全 文 ：第 wt卷 第 u期
u s s x年 v 月
林 业 科 学
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∂²¯1wt o‘²1u
¤µqou s s x
松针褐斑病菌毒素 „ pŒ的分离纯化及其化学结构 3
杨 斌t 叶建仁t 包 宏u 刘吉开u 董泽军u
kt q南京林业大学 南京 utssvz ~ u q中国科学院昆明植物研究所 昆明 yxsuswl
摘 要 } 采用柱层析和高效液相色谱分离相结合 o从松针褐斑病菌的 °⁄培养液中分离提纯到一种致毒活性物质
„ p Œo该物质为无色油状物 ∀紫外扫描显示 „ p Œ的最大吸收波长为 usz ±° ∀在 vyx ±°和 uxw ±°波长下 „ p Œ
无吸收 ∀ ƒ„…p ≥ 和 ‹• ƒ„…p ≥分别显示该毒素物质的相对分子质量和分子式为 tyu和 ≤y ‹ts ’x ~氢谱中的 u个
信号k∆t1uy o∆w1uul表明该毒素物质存在 ) ’≤‹k≤‹vl ) 基团 ∀碳谱显示有 v个碳信号k∆t{t1s| o∆yy1|| o∆ut1y|l o
证明存在 ) ≤’’‹ o ) ≤‹ o ) ≤‹v基团 ∀综合质谱 !核磁共振谱分析确定 „ p Œ为 ≤’’‹≤‹k≤‹vl’≤‹k≤‹vl≤’’‹
kΑoΑχ p二丙酸醚l o红外光谱也证实了毒素的这一化学结构 ∀
关键词 } 松针褐斑病菌 ~真菌毒素 ~ΑoΑχ p二丙酸醚
中图分类号 }≥zyv1t{ ~’yut1w 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kussxlsu p ss{y p sx
收稿日期 }ussv p sx p uv ∀
基金项目 }国家自然科学基金项目/松针褐斑病菌致病毒素的研究0k批准号 v|{zsyuzl ∀
3 叶建仁为通讯作者 ∀
Σεπαρατιον ανδ Πυριφιχατιον oΣτρυχτυρε οφ ΛΑp Ι Τοξιν Προδυχεδ
βψ Βροων Σποτ Νεεδλε Βλιγητ Φυνγυσk Λεχανοστιχτα αχιχολαl
≠¤±ª…¬±t ≠¨¬¤±µ¨±t …¤² ‹²±ªu ¬∏¬®¤¬u ⁄²±ª ­¨∏±u
kt qΝανϕινγ Φορεστρψ Υνιϖερσιτψ Νανϕινγutssvz ~ u q Κυνµινγ Ινστιτυτε οφ Βοτανψo Χηινεσε Αχαδεµψοφ Σχιενχεσ Κυνµινγyxsuswl
Αβστραχτ } …µ²º±¶³²·±¨ §¨¯¨¥¯¬ª«·©∏±ª∏¶kΛεχανοστιχτα αχιχολαl ¦²∏¯§³µ²§∏¦¨ ³¤·«²ª¨±¬¦·²¬¬±q„ ¦²°¥¬±¤·¬²±∏¶¨ ²©¶¬¯¬¦¤
ª¨¯¦²¯∏°± ¦«µ²°¤·²ªµ¤³«¼oµ¨√¨ µ¶¨§³«¤¶¨ ¶¬¯¬¦¤ ª¨¯ ¦²¯∏°± ¦«µ²°¤·²ªµ¤³«¼ ¤±§ ‹°≤ ¯¨ §·²·«¨ ¬¶²¯¤·¬²± ²©¤ ³«¼·²·²¬¬¦
