全 文 ：第 v|卷 第 w期
u s s v年 z 月
林 业 科 学
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∂²¯ qv| o‘²qw
∏¯ qou s s v
杜仲橡胶颗粒结合蛋白的分离 !纯化及抗体制备 3
王敏杰tl 韩玉珍ul 刘卫平vl 傅永福xl
k中国农业大学生物学院植物生理学与生物化学国家重点实验室 北京 tsss|wl
赵德刚wl
k贵州大学农业生物工程重点实验室 贵阳 xxssuxl
摘 要 } 采用重复漂洗Π离心法分离纯化了杜仲橡胶颗粒 o≥⁄≥p°„Š∞分析发现杜仲橡胶颗粒含有十几种蛋
白 o其中以 xy ®∏!vs ®∏u种蛋白的丰度较高 o分别称之为 ∞∏• °°xy和 ∞∏• °°vs ∀对杜仲雌雄株的比较表明 o杜
仲雌株叶片 !雌株树皮及果皮中橡胶颗粒蛋白均是 ∞∏• °°vs含量高于 ∞∏• °°xy o而雄株叶片 !雄株树皮中正相
反 ∀进一步分离纯化了杜仲橡胶颗粒中丰度较高的 vs ®∏蛋白 o并制备了该蛋白的抗体 ∀免疫细胞化学分析
结果表明 o在叶片的含胶细胞中有阳性反应 o而其它细胞无阳性反应 ∀以上工作为研究杜仲胶粒结合蛋白功
能以及阐明杜仲胶生物合成机制奠定基础 ∀
关键词 } 杜仲 o橡胶颗粒结合蛋白 o抗体制备
收稿日期 }usst p ts p ts ∀
基金项目 }国家自然科学基金kv|{zsywwl和农业生物技术国家实验室开放课题基金k||tssw p ul资助 ∀
3 tl !ul !vl !wl !xl为作者排序 ∀韩玉珍为通讯作者 ∀
ΙΣΟΛΑΤΙΟΝoΠΥΡΙΦΙΧΑΤΙΟΝ ΑΝ∆ ΑΝΤΙΒΟ∆Ψ ΡΑΙΣΙΝΓ ΟΦ ΡΥΒΒΕΡ ΠΑΡΤΙΧΛΕ
ΒΙΝ∆ΙΝΓ ΠΡ ΟΤΕΙΝΣ ΦΡ ΟΜ ΕΥΧΟΜΜΙΑ ΥΛΜΟΙ∆ΕΣ
• ¤±ª ¬±­¬¨tl ‹¤± ≠∏½«¨ ±ul ¬∏ • ¬¨³¬±ªvl ƒ∏≠²±ª©∏xl
k Στατε Κεψ Λαβορατορψοφ Πλαντ Πηψσιολογψ ανδ Βιοχηεµιστρψo Χολλεγε οφ ΒιολογιχαλΣχιενχεσo Χηινα Αγριχυλτυραλ Υνιϖερσιτψ Βειϕινγtsss|wl
«¤² ⁄¨ ª¤±ªwl
kΑγριχυλτυραλ Βιοενγινεερινγ Κεψ Λαβορατορψo Γυιζηου Υνιϖερσιτψ Γυιψανγxxssuxl
Αβστραχτ} • ∏¥¥¨µ³¤µ·¬¦¯¨ ¶º¨ µ¨ ¬¶²¯¤·¨§©µ²° Ευχοµ µια υλµοιδεσ¥¼ µ¨³¨¤·¨§¦¨±·µ¬©∏ª¬±ª¤±§º¤¶«¬±ªq׫¨ µ¨¶∏¯·¶²©
≥⁄≥p°„Š∞ ¤±¤¯¼¶¬¶¶«²º¨ §·«¤·°²µ¨ ·«¤± ts ³µ²·¨¬±¶¤¶¶²¦¬¤·¨§º¬·« Ε q υλµοιδεσµ∏¥¥¨µ³¤µ·¬¦¯¨ ¶o¤°²±ªº«¬¦«xy ®∏
¤±§vs ®∏³µ²·¨¬±¶º¨ µ¨ °²µ¨¬±¤¥∏±§¤±¦¨ oº¨ ±¤°¨ §·«¨ ° ∞∏• °°xy ¤±§∞∏• °°vs q׫¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²±²©µ∏¥¥¨µ³¤µ·¬¦¯¨ ³µ²2
