
疫学检测 ∀自然感染松材线虫的疫木样品则直
接取大小为 w ¦° ≅ w ¦° ≅ s1u ¦°的弦切片 o经
上述条件固定 o封闭后直接用于免疫学检测 ∀
115 疫木切面线虫抗原的免疫染色
取上述封闭后的木片 o加入 t sss倍稀释
的 „±·¬p…÷ 血清 o振荡 o室温反应 v «∀经 °…≥×
清洗 o除去未结合抗体k共 x次 o每次 tx °¬±l o
随后加入盛有 x °xss倍稀释的 ‹• °标记的
羊抗兔 ŒªŠ 酶标二抗的杂交袋中 o室温放置
u «∀经 °…≥× 充分清洗后 o加入联苯二胺
k⁄„…l和 w p 氯萘酚的混合底物溶液k≠²∏±ªo
t|{|l o反应 ts °¬±o用蒸馏水冲洗 o中止反应 o
并立即照相保存 ∀
u 结果与分析
2 .1 抗血清的特异性分析
分别以相同剂量的线虫抗原蛋白包被酶标
板 o加入 „±·¬2…÷ 血清同固相抗原结合的抗体
以酶标二抗进行检测 o采用 ∞Œ≥„ 法考察抗血
清的特异性 ∀结果如表 t所示 o„±·¬2…÷ 抗体对
松材线虫抗原呈现良好的反应性 o…÷t !…÷u !
ust 林 业 科 学 wt卷
…÷v !…÷w 的 ’⁄w|s ±°吸光度均大于 s1ws o拟松材线虫 …t !…u !…v 也呈现了一定的交叉反应 o而松木上其他
的腐生线虫 o如双胃线虫k ∆ιπλογαστερ¶³ql以及湖南伞滑刃线虫k Β q ηυνανενσισl反应性较低 o说明该血清对松
材线虫有一定的专属性 ∀另外 o拟松材线虫之间的吸光度变化很大 o说明不同品系的拟松材线虫抗原之间也
存在着较大的差别 ∀
2 .2 检测方法的灵敏度和特异性考察
在健康松木的木片上用线虫抗原点样 o人工模拟线虫感染的松木 o再用 „±·¬p…÷ 血清结合酶标抗体考察
检测的灵敏度和特异性k图 tl o复合底物的棕黑色显色状况经 ∂⁄≥扫描分析结果见表 u ∀与空白对照相比
较 o松材线虫蛋白抗原的检测灵敏度为 s1t Λªk ΠΠ́ u1sl o而其他 u种松木的腐生线虫蛋白质样品几乎没
有颜色反应k ΠΠΝ u1sl ∀该结果不仅为在疫木切面上直接进行原位染色打下了基础 o同时也为以木片作为
免疫反应的介质进行免疫学试验提供了可行性的证据 ∀
图 t 木片表面线虫抗原的免疫斑点印迹分析
ƒ¬ªqt Œ°°∏±²¥¯²·¤±¤¯¼¶¬¶©²µ±¨ °¤·²§¨ ¤±·¬ª¨ ±¶
²±·«¨ ¶∏µ©¤¦¨ ²©³¬±¨ º²²§¶¨¦·¬²±
t !u !v !w !x号 …÷ 抗原量分别为 s qxs os qux os qtux os qts和
s qsx Λª~z和 {号为双胃线虫和湖南伞滑刃线虫提取物
t qs Λª~y号为空白 s Λª…≥„ ~‘²qt ou ov ow ox
¤µ¨ s qxs os qux os qtux os qts ¤±§s qsx Λª…÷ ¤±·¬ª¨ ±~
‘²qz ¤±§‘²q{ ¤µ¨ t qs Λª ∆ιπλογαστερ¶³q¤±§
Β q ηυνανενσισ ¬¨·µ¤¦·~…¯¤±®·¨¶·²©
‘²qy ¬¶s Λª…≥„