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²¬¯q˜∂ ¶¦¤±±¬±ªµ¨¶∏¯·¶¬±§¬¦¤·¨§·«¨ °¤¬¬°∏° ¤¥¶²µ³·¬√¨ º¤√¨ ¯¨ ±ª·«²©„ pŒ º¤¶usz ±°q˜±§¨µvyx ±° ¤±§uxw ±°o„
pŒ«¤§±²²µ¯¬·¯¨˜∂ ¤¥¶²µ³·¬²±q׫¨  • ¤±§ ƒ ²©·«¬¶·²¬¬± º¤¶§¨·¨µ°¬±¨ §¥¼ ƒ„…p ≥ ¤±§ ‹• ƒ„…p ≥ ¤¶tyu ¤±§
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¶·µ∏¦·∏µ¨ ¦²∏¯§ ¬¨³¯¤¬±Œ• ¶³¨¦·µ∏° º¨ ¯¯ q
Κεψ ωορδσ} Λεχανοστιχτα αχιχολα~°¼¦²·²¬¬±~ΑoΑχ§¬p ³µ²³¤±¤¦¬§¤¨·«¨µ
毒素是植物病原菌借以侵袭寄主植物的主要力量之一 ∀植物病原菌往往产生多种致毒活性物质适应不
同寄主的抗病性或同一寄主的不同抗病机制k章元寿 ot||y ~董汉松 ot||yl ∀链格孢菌k Αλτερναρια αλτερναταl是
可产生多种致毒活性物质的典型病原菌之一 ∀迄今为止 o已发现它可产生环四肽 !链格孢烯 !高分子多糖 !细
链格孢菌酮酸 !甲基醚链格孢酚 !吡咯衍生物等 y种毒素 o危害苹果 !草莓以及瓜类植物 ∀常引起植物根部病
害的尖孢镰刀菌k Φυσαριυµ οξψσπορυµl也能产生 x种以上的毒素 o危害棉花 !蕃茄等植物k海蒂弗斯等 ot||t ~
‹¬µ²¨ ετ αλqot|xy ~× °¨³¯ ·¨²±ot|zul ∀
松针褐斑病菌kΛεχανοστιχτα αχιχολαl可产生致毒活性物质 o已在多篇研究报道中证实k杨斌等 ousst ~叶建
仁等 ousssl o且已从松针褐斑病菌 ∏µ¤¶«¬ª¨ p ≥®²²ª培养液k≥培养液l中分离出一种含硫的致毒活性物质 o
并确定了其化学组成和分子结构等k杨斌等 ousstl ∀从含硫活性物质分离剩余物的生物检测显示有很高的
致毒活性来看 o极有可能还存在着其他的致毒活性物质 o而且可能还是致毒活性更高的毒素 ∀对松针褐斑病
菌的毒素进行层析分离研究过程中也显示松针褐斑病菌可以产生一种以上的致毒活性物质k叶建仁等 o
ussvl ∀因此 o必须对松针褐斑病菌的次生代谢产物进一步分离 ∀松针褐斑病菌毒素的前期研究中显示生物
活性物质含量少 o是制约对该病菌毒素分离研究的一个重要原因 ∀如果加大培养物的量 o就有可能从中分离
纯化出活性物质 ∀用马铃薯 p葡萄糖培养液k°⁄培养液l和 ≥培养液培养病菌均可产生毒素 o但在相同培
养条件下 °⁄培养液粗提物活性略强一些 ∀因此 o从毒素含量及活性角度考虑 o本研究拟采用 °⁄培养液 o用
正相硅胶柱和反相硅胶柱相结合分离松针褐斑病菌毒素 o并继续采用生物检测的方法追踪活性物质 ∀
t 材料与方法
111 菌株和试剂
供试菌株自福建沙县官庄林场患松针褐斑病的湿地松k Πινυσ ελλιοττιιl松针上分离得到 ∀试剂为甲醇 !氯