·¨¬±¶º¤¶±²··«¨ ¶¤°¨ ¬± °¤¯¨¤±§©¨ °¤¯¨qŒ±©¨ °¤¯¨∞∏• °°vs º¤¶°²µ¨ ¤¥∏±§¤±··«¤± ∞∏• °°xy oº«¬¯¨ ¬± °¤¯¨o∞∏• °°xy
º¤¶°²µ¨ ¤¥∏±§¤±··«¤± ∞∏• °°vs q∞∏• °°vs º¤¶³µ¨³¤µ¨§¤±§³∏µ¬©¬¨§q • ¨µ¤¬¶¨§·«¨ ¤±·¬¥²§¼¤ª¤¬±¶·∞∏• °°vs qŒ°°∏±2
²©¯∏²µ¨¦¨±·¨ ¬³¨µ¬°¨ ±·¶¶«²º¨ §·«¤··«¨ ª∏·¤p¦²±·¤¬±¬±ª¦¨¯¯¶¦²∏¯§¥¨ ¶·¤¬±¨ §q׫¨ ¶¨ º²µ®¶¯¤¬§·«¨ ©²∏±§¤·¬²±©²µ¶·∏§¼¬±ª
·«¨ ©∏±¦·¬²±²©·«¨ µ∏¥¥¨µ³¤µ·¬¦¯¨ ¥¬±§¬±ª³µ²·¨¬±¶¤¶º¨ ¯¯ ¤¶³µ²¥¬±ª¬±·²·«¨ °¨ ¦«¤±¬¶° ²© Ε q υλµοιδεσµ∏¥¥¨µ¥¬²¶¼±·«¨2
¶¬¶q
Κεψ ωορδσ} Ευχοµ µια υλµοιδεσo•∏¥¥¨µ³¤µ·¬¦¯¨ ¥¬±§¬±ª³µ²·¨¬±o„±·¬¥²§¼µ¤¬¶¬±ª
杜仲k Ευχοµ µια υλµοιδεσl是我国传统的药用植物 o也是最具开发前景的温带胶源植物 ∀与巴西橡胶
树k Ηεϖεα βρασιλιενσισl o银胶菊 k Παρτηενιυµ αρψεντατυιµl等积累的顺式 p聚 p t ow p异戊二烯天然橡胶不
同 o杜仲胶积累的是反式 p聚 p t ow p异戊二烯 o是天然橡胶的同分异构体 ∀由于结构上的高度有序性 o
以往杜仲胶只能作为硬橡胶使用 o而严瑞芳kt||ul发明杜仲胶的硫化工艺后 o极大地拓宽了杜仲胶的应
用价值 ∀
在大部分含胶植物中 o如巴西橡胶树 o主要在树皮韧皮部的具网络结构的乳汁管中合成橡胶 o切割
后可分泌出胶乳 o胶乳中含有大量包裹有几个到上千个橡胶分子的橡胶颗粒k⁄¬¦®¬±¶²±ot|y|l ∀银胶菊
胶粒在树皮组织普通的薄壁细胞中积累k≤²µ±¬¶« ετ αλqot||sl ∀橡胶颗粒是一类不连续的亚细胞结构 o
橡胶分子形成疏水核心 o外面由脂类和蛋白质组成的/半单位膜0包裹k≥¬¯¨ µετ αλqot||zl ∀杜仲胶以橡
胶颗粒的形式积累在含胶细胞中 ∀杜仲的根 !茎 !叶 !花 !果实的韧皮部薄壁细胞中分布着特化的含胶细
胞k卢敏等 ot||s ~田兰馨等 ot||sl ∀
对于巴西橡胶树 !银胶菊等植物积累的天然橡胶的生物合成机制已有不少的研究k„µ¦«¨µ ετ αλqo
t|yv ~ ¤§«¤√¤± ετ αλqot|{| ~…¨ ±¨ §¬¦·ot||t ~≤²µ±¬¶« ετ αλqot||x ~פ±¤®¤ ετ αλqot||x ~פ±ª³¤®§¨¨ ετ αλqo
t||y ~t||z¤~t||z¥l o而对于杜仲等植物的反式聚异戊二烯橡胶的生物合成机理的研究尚寥寥无几k田
兰馨等 ot||s ~פ±ª³¤®§¨¨ ετ αλqot||z¤~t||z¥l ∀在银胶菊橡胶颗粒结合的蛋白中含量最高的蛋白具有
催化异戊二烯聚合的橡胶转移酶活性k≤²µ±¬¶« ετ αλqot||s ~ …¨ ±¨ §¬¦·ot||t ~≤²µ±¬¶«ot||vl o而巴西橡胶