表 2 免疫斑点印迹法检测线虫蛋白抗原的交叉反应考察
Ταβ . 2 Τηε χροσσ ρεαχτιϖιτψ οφ νεµατοδε προτειν
δετερµινεδ βψιµ µ υνοβλοτ µετηοδ
编号
‘²q
线虫样品
‘¨ °¤·²§¨ ¶¤°³¯¨
线虫蛋白含量
°µ²·¨¬± ¦²±·¨±·ΠΛª
积分光密度
Œ’⁄
信噪比
ΠΠΝ
t s1xs uwv1uyw uy1z
u s1ux tz|1|wv t|1{
v 松材线虫Β q ξψλοπηιλυσ s1tux |x1zzv ts1xw s1ts xv1xxx x1{{
x s1sx tz1swy t1{z
y 空白 …¯¤±® s |1tsv t1s
z 双胃线虫∆ιπλογαστερ¶³q t1s {1svs s1{{
{ 湖南伞滑刃线虫Β q ηυνανενσισ t1s tw1tty t1xx
2 .3 疫木切面原位免疫染色
分别取自然感染松材线虫的黑松疫木k江苏南京l和拟松材线虫的马尾松疫木k四川邻水l弦切片 o经微
波固定 o封闭处理后 o分别加入空白兔血清和 „±·¬p…÷ 血清 o直接在疫木切面进行免疫组化染色 ∀结果如图 u
所示 o与感染拟松材线虫的松木相比k≤ o⁄l o感染松材线虫的疫木k„ o…l的树脂道和纵向薄壁细胞有明显的
褐变k白色箭头l o这也与报道的松材线虫侵染松树树脂道的结论相吻合k郭道森等 ousssl ~感染拟松材线虫
的疫木切片上未见 ⁄„…底物的显色k⁄l o说明该抗体对松材线虫有较好的特异性 ~与之相对比 o感染松材线
虫的免疫组化的着色部位多集中在皮层与髓部之间的管胞部位k…lk黑色箭头l o表明该部位可能有松材线
虫蛋白抗原的存在 o这也与松材线虫的侵染途径k朱克恭 ot||xl o以及感染后树皮和木质部中可溶性蛋白含
量增加k≠¤°¤§¤ot|{zl的报道一致 ∀
v 讨论
多年以来 o松材线虫致病机理一直是研究的热点k杨宝君 oussul ∀病理生理学研究认为 }松材线虫感染
松树后 o树脂道泌脂细胞的胞质首先颗粒化 o细胞内含物褐变 o轴向和射线薄壁细胞死亡 ∀进一步树脂道 !射
线和形成层内出现空洞 o并延伸至皮层和木质部引起组织的严重破坏 o最终导致松树死亡 ∀目前 o松材线虫
致病的机理存在着酶学学说 !空洞化学说和毒素学说 v种不同的观点 o大多数结论都是建立在病木形态学变
化的基础上 o未能在分子水平上阐明其内在的机理k谈家金等 ousstl ∀
¤º¯ µ¨等kt||vl曾经用抗松材线虫的多克隆抗体检出了点样于欧洲赤松k Πq σψλϖεστρισl木材表面的培养
线虫的微量蛋白质ks1w Λªo相当于 ux条线虫l ~但他认为木材的种类和感染情况不同 o松材线虫常常以 t ∗
ts条不等的数量分散或聚集于木材内部 o因而未能对自然感染松材线虫的疫木进行更深入地研究 ∀
vst 第 y期 白 钢等 }疫木切面上松材线虫抗原的免疫学检测方法
图 u 自然感染的疫木切片的免疫组化分析
ƒ¬ªqu ׫¨ ±¤·∏µ¤¯ ¬±©¨¶·¨§³¬±¨ º²²§¶¨¦·¬²±¶