仿k„• o天津化学试剂厂l o柱层析硅胶ktss ∗ uss目 o青岛海洋化工厂l o• ³p t{预装柱≈k¯ ²¥¤µ柱l o规格 }ux
°° ≅ vts °° o德国 …¤¼¨ µ公司产品  ∀
112 方法
培养与毒素粗提 菌株扩培后接种于已灭菌的 us °⁄培养液中 o于 ux ε 下摇床振荡培养 ux §∀用旋
转蒸发仪将培养滤液蒸干 o先加入 ts 甲醇充分提取 o蒸干甲醇提取液后 o再加入 us 氯仿甲醇混合溶液
k氯仿Β甲醇 € uΒvl ovx ε 下振荡 y «o充分提取 o滤去不溶物 o蒸干得毒素粗提物 ∀
硅胶吸附和上样 用 uxs °甲醇溶解毒素粗提物 o向溶液中加入适量粗硅胶 o置于旋转蒸发仪中 ws ε
下抽真空旋转蒸发至干 o使毒素粗提物能充分均匀吸附于硅胶上 o小心把吸附有毒素粗提物的粗硅胶加于已
装好的柱中 o并加入氯仿 o使氯仿液面与硅胶表面相平 ∀
毒素分离及生测 先用正相柱进行分离 o采用顺序梯度洗脱法洗脱 o用氯仿洗脱 o然后向其中加入少量
甲醇增大极性 o整个洗脱过程中缓慢增加洗脱液极性 o尽可能使各个色带能较好分开 o调节层析柱阀门 o使流
速为 u °#°¬±pt ∀收集时以等体积为主 o兼顾各个色带 o同时使收集的每个分离组分蒸干后不超过 t1s ªo按
洗脱液先后顺序编号并分别蒸干 o加水配成 u °ª#°pt溶液进行生测 ∀生测材料为湿地松幼苗k培养 w个月
左右l o紫茎泽兰k Ευπατοριυµ ¶³ql叶片k采自西南林学院校园l o生测方法采用针刺法 o/ p 0表示生测无活性 o
/ n 0表示有生测活性 ∀对于生测有活性的组分再用旋转蒸发仪蒸干 o加适量蒸馏水配成浓溶液 o用 • ³p t{
反相柱进行多次分离 o收集分离组分进行生测 ∀
活性物质 „的 ‹°≤检验及分离 色谱条件 o≤ p t{柱k • ¤·¨µ¶公司产品 o规格 }w °° ≅ txs °°l ow{y˜∂
检测器 o检测波长 uts ±° oº¤·¨µ¶¬¯¯ ±¨±¬∏° usts色谱管理系统 o流动相甲醇Π水梯度洗脱k需要时可改变洗脱
梯度l ∀采用高效液相色谱制备方法分离纯化活性物质 o用针刺接种法生测所分离的各个组分 o确定其活性 ∀
活性物质紫外吸收特性 将分离中获得的活性组分物质以甲醇溶解 o用 ˜∂ p vyx紫外 p可见光分光度
计进行紫外扫描 o扫描条件 }≥¦¤± º¬§·«t|s ∗ wss ±° o≥¦¤± ¶³¨ §¨wss ±°#°¬±pt oΚ∞¬³¤±¶¬²± ux ±°#¦°pt ∀
113 仪器
质谱k≥l 试验用仪器为 ∂ Š p „∏·²¶³¨¦vsss型质谱仪k…¨ ¦®°¤±l o分别用电子轰击法k∞Œn l和快原子轰
击法kƒ„…p l测分子量 o并用快原子轰击高分辨质谱k‹• ƒ„…p ≥l精确测定分子量 o计算其可能的化学组成
k沈淑娟 ot||ul ∀
核磁共振谱k‘ • l t ‹和tv ≤核磁共振谱kt ‹ ‘ • 和tv ≤‘ • l由 …µ∏¦®¨µ公司生产的 „° p wss型波谱仪
测定 ∀氘代水k⁄u ’l为溶剂 oא≥k四甲基硅烷l作内标 ∀
红外光谱kŒ• l 试验用仪器为 °¨ µ®¬±p ∞¯ °¨¨ µp xzz型红外光谱仪 o采用 Ž…µ压片制样 ∀