树橡胶颗粒结合的蛋白中含量最高的蛋白被认为是橡胶合成的延伸因子k¬ª«·ετ αλqot|{|l ∀因而 o本
文试图从橡胶颗粒中丰度最高的蛋白的分离纯化和功能分析入手 o以期获得杜仲胶生物合成相关的酶
或因子 o探讨杜仲胶生物合成的机理 ∀
t 材料和方法
111 植物材料
材料均取自中国农业大学校园成年杜仲树 ∀
112 实验方法
t1u1t 橡胶颗粒的提取与纯化 参照 °¤±等kt||xl及赵德刚等kt|||l的重复漂洗Π离心法k略有改动l ∀
分别采集杜仲叶片 !树皮或果皮各 zs ª浸入冰冷的 t h维生素 ≤中 o当天用于分离橡胶颗粒 ~然后在 uxs
°橡胶颗粒提取缓冲液 ktss °°²¯#pt ×µ¬¶2‹≤¯ o³‹ z1x oxs °°²¯#pt Žƒ ot h ∂¦ox °°²¯#pt ª≥’w o
x °°²¯#pt  µ¨¦¤³·²¨·«¤±²¯ os1t °°²¯#pt °≥ƒ ous h °∂°l中匀浆 o振荡 ~匀浆经 ty层纱布过滤 o滤液分
装入 xs °离心管 ~w ε ow sss ªo离心 tx °¬±o沉淀用约 vs °冰冷的漂洗液ktss °°²¯#pt ×µ¬¶2‹≤¯ o³‹
z1x ox °°²¯#pt ª≥’w ots °°²¯#pt ⁄××l充分悬浮 ~w ε ou xss ªo离心 { °¬±o沉淀用约 tx °冰冷的漂
洗液充分悬浮 ~w ε ou wss ªo离心 tx °¬±o沉淀用 x °冰冷的漂洗液充分悬浮 o即为 v次漂洗后的杜仲
橡胶颗粒悬浮液 ∀
t1u1u ≥⁄≥2°„Š∞分析 胶粒悬浮液上 t1x °°厚的 ts h k •Π∂l聚丙烯酰胺凝胶板 o进行 ≥⁄≥p°„Š∞分
析 o电泳结束后用考马斯亮蓝 • uxs染色 ∀用于大规模分离的 v °°厚制备型 ≥⁄≥p°„Š∞方法相同 o唯一
不同的是电泳缓冲液中以 ux °°²¯#pt硼酸代替 t|u °°²¯#pt甘氨酸 ∀切下对照道 o经考马斯亮蓝 • uxs
染色确定相关蛋白的位置 ∀切下相应的条带 o待电洗脱 ∀
t1u1v 电洗脱及蛋白纯度鉴定 将从凝胶板上切下来的凝胶段加入到电洗脱仪 o洗脱到缓冲液kts
°°²¯#pt ×µ¬¶2t|1u °°²¯#pt Š¯ ¼¦¬±¨ o³‹ {1vl中 ∀洗脱液用 °…≥ k tvz °°²¯ #pt ‘¤≤¯ ou1z °°²¯ #pt
Ž≤¯ ow1v °°²¯#pt ‘¤u ‹°’w ot1w °°²¯#pt Ž‹u°’w o³‹ z1ul 充分透析 ∀洗脱液经 °∞Šussss浓缩 o通
过 ≥⁄≥p°„Š∞及 …¨ ¦®°¤± °Π„≤∞¶¼¶·¨° xxss毛细管电泳仪鉴定蛋白纯度 ∀
t1u1w 免疫 将杜仲胶粒蛋白浓缩成 t ∗ u °ª#°pt的溶液 o过滤灭菌 o选取 v ∗ w月龄健康雄性新西兰
大白兔 o按以下程序进行免疫 }双后肢足垫趾窝各注射 t1s °抗原乳化液kt1s °抗原 n t1s °弗氏
完全佐剂 o充分混匀乳化l ~ts §后 o两侧淋巴结各注射 t1s °抗原乳化液kt1s °抗原 n t1s °弗氏不
完全佐剂 o充分混匀乳化l ~tw ∗ us §后 o背部皮下注射 t1s °抗原乳化液kt1s °抗原 n t1s °弗氏完
全佐剂 o充分混匀乳化l ~tw ∗ us §后再一次背部皮下注射加强免疫 ~z ∗ ts §后验血 ~背部皮下注射加强