¶·¤¬±¨ §©²µ±¨ °¤·²§¨ ¤±·¬ª¨ ± ¥¼¬°°∏±²¦¼·²¦«¨ °¬¶·µ¼
„ q自然条件下感染松材线虫野生木片的空白对照 ≤²±·µ²¯
¶¤°³¯¨o…÷ ±¤·∏µ¤¯ ¬±©¨¦·¨§ º¬¯§ º²²§¶¨¦·¬²±~…q结合有抗 …÷
血清的松材线虫感染的松树木片样品染色 ≥·¤¬±¬±ª¶¤°³¯¨²©
…÷ ±¤·∏µ¤¯ ¬±©¨¦·¨§³¬±¨ º²²§¶¨¦·¬²± º¬·« „±·¬2…÷ ¶¨µ∏° ~≤ q自然
条件下感染拟松材线虫野生木片的空白对照 ≤²±·µ²¯ ¶¤°³¯¨o
… ±¤·∏µ¤¯ ¬±©¨¦·¨§º¬¯§º²²§¶¨¦·¬²±~⁄q结合有抗 …÷ 血清的拟
松材线虫感染的松树木片样品染色 ≥·¤¬±¬±ª¶¤°³¯¨ ²© …÷
±¤·∏µ¤¯ ¬±©¨¦·¨§³¬±¨ º²²§¶¨¦·¬²± º¬·« „±·¬p…÷ ¶¨µ∏°∀白色箭头
指向树脂道和纵向薄壁细胞 ~黑色箭头指向染色的管胞组
织 ~ • «¬·¨ ¤µµ²º¶¬±§¬¦¤·¨ µ¨¶¬± ¦¤±¤¯ ¤±§ ²¯±ª¬·∏§¬±¤¯ ³¤µ¨±¦«¼°¤
¦¨¯¯ ~¤±§¥¯¤¦®¤µµ²º¶¬±§¬¦¤·¨ ¶·¤¬±¨ §·µ¤¦«¨¬§·¬¶¶∏¨ q
本研究首先在健康木材表面进行免疫斑点印迹的试验 o
其检测灵敏度为 s1t Λª线虫蛋白k相当于 y ∗ {条线虫l o显
示了本试验所制备的抗松材线虫血清k„±·¬2…÷l有较高的滴
度 k图 tl ∀相关研究的免疫印迹分析结果也表明 o„±·¬2…÷
抗体可识别松材线虫多种可溶性抗原蛋白k白钢等 ousswl ∀
在此基础上 o本试验重点对自然感染的黑松疫木切片进行了
松材线虫抗原的免疫学检测研究 ∀免疫组化的染色结果表
明 }该方法可以清晰地分辨出轴向的部分管胞处的 ⁄„…底
物的颜色 o证明该部位有松材线虫抗原的存在 k图 ul o初步
认为可能是线虫分泌到体外的酶类或其他蛋白抗原 ∀
有研究表明 o当松材线虫侵入松树体后 o可通过木质部
的树脂道 !木射线及管胞作垂直或水平方向的移动 o当病木
枯死后 o病木中的松材线虫逐渐减少 o最终几乎消失k朱克
恭 ot||xl ∀而松材线虫致病机理之一则认为 }松材线虫向体
外分泌的纤维素酶导致了松树薄壁细胞的细胞壁和细胞膜
的破裂 o树脂不正常地从树脂道中渗漏并扩散到相邻的管胞
中 o使水分输导受阻 o导致了松树的萎蔫k≠¤°¤°²·²ot|{yl ∀
严东辉等kt||yl也证明松材线虫可以向体外分泌多种酶蛋
白 o其中包括纤维素酶 !过氧化物酶 !蛋白酶 !淀粉酶等 ∀本
研究虽然未能直接观测到疫木切片中松材线虫的存在 o但发
现了管胞中存在的松材线虫抗原 ∀如果能进一步证明这些
抗原是松材线虫向体外分泌的酶 o特别是纤维素酶 o这无疑
将为致病机理的酶学学说提供一个有利的佐证 ∀
本研究利用抗松材线虫血清 o采用免疫学手段建立了在
疫木切面上直接进行免疫组化染色检测松材线虫抗原的方
法 ∀虽然由于取样季节和取样部位以及抗体的特异性等因素的影响 o给该方法的实际应用带来一定的困难 o