u 结果与分析
211 正反相柱层析分离获得毒素活性物质 „
松针褐斑病菌在 °⁄培养液中生长较在 ≥培养液中快 ous §后菌丝团上即可见黑色子实体 oux §后培
养液滤液黄褐色 ∀us 培养液蒸干后 o经 u次提取得到粗提物 xz ªo粗提物呈黑褐稠粘状物 o在毒素粗提过
程中 o仍可获得大量的糖醇 o这些糖醇极易溶于水 o微溶于甲醇 o可通过甲醇重结晶获得无色针状晶体 o生测
无活性 o经质谱证明该化合物为 ≤y ‹tw ’y ∀
z{ 第 u期 杨 斌等 }松针褐斑病菌毒素 „ p Œ的分离纯化及其化学结构
图 t „ p·²¬¬±¶的分离流程
ƒ¬ªqt „ ³µ²¦¨§∏µ¨ ∏¶¨§©²µ·«¨ ¶¨³¤µ¤·¬²± ²©„ p·²¬¬±¶
在柱层析分离过程中 o用纯氯仿洗脱时 o仅能看到 u条黄色带移动速度很慢 o缓慢增加极性时 o不断有色
带从吸附有样品的硅胶上洗下 o分离效果较好 ∀通过不断增加洗脱液甲醇含量 o一直洗到硅胶柱变白 o收集
到的洗脱液无干物质为止 ∀共用 u周时间洗脱正相柱 o收集到 ww个洗脱组分 ∀生测表明有活性的组分集中
在 | ∗ t{号瓶 o共 ts个 ∀合并有活性物质 o用 • ³p t{柱进行多次分离 o最后获得 u个较纯且有活性组分 ∀
其中一个为黄色固体物质 o能溶于丙酮 o用丙酮结晶和重结晶得到无色晶体 o后经质谱分析 o该组分为„ pŒŒ
k杨斌等 ousstl ∀多次用 • ³p t{柱分离后得另外一个活性组分为黄色粘稠状物 o不溶于石油醚 o能溶于丙酮
及氯仿甲醇溶液k氯仿Β甲醇 € |Βtl o在多种有机溶剂中均不结晶 ∀在 • ³p t{反相柱上多次分离 o均显示一
条整齐的黄色带 ∀故认为是较纯物质 o记为 „ ∀ „虽然 • ³p t{柱多次层析均表现为单一物质的特点 o但要
判断是否为纯物质还需其他手段加以检验 ∀
212 活性物质 „及其紫外检测
过去研究得知活性组分在 uts ±°附近有最大吸收k叶建仁等 oussvl o故层析分离采用 uts ±°作为 ‹°≤
检测波长 ∀ ‹°≤分析表明 o采用甲醇Π水作洗脱液进行梯度洗脱时 o„为单一峰 o但峰形为 ∂…峰 o因此 „很
可能是由保留时间相距很近的 u个峰组成 ∀后改变洗脱条件 o使甲醇递增速度减慢 o且加入少量磷酸 o使分
离度明显提高 ∀此时 o‹°≤显示 „由 u种物质组成 ∀用 ‹°≤ 在此洗脱条件下 o经过 u次分离最终获得 „
中的 u个组分 o分别记为和 Žo和 Ž经 ‹°≤分析表明二者均显示典型的单一峰 o表明它们已是纯物质k图
{{ 林 业 科 学 wt卷
u !vl ∀生测试验表明 o有致毒活性 ∀按照植物病原菌毒素的命名习惯将 记为 „ p Œ∀ Ž经生测试验表明
无致毒活性 ∀对有活性的物质 k„ pŒl进行紫外扫描结果表明 o其最大吸收波长在 usz ±° o这与过去的研
究结果一致k图 wl ∀
图 u 纯化后 组分的 ‹°≤ 图k„ p Œl
ƒ¬ªqu ‹°≤ ²©³∏µ¬©¬¨§©µ¤¦·¬²±
图 v 纯化后 Ž组分的 ‹°≤ 图
ƒ¬ªqv ‹°≤ ²©³∏µ¬©¬¨§Ž©µ¤¦·¬²±