免疫 ~一周后心脏穿刺取血 ∀ts sss µ³°离心 tx °¬±分离血清 o分装保存 ∀抗体的质量鉴定参考王国英
kt||zl的方法 ∀
t1u1x 组织切片制作 ktl 固定 }取杜仲成熟叶片 o用 ƒ„„固定液固定 o组织材料切成 u ∗ v °°u 大小 o
固定 uw «∀kul 脱水 }材料经 xs h ozs h o{x h o|x h otss h酒精脱水 ow ε 下进行 o每级 s1x ∗ t1s «∀
kvl透明 }xs h无水乙醇Πxs h二甲苯透明 s1x ∗ t «o二甲苯透明 s1x ∗ t «ou次 ∀kwl 浸蜡 }用低溶点石蜡
kxu ε l o浸透 v次 o每次 vs °¬±o然后使其凝固 ∀蜡组织块在冰箱中保存 ∀kxl切片 }用手动转动切片机 o
wu 林 业 科 学 v|卷
切成 { ∗ ts Λ°厚 ∀
t1u1y 免疫组织化学定位 ktl 用冷 ׅ≥冼净 ∀用滤纸擦去切片周围的 ׅ≥ ∀kul滴加溴 p碘 p冰醋
酸橡胶变性试剂 o室温下染色 uw ∗ w{ «∀用冷 ׅ≥冼净 ∀用滤纸擦去切片周围的 ׅ≥ ∀kvl用 ׅ≥将一
抗稀释 ts ∗ us倍 o滴加到切片上 o室温下湿盒中作用 s1x ∗ t «∀以正常兔血清作对照 ∀冷 ׅ≥洗 v ∗ x
次 o每次 ts °¬±∀kwl用冷 ׅ≥将 ƒŒ×≤pŠ²¤·p„±·¬p•¤¥¥¬·pŒªŠ稀释 xss倍 o滴加于切片上 o室温 o黑暗下作用
vs ∗ ys °¬±∀用冷 ׅ≥洗净 ∀kxl在材料周围滴 t小滴 |s h甘油 kׅ≥配制l o盖上玻片 ∀在盖玻片周围
均匀涂上一层指甲油 ∀将切片放入 w ε 或 p us ε 冰箱中 vs °¬±∀kyl荧光显微镜下观察 o拍照记录结果 ∀
u 结果与分析
211 杜仲雌雄株叶片橡胶颗粒蛋白的 Σ∆Σ−ΠΑΓΕ比较分析
分别提取杜仲雌雄株叶片的橡胶颗粒 o然后进行 ≥⁄≥p°„Š∞比较发现 o雌雄株叶片胶粒结合蛋白电
泳图谱基本类似 o图谱上可见有十几条蛋白条带 o其中以 xy ®∏和 vs ®∏u种蛋白丰度最高 o我们分别称
之为 ∞∏• °°xy和 ∞∏• °°vs ∀通过凝胶扫描发现 o杜仲雌株叶片胶粒结合蛋白以 ∞∏• °°vs含量最高 o约占胶
粒蛋白总量的 tz h o∞∏• °°xy约占 tu h ~而杜仲雄株叶片胶粒结合蛋白以 ∞∏• °°xy含量最高 o约占胶粒蛋
白总量的 vt h o∞∏• °°vs约占 ty h o如图 t o图 u所示 ∀
图 t 杜仲叶片橡胶颗粒结合蛋白的 ≥⁄≥p°„Š∞图谱
ƒ¬ªqt ≥⁄≥p°„Š∞ ³µ²©¬¯¨ ²©µ∏¥¥¨µ³¤µ·¬¦¯¨¥¬±§¬±ª³µ²·¨¬±¶©µ²° ©¨ °¤¯¨¤±§ °¤¯¨ Ε q υλµοιδεσ ¯¨ ¤√¨ ¶
t ∗ x道 }雄株叶片的胶粒结合蛋白 ~y ∗ ts道 }雌株叶片的胶粒结合蛋白 ~tt道 }标准分子量蛋白 ∀
¤±¨ t ∗ x }∞∏• °°¶©µ²° °¤¯¨ Ε q υλµοιδεσ ¯¨ ¤√¨ ¶~¤±¨ y ∗ ts }∞∏• °°¶©µ²°
©¨ °¤¯¨ Ε q υλµοιδεσ ¯¨ ¤√¨ ¶~¤±¨ tt } ²¯ ¦¨∏¯¤µº ¬¨ª«·°¤µ®¨µq
212 杜仲雌雄株树皮及果皮中橡胶颗粒蛋白的 Σ∆Σ−ΠΑΓΕ比较分析
分别提取杜仲雌雄株树皮及果皮的橡胶颗粒 o然后进行 ≥⁄≥p°„Š∞o发现树皮 !果皮胶粒结合蛋白电