但该方法对疫木上松材线虫的检测 o以及感染状况的实时监控仍有很大的实用价值 o更有助于获取松材线虫
以及其可溶性蛋白抗原成分在疫木组织内的分布信息 o进而对松材线虫病的病理学研究有着重要的意义 ∀
参 考 文 献
白 钢 o王玉 o马洪周 qussx q疫木中松材线虫的免疫学检测方法的研究 q林业科学 owtkul }|t p |x
郭道森 o赵博光 o李周直 qusss q松材线虫病致病机理的研究进展 q南京林业大学学报 ouwkwl }yw p y{
谈家金 o冯志新 qusst q松材线虫病病理生理学研究进展 q江西科学 ot|ktl }uz p vs
严东辉 o杨宝君 qt||y q松材线虫体外酶组成分析 q林业科学研究 otskvl }uyx p uy|
杨宝君 qussu q松材线虫病致病机理的研究进展 q中国森林病虫 outkul }uz p vt
朱克恭 qt||x q松材线虫病研究综述 q世界林业研究 okvl }u{ p vv
¤º¯ µ¨≤ o‹¤µ° ¼¨  „ qt||v qŒ°°∏±²¯²ª¬¦¤¯ §¨·¨¦·¬²±²©±¨ °¤·²§¨ ¤±·¬ª¨ ±¶²±·«¨ ¶∏µ©¤¦¨ ²©¤º²²§¶¨¦·¬²±qƒ∏±§¤° ±¨·¤¯ ¤±§„³³¯¬¨§‘¨ °¤·²¯²ª¼otykyl }xut
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¼¨ µ¶• ƒ qt|{y q≤¤°¥¬∏° §¨¶·µ∏¦·¬²±¬± ¦²±¬©¨µ¶¦¤∏¶¨§¥¼ ³¬±¨ º²²§±¨ °¤·²§¨ q ‘¨ °¤·²¯ ot{kvl }v|{ p wsu
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²©·«¨ ³¤·«²ª¨ ± q³± ƒ²µ≥²¦oyzk|l }vyy p vzu
’®∏ ‹ qt||s q°«¼·²·²¬¬±¶¬± ³¬±¨ k Πινυσl º¬¯·§¬¶¨¤¶¨ Βυρσαπηελενχηυσ ξψλοπηιλυσq‘¬³³²± ‘²ª¨¬®¤ª¤®∏Ž¤¬¶«¬oywkzl }tuxw p tuxz
≠¤°¤§¤ × qt|{z q¬³¬§³¨µ²¬¬§¤·¬²± §∏µ¬±ª·«¨ §¨ √¨ ²¯³°¨ ±·²©³¬±¨ º¬¯·§¬¶¨¤¶¨ q „±± °«¼·²³¤·«≥²¦¤³¤±oxv }xuv p xvs
≠¤°¤°²·² ‘qt|{y q≤¨¯ ∏¯¯¤¶¨ ¬¨∏§¤·¬²± ¥¼·«¨ ³¬±¨ º²²§±¨ °¤·²§¨ i §¨·¨¦·¬²± ²©¤¦·¬√¬·¼¬±¬·¶¦µ¤º¬±ª·µ¤¦®q³± ƒ²µ≥²¦oy{ }uvz p uws
≠²∏±ª° • qt|{| q∞±«¤±¦¨° ±¨·²©¬°°∏±²¥¯²·¶·¤¬±¬±ª∏¶¬±ª¤ °¬¬¨ §¦«µ²°²ª¨ ±¬¦¶∏¥¶·µ¤·¨qŒ°°∏±²¯  ·¨«²§¶otutkul }u|x p u|y
wst 林 业 科 学 wt卷