213 毒素 ΛΑ − Ι的化学组成和分子结构的确定
ƒ„…p ≥显示 „ pŒ的分子量为 tyu o‹• ƒ„…p ≥精确测得k p tl为 tyt1swz xu{ o其可能分子式为 }
≤y ‹ts ’xk计算值为 tyt1sww |||l和 ≤tv ‹yk计算值为 tyt1svt uxl ∀
t ‹‘ • 谱显示有一个 ) ≤‹k∆w1uvl o且该 ) ≤‹ 有 w重峰 o表明附近有一个 ) ≤‹v与之耦合 o化学位移
∆w1uv证明 ≤‹与 ’相连 ∀同样t ‹‘ • 也显示一个具 u重峰的 ) ≤‹vk∆t1uyl o表明 ) ’≤‹k≤‹vl存在 ∀
tv ≤‘ • 谱显示有一个 ) ≤’’‹k∆t{t1s|l !一个 ) ≤‹k∆yy1||l和一个 ) ≤‹v k∆ut1y|l ∀结合 ≥ !t ‹‘ •
分析可知 „ pŒ化学组成为 ≤y ‹ts ’x o并推测该化合物可能存在 v个对称碳原子 o即可能分子结构为 }‹’’≤
k≤‹vl≤‹’≤‹k≤‹vl≤’’‹ ∀这一结构在 Œ• 谱上得到部分证实 oŒ• 谱显示 u {tu ¦°处有一个较宽的 ≤’’‹
峰 ~t tu{ ¦°处有一个中等强度吸收峰 o表明有 ≤ ) ’ ) ≤存在 ∀各种图谱综合分析认为 „ pŒ分子结构为 }
≤‹’
’
≤
‹
≤‹v
’ ≤
‹
≤‹v
≤
’
’‹
该结构属一对称结构 ∀这种结构也解释了 ≥谱图中出现的 u个强碎片峰 ottzk ) ≤’’‹ln和 {|k )
≤‹≤‹v ≤’’‹ln o从上述分子结构看这种断裂是可能的 ∀经检索分析发现 o本研究在松针褐斑病菌中首次发
|{ 第 u期 杨 斌等 }松针褐斑病菌毒素 „ p Œ的分离纯化及其化学结构
图 w „ p Œ的紫外扫描图谱
ƒ¬ªqw ˜∂ ¶³¨¦·µ∏° ²©„ p Œ
现的致病毒素 „ pŒ及已报道的 „ pŒŒ均是新的天然化合物 ∀
v 结论与讨论
本研究从松针褐斑病菌液体发酵次生代谢产物中又分离到
一种致萎活性物质 „ p Œo该物质是一种能够分泌到发酵液中
的分泌型毒素 o为无色油状物 o不易结晶 o采用柱层析和高效液
相色谱相结合能够将此毒素物质分离纯化 ∀进一步证实松针褐
斑病菌能够产生一种以上的致病毒素 ∀
„ p Œ的最大吸收波长为 usz ±°∀在 vyx ±°处和 uxw ±°
波长下 „ pŒ无吸收 ~ƒ„…p ≥和 ‹• ƒ„…p ≥分别显示该毒素
物质相对分子质量和分子式分别为 tyu和 ≤y ‹ts ’x o是小分子的化合物 ∀综合质谱 !核磁共振谱和红外光谱
分析确定 „ pŒ的化学结构式为 ≤’’‹≤‹k≤‹vl’≤‹k≤‹vl≤’’‹kΑoΑχ p二丙酸醚l ∀
„ pŒ的最大紫外吸收在 usz ±°处 o这与在对松针褐斑病菌粗毒素研究时分析提出的致毒活性物质的
最大紫外吸收值为 uts ±°左右的判断相一致k叶建仁 oussvl ∀在进行松针褐斑病菌粗毒素的层析分离和紫
外吸收特性研究时 o就获得 u个具有活性的组分 o分别是 °和 ³o它们的最大紫外吸收波长均在 uts ±°附近 ∀
高效液相色谱显示 o°具 v个峰 o保留时间分别为 u1wt !v1s{ !ty1y{ °¬±~³组分具 w个吸收峰 o保留时间分别