泳图谱与叶片基本类似 ∀通过凝胶扫描发现 o杜仲雌株树皮胶粒结合蛋白以 ∞∏• °°vs的含量最高 o约占
胶粒蛋白总量 uw h o∞∏• °°xy约占 ts h ~而杜仲雄株树皮 ∞∏• °°xy约占胶粒蛋白总量的 tv h o∞∏• °°vs约
占 ts h ~杜仲果皮 ∞∏• °°vs约占胶粒蛋白总量的 tt h o∞∏• °°xy约占 { h ∀
213 ΕυΡΠΠ30的纯度鉴定
通过电洗脱将分子量为 vs ®∏的蛋白从凝胶中洗脱下来 o然后再进行 ≥⁄≥ p聚丙烯酰胺凝胶电泳分
析k图 v„l o发现其纯度较高 ∀用 …¨ ¦®°¤± °Π„≤∞¶¼¶·¨° xxss毛细管电泳仪进一步鉴定 ∞∏• °°vs o可见蛋
白很纯 o如图 v…所示 ∀
xu 第 w期 王敏杰等 }杜仲橡胶颗粒结合蛋白的分离 !纯化及抗体制备
图 u 杜仲叶片胶粒结合蛋白的 ≥⁄≥p°„Š∞凝胶扫描图谱
ƒ¬ªqu ≥⁄≥p°„Š∞ ª¨¯¶¦¤±±¬±ª²© ∞∏• °°¶©µ²° Ε q υλµοιδεσ ¯¨ ¤√ ¶¨
„ q雄株叶片 o峰 x }∞∏• °°xy o峰 tv }∞∏• °°vs ~… q雌株叶片 o峰 x }∞∏• °°xy o峰 tz }∞∏• °°vs ∀
„ q¤¯¨ Ε q υλµοιδεσ ¯¨ ¤√ ¶¨o°¨ ¤®x }∞∏• °°xy o°¨ ¤®tv }∞∏• °°vs ~…qƒ °¨¤¯¨ Ε q υλµοιδεσ ¯¨ ¤√ ¶¨o
°¨ ¤®x }∞∏• °°xy o°¨ ¤®tz }∞∏• °°vs q
图 v 杜仲 ∞∏• °°vs的 ≥⁄≥p°„Š∞纯度鉴定
ƒ¬ªqv °∏µ¬·¼ §¨·¨µ°¬±¤·¬²± ²© ∞∏• °°vs
„ q≥⁄≥p°„Š∞鉴定 道 t }∞∏• °°vs o道 u }分子量标记 ~
…q通过毛细管电泳纯度鉴定 ∀ „ q°∏µ¬·¼ §¨·¨µ°¬±¤·¬²± ¥¼ ≥⁄≥p°„Š∞o
¤±¨ t }∞∏• °°vs o¤±¨ u } ²¯ ¦¨∏¯¤µº ¬¨ª«·°¤µ®¨µ~…q°∏µ¬·¼ §¨·¨µ°¬±¤·¬²± ¥¼ ¦¤³¬¯¯¤µ¼ ¨¯ ¦¨·µ²³«²µ¨¶¬¶q
yu 林 业 科 学 v|卷
214 抗体制备和免疫组化分析
以纯化的 ∞∏• °°vs为免疫抗原 o成功制备了 ∞∏• °°vs抗体 ∀以小牛肠道碱性磷酸酶标记的羊抗兔免
疫球蛋白为二抗 o进行抗 ∞∏• °°vs抗体的免疫印迹kº¨ ¶·¨µ± ¥¯²·¬±ªl鉴定 ∀结果表明 o所制备抗体具有高
特异性 o与其它蛋白无交叉反应 ∀用此抗体对杜仲叶片进行了免疫组织化学分析 ∀从图 w可以看到 o在
荧光显微镜下 o叶片韧皮部薄壁细胞表现出黄绿色荧光反应k图 w„l o而普通叶肉细胞无阳性反应 ∀在
光学显微镜下可看到 o表现黄绿色荧光反应的部位恰好是胶粒所在部位k溴 p碘染色 o图 w…l o以上结果
说明 ∞∏• °°vs确为胶粒特异的蛋白 ∀
图 w 杜仲叶片 ∞∏• °°vs的免疫组化分析
ƒ¬ªqw Œ°°∏±²«¬¶·²¦«¨ °¬¶·µ¼ ¤±¤¯¼¶¬¶²© Ε q υλµοιδεσ ¯¨ ¤©¶¨¦·¬²±
„ }荧光显微镜下成熟叶片的横切面 o示 ∞∏• °°vs分布在韧皮部薄壁细胞中 ~…q光镜下成熟叶片的横切面 o示韧皮部薄壁细胞中
的胶粒kts ≅ wsl ∀ „ }×µ¤±¶√ µ¨¶¨ ¶¨¦·¬²± ²© °¤·∏µ¨ ¯¨ ¤©∏±§¨µ©¯∏²µ¨¶¦¨±·°¬¦µ²ªµ¤³«¼o¶«²º¬±ª∞∏• °°vs ¬± ³«¯²¨ ° ³¤µ¨±¦«¼°¤~…}×µ¤±¶√ µ¨¶¨
¶¨¦·¬²± ²© °¤·∏µ¨ ¯¨ ¤©∏±§¨µ¯¬ª«·°¬¦µ²¶¦²³¨ o¶«²º¬±ª·«¤··«¨ µ∏¥¥¨µ³¤µ·¬¦¯ ¶¨¦²±·¤¬±¨ §¬± ³«¯²¨ ° ³¤µ¨±¦«¼°¤¦¨¯¯¶kts ≅ wsl q
v 讨论
橡胶的生物合成是一个十分复杂而有序的过程 o包括 v个连续的步骤 }ktl起始 o需要一分子的烯丙
基焦磷酸 ~kul延伸 o橡胶转移酶催化异戊烯基焦磷酸 t ow p聚合掺入到橡胶链上 ~kvl终止 o多聚体从合
成复合体上解离下来 ∀橡胶转移酶活性的发挥除了异戊烯基焦磷酸及烯丙基焦磷酸底物外 o还需要二
价金属阳离子 ∀一般认为橡胶转移酶是紧密地结合在胶粒的表面结构上 ∀ ≤²µ±¬¶«kt||vl 认为含顺式
橡胶的植物体内含有顺式 p异戊烯基转移酶 o它紧密地结合在胶粒的膜嵌合体上 o催化 Œ°°顺 p t ow p
聚合到延伸中的橡胶链上 ∀ „µ¦«¨µ等kt|yvl指出体外研究橡胶生物合成必须要有橡胶颗粒的参与 o即
胶粒是橡胶体外合成的必要条件 ∀ ≤²µ±¬¶«等kt||vl证明反复漂洗的银胶菊胶粒悬液中含有很高的橡胶
转移酶活性 o证实了橡胶转移酶确实结合在胶粒上 ∀为此 o…¨ ±¨ §¬¦·等kt||tl作了进一步的分析 o指出橡
胶转移酶能合成高分子量的橡胶分子 o其酶动力学特性与橡胶树胶乳中分离的漂洗胶粒的橡胶转移酶
相似 ∀他们用 ≤«¤³¶处理胶粒 o使其结合蛋白溶解出来 o其中丰度最高为 xu ®∏的蛋白 o在合适的条件下
能催化 Œ°°掺入橡胶分子 o且与时间成线性关系 ∀因此 o他们认为 oxu ®∏的蛋白就是橡胶转移酶 ∀橡胶
树胶粒结合的丰度最高的蛋白分子量为 tw ®∏o被认为是橡胶生物合成的延伸因子k¬ª«·ετ αλqot|{| ~
zu 第 w期 王敏杰等 }杜仲橡胶颗粒结合蛋白的分离 !纯化及抗体制备
„·¤±¼¤®¤ ετ αλqot||tl ∀杜仲胶是天然的反式聚 p t ow p异戊二烯 o是天然橡胶的同分异构体 o因而可以
推测其生物合成机理和过程与天然橡胶相似 ∀为此 o我们对杜仲橡胶颗粒结合进行了分离 !鉴定和纯
化 ∀
对杜仲雌雄株叶片 !树皮 !果皮橡胶颗粒分别进行了 ≥⁄≥p°„Š∞分析 o结果表明 o杜仲胶粒结合蛋白
有十几种 o其中以 xy ®∏和 vs ®∏u种蛋白丰度最高 o它们可能在杜仲胶合成过程中起到重要作用 ∀通
过凝胶扫描发现 o在不同性别的植株中 o胶粒蛋白表达模式不完全相同 o在杜仲雌株叶片 !树皮及果皮中
橡胶颗粒蛋白均是 ∞∏• °°vs ®∏含量高于 ∞∏• °°xy ®∏ o相反 o杜仲的雄株叶片 !树皮中橡胶颗粒蛋白均是
∞∏• °°xy ®∏含量高于 ∞∏• °°vs ®∏ ∀已知杜仲雌雄株的含胶量不同 o一般雌株胶含量要大于雄株k王丙武等 o
t|||l o可能在不同性别植物中胶合成机制存在某些差异 ∀近期 ’«等kt|||l在巴西橡胶树中已经发现
有 u种类型的橡胶颗粒 o直径较小的橡胶颗粒所包含的橡胶分子长 o其橡胶延长因子为 uv ®∏的胶粒结