为 u1wy !v1zx !tu1ss !tz1ux °¬±∀从保留时间来看 o° !³中有 u个相同组分 o即保留时间为 u1wyku1wtl !v1zx
kv1s{l !tz1uxkty1y{l°¬±k叶建仁 oussvl ∀至今 o笔者已从松针褐斑病菌次生代谢产物中先后共分离到 „ p Œ
和 „ pŒŒ两种活性物质 o„ pŒ和 „ pŒŒ在高效液相色谱上的保留时间与 ° !³中前面 u个峰相似 o而与保
留时间为 tu1ss和 tz1ux °¬±的 u个峰明显不同 ∀当然本研究中由于分离方法较以前略有改变 o故而没有见
保留时间为 tu1ss和 tz1ux °¬±的 u个峰明显与极性较大的 „ pŒ和 „ pŒŒ同时出现在同一个粗毒素分离
组分中 ∀由此可以推断 o在过去的层析分离中 °和 ³组分中的 w个物质中前面 u个峰与致毒活性有关 ∀但
后面 u个保留时间稍长的物质是否有活性或是否去影响 „ pŒ和 „ pŒŒ的活性还值得深入研究 ∀
至此 o笔者已先后从松针褐斑病菌的发酵液中分离获得 u种致萎活性物质k杨斌 ousstl ∀本研究小组曾
在毒素组分被分离之前的毒素粗提液水平上 o对毒素的作用机理进行初步的探索和分析k叶建仁 ousssl ∀对
已经纯化的毒素 „ pŒ和 „ pŒŒ作用机制是否与存在粗毒素一致尚不清楚 o有待深入研究 ∀此外 o这 u种
天然产物的应用与开发也是一值得深入研究的课题 ∀
参 考 文 献
董汉松主编 qt||y q植物诱导抗病性 q北京 }中国农业出版社
海蒂弗斯 • o威廉斯 ° ‹ q朱有红 o宋佐衡 o付淑云 o等译 qt||t q植物病理生理学 q北京 }农业出版社
沈淑娟 qt||u q波谱分析法 q上海 }华东化工学院出版社
杨 斌 o叶建仁 o刘吉开 o等 qusst q松针褐斑病菌致病毒素 „ pŒŒ的分离及化学组成 q南京林业大学学报 ouxkvl }ut p ux
叶建仁 o祁高富 o封维忠 o等 qusss q松针褐斑病毒菌素对寄主细胞膜伤害机理研究 q林业科学 ovykul }{u p {y
叶建仁 o杨 斌 o包 宏 o等 qussv q松针褐斑病菌毒素的层析分离及紫外吸收特性研究 q南京林业大学学报 ou{kul }z p tt
章元寿 qt||y q植物病理生理学 q南京 }江苏科技出版社
‹¬µ²¨ Œo •¬¶«¬°¤µ¤≥ qt|xy q°¤·«²¦«¨ °¬¦¤¯ ≥·∏§¬¨¶²± º¤·¨µ°¨¯²± º¬¯·Œq ’±·«¨ º¬¯··²¬¬±o³«¼·²±¬√¨ ¬± ³µ²§∏¦¨§¥¼·«¨ ¦¤∏¶¤¯ ©∏±ª∏¶q „±± °«¼·²³¤·«²¯ ≥²¦
¤³¤±ous }tyt p tyw
× °¨³¯ ·¨²± Š ∞qt|zu q „¯ ·¨µ±¤µ¬¤·²¬¬±¶µ¨ ¤¯·¨§·²³¤·«²ª¨ ±¶¬¶¬± ³¯¤±·¶qŒ±}Ž¤§¬¶≥ o Š¬¨ª¯¤µ„ o „¬¯ ≥ k §¨¶l q ¬¦µ²¥¬¤¯ ײ¬¬±¶ q ‘¨º p ≠²µ®p ²±§²±}
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