合蛋白 o而直径较大的颗粒包含的橡胶分子短 o其胶粒结合蛋白为 tw ®∏∀在杜仲胶合成过程中是否也
有类似情况 o有待于进一步阐明 ∀杜仲叶片 !树皮和果皮的含胶量也有较大差异 o但 ≥⁄≥p°„Š∞分析显
示树皮 !果皮和叶片胶粒结合蛋白组成没有明显区别 ∀可能存在其它调节杜仲胶生物合成的因子 ∀
纯化了 ∞∏• °°vs ®∏ o并以此为抗原成功制备了高特异性的抗体 ∀为分离克隆该蛋白的编码基因提供
了有效探针 o同时该抗体也可以在杜仲胶体外生物合成分析中作为免疫探针 o了解该蛋白在杜仲胶合成
中的功能 ∀以上工作为探索杜仲胶生物合成机理奠定了基础 ∀
在生产实践中 o杜仲胶主要从落叶中提取 ∀但是 o杜仲叶片中橡胶的含量很低 o大约占叶片干重的
u h ∗ v h左右 o而树皮中含 { h ∗ ts h o果皮中则高达 tu h ∗ t{ h o其中必然有某种机制控制着杜仲胶
的积累方向 ∀目前杜仲胶的需求量不断增加 ∀所以 o提高杜仲胶生物合成产量已成为杜仲综合开发利
用中一个亟待解决的问题 ∀如果能阐明杜仲胶生物合成的机理 o可以通过调节关键酶及基因工程等方
法从根本上提高杜仲胶的产量 ∀
参 考 文 献
卢 敏 o田兰馨 q杜仲茎韧皮部超微结构的初步观察 q浙江林学院学报 ot||s ozkwl }vty p vut
田兰馨 o卢 敏 o胡正海 q杜仲含胶细胞发生和发育的研究 q植物学报 ot||s ovuktl }t p y
王丙武 o王雅清 o莫 华等 q杜仲雌雄株细胞学 !顶芽及含胶量的比较 q植物学报 ot||| owtktl }tt p tx
王国英 q基因工程实验技术 q北京 }中国农业出版社 ot||z }|{ p tsw
严瑞芳 q论杜仲胶的研究开发 q见 }张康健 q中国杜仲研究 q西安 }陕西科学技术出版社 ot||u }t| p uv
赵德刚 o韩玉珍 o傅永福等 q杜仲胶生物合成相关蛋白的研究k简报l q中国农业大学学报 ot||| owktl }ttw
„µ¦«¨µ… o„∏§¯ ¼¨ …o≤²¦®¥¤¬± ∞ Š ετ αλq׫¨ ¥¬²¶¼±·«¨¶¬¶²©µ∏¥¥¨µ}¬±¦²µ³²µ¤·¬²±²©° √¨¤¯²±¤·¨ ¤±§¬¶²³¨ ±·¨±¼¯ ³¼µ²³«²¶³«¤·¨¬±·²µ∏¥¥¨µ¥¼ Ηεϖεα
βρασιλιενσισ ¤¯·¨¬©µ¤¦·¬²±¶q…¬²¦«¨ ° ot|yv o{| }xyx p xzw
„·¤±¼®¤ ⁄ ° × Š o Ž¨®º¬¦® • Š ’ oƒµ¤±®¯¬± ƒ ≤ ‹ q ²¯ ¦¨∏¯¤µ¦¯²±¬±ª¤±§±∏¦¯ ²¨·¬§¨ ¶¨ ∏´¨ ±¦¬±ª²©·«¨ µ∏¥¥¨µ¨¯²±ª¤·¬²±©¤¦·²µª¨ ±¨ ©µ²° Ηεϖεα βρα2
σιλιενσισq°¯ ¤±·²¯ …¬²¯ ot||t oty }tsz| p ts{t
…¨ ±¨ §¬¦·≤ • q׫¨ ±¨½¼°¤·¬¦¶¼±·«¨¶¬¶²©µ∏¥¥¨µ³²¯¼°¨ µ¬± Παρτηενυιµ αργερτατυµ Šµ¤¼q°¯ ¤±·°«¼¶¬²¯ ot||t o|u }{ty p {ut
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≤²µ±¬¶«Žq׫¨ ¶¨³¤µ¤·¨µ²¯ ¶¨²©³¯¤±·χι󤱧 τρανσ ³µ¨±¼¯ ·µ¤±¶©¨µ¤¶¨ ¬± χισpt owp ³²¯¼¬¶²³µ¨±¨ ¥¬²¶¼±·«¨¶¬¶q∞∏µ…¬²¦«¨ ° ot||v out{ }uyz p uzt
≤²µ±¬¶«Žo≥¬¶¯ µ¨⁄q∞©©¨¦·²©§¬©©¨µ¨±·¤¯ ¼¯¯¬¦§¬³«²¶«³¤·¨ ²±·«¨ ¬±¬·¬¤·¬²± ²©±¨ º µ∏¥¥¨µ°²¯ ¦¨∏¯ ¶¨¤±§²± χισpt owp³²¯¼¬¶²³µ¨±¨ ¥¬²¶¼±·«¨¶¬¶¬± ª∏¤¼∏¯¨
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{u 林 业 科 学 v|卷
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加强科学道德建设 纯洁科学研究风气
日前 o科技部 !教育部 !中国科学院 !中国工程院和国家自然科学基金委联合下发了5关于改进科学
技术评价工作的决定6 ∀决定指出 o科学技术评价是科技管理工作的重要组成部分 o是推动国家科技事
业持续健康发展 o促进科技资源优化配置 o提高科技管理水平的重要手段和保障 ∀ 5决定6针对我国科学
技术评价中存在的评价制度不健全 !评价体系不完善 !评价方法不规范等问题提出了很多改进意见和措
施 ∀
5决定6特别强调了科学家的社会责任感 o反对任何形式的学术不端行为 ∀提倡加强科学道德建设 o
营造良好的创新文化 o倡导热爱科学 !淡泊名利的良好文化风尚 ∀注重原始性创新或科研人员的创新潜
力 o鼓励探索 o宽容失败 ∀
5决定6的出台 o不仅对规范科技评价工作 o建立健全科技评价体制 o正确引导科技工作健康发展将
起到重要作用 o对学术期刊的质量和切身利益也将起到重要的保障作用 ∀
5林业科学6是中国林学会主办的综合性学术期刊 o创刊 ws多年来 o及时公布林业最新研究成果 o促
进林业科技教育事业发展 o在推动本学科内部及与相关学科之间的学术交流 o促进国内外的学术交流与
合作方面发挥了重要作用 o也得到了广大林业科技工作者的信任与爱戴 ∀科学论文是科学技术产出的
一种忠实记录 o作为学术期刊 o我们要进一步做好稿件的审查工作 o把是否具有原始性创新或集成性创
新 o是否具有重大科技进步 o是否客观 !真实地阐明自然现象 !特征和规律 o做出重大科学发现 o以及是否
在相应领域 !学科内产生影响等作为稿件审查的重要评价指标 o从客观上形成对国家加强科技成果评价
工作管理的支持 o树立国家科技成果评价的严肃性 !权威性和公正性 ∀
作为林业界唯一两获/国家期刊奖0的学术期刊 o5林业科学6将一如既往地倡导实事求是的优良学
风 o营造/百家争鸣0的学术氛围 o反对任何形式的学术不端行为 ∀对于一稿多投现象 o编辑部明确表示
反对 o因为这不仅是对期刊利益的侵害 o也是对广大读者和作者利益的侵害 ∀ 5林业科学6每年第 y期上
刊登的征稿简则中要求 o/不要一稿两投0 o同时对审稿期有明确的限定 o这应视为对投稿人 ) 编辑部双
方的限定 ∀根据5决定6的精神 o编辑部将进一步完善各项措施 o与投稿人签订出版合同 o明确各自的责
任与义务 o为纯洁科学研究风气而共同努力 ∀
欢迎广大读者对我们的工作进行监督 o提出意见和建议 ∀
本刊编辑部
|u 第 w期 王敏杰等 }杜仲橡胶颗粒结合蛋白的分离 !纯化及抗体制备