全 文 ：第 wu卷 第 t期
u s s y年 t 月
林 业 科 学
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x种林木的 tt个丛枝菌根菌株分子遗传初步研究 3
唐 明 陈 辉 高延锋
k西北农林科技大学林学院 杨凌 ztutssl
关键词 } 丛枝菌根真菌 ~分子遗传 ~ • „°⁄~林木
中图分类号 }≥zt{1{t 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kussylst p stuy p sv
收稿日期 }ussw p s| p us ∀
基金项目 }国家杰出青年基金资助项目kvsuuxsvxl ∀
Πρελιµιναρψ Στυδιεσ ον Μολεχυλαρ Γενετιχ οφ 11 Στραιν Αρβυσχυλαρ
Μψχορρηιζαλ Φυνγι φροµ 5 Τρεε Σπεχιεσ
פ±ª ¬±ª ≤«¨ ± ‹∏¬ Š¤² ≠¤±©¨ ±ª
kΧολλεγε οφ Φορεστρψo Νορτηωεστ Σχι2Τεχη Υνιϖερσιτψοφ Αγριχυλτυρε ανδ Φορεστρψ Ψανγλινγ ztutssl
Αβστραχτ } ׫¨ ¬±·µ¤2 ²µ¬±·¨µ2¶³¨¦¬¨¶ª¨ ±¨·¬¦§¬√¨ µ¶¬·¼ ²©tt ¶·µ¤¬± „ƒ ©µ²°©¬√¨ «²¶··µ¨ ¶¨º¨ µ¨ ¶·∏§¬¨§¥¼µ¤±§²° ¤°³¯¬©¬¨§
³²¯¼°²µ³«¬¦⁄‘„k• „°⁄l q׫¨ ª¨ ±¨ ·¬¦§¬√¨ µ¶¬·¼ ¤°²±ª „ƒ ¶³¨¦¬¨¶©µ²° §¬©©¨µ¨±·«²¶·³¯¤±·¶º¨ µ¨ °²µ¨ ¤¥∏±§¤±··«¤±©µ²°
¶¤°¨ «²¶·³¯¤±·¶q׫¨ µ¨¶∏¯·¶¶«²º¨ §·«¤··«¨ ª¨ ±¨ ·¬¦§¬√¨ µ¶¬·¼¬¶µ¨ ¤¯·¨§·² „ƒ ¶³¨¦¬¨¶¤±§«²¶·³¯¤±·¶oº«¨µ¨¤¶·«¨ ©¨©¬¦¤¦¼²©
„ƒ ¶³¨¦¬¨¶¬¶«¬ª«¨µ·«¤±·«¤·²©«²¶·³¯¤±·¶~·«¨ ¶¤°¨ ¶³¨¦¬¨¶„ƒ «¤√¬±ª¶¤°¨ ²µ¬ª¬±¤·¬²±o·«¨µ¨ º¨ µ¨ §¬©©¨µ¨±·°²µ³«²¯²ª¼
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Κεψ ωορδσ} ¤µ¥∏¶¦∏¯¤µ°¼¦²µµ«¬½¤¯ ©∏±ª¬k„ƒl ~°²¯ ¦¨∏¯¤µª¨ ±¨·¬¦~• „°⁄~·µ¨ ¶¨
丛枝菌根真菌k¤µ¥∏¶¦∏¯¤µ°¼¦²µµ«¬½¤¯ ©∏±ª¬o„ƒl由于不能纯培养 o其分子生物学研究起步较晚 ∀≥¬°²±等
kt||ul首次分析了 „ƒt{≥核糖体基因 o得到了第一条 ⁄‘„序列 o• ¼¶¶kt||vl用 • „°⁄p °≤• 技术得到 „ƒ
的 • „°⁄¶o≥¤±§¨µ¶等kt||xl对 „ƒ群落的孢子进行遗传分析 o发现其孢子间存在着µ⁄‘„序列的多型现象 o
¯²¼§2¤¦Š¬¯³等 t||y研究证实了 Γλοµυσ µοσσεαε 种间及其近缘种之间 µ• ‘„ 的 Œ×≥基因序列存在多样性 ∀
• §¨¨¦®¨µ等kusssl对 „ƒ中的 Γλοµυσ σινυασυµ 和 Σχλεροχψστισ χορεµιοιδεσ的核糖体 t{¶亚基的系统发育分析 o
证明这两种丛枝菌根真菌在亲缘关系上非常近缘 ∀国内有关 „ƒ分子生物学研究甚少k≤«¨ ± ετ αλqot|||l o
本文对来自不同宿主林木的 tt个 „ƒ菌株进行 • „°⁄分析 o研究 „ƒ的宿主林木对 „ƒ种内及种间遗传
多样的影响 ∀
1 材料与方法
t1t 供试菌种 在甘肃张掖采集刺槐k Ροβινια πσευδοαχαχιαl !柠条k Χαραγανα κορσηινσκιιl !枣k Ζιζιπηυσϕυϕυβαl !
沙棘k Ηιπποπηαε ρηαµνοιδεσl和沙枣k Ελαεαγνυσ ανγυστιφολιαl根系及根际土 o采用湿筛倾析法kŠ¨ µ§¨ °¤±± ετ αλqo
t|yvl分离 „ƒ o经白三叶草k Τριφολιυµ νεπενσl为载体进行单孢培养 oxs §后收集得到纯种 „ƒ孢子k°«¬¯¯¬³¶
ετ αλqot|zs ~李晓林等 ousstl o包括 x种 tt个菌株 o其编号 !菌种和宿主林木如表 t ∀
t1u 供试随机引物及分子量标记 选用上海生物工程技术有限服务公司生产的随机引物和 ⁄‘„ ¤µ®¨µo引
物编号及序列为 ≥ts{kŠ„„„≤„≤≤≤≤l o≥ttxk„„׊Š≤Š≤„Šl o≥tt{kŠ„„×≤ŠŠ≤≤„l o≥uyxkŠŠ≤ŠŠ„ׄ„Šl o
≥uyyk„ŠŠ≤≤≤Š„׊l ∀ ⁄‘„ ¤µ®¨µ作为分子量标记 ∀
t1v 试验方法 tl模板 ⁄‘„的提取 ⁄‘„的提取参考 • ¼¶¶的方法k • ¼¶¶ ετ αλqot||vl并稍加改进 o将不同
菌株的孢子分别放入 s1x °的离心管中k每管 ts个l o加入灭菌的双蒸水中 o高速离心ktu sss µ#°¬±ptl清洗
x次 o加入 vs Λ×µ¬¶Π‹≤¯ k³‹值为 {1sl破解 o再加入 us ˏus h ≤«¨¯¨ ¬tssk美国 ≥¬ª°¤公司生产l悬浮液搅拌
混匀 o|x ε 水浴 ts °¬±o离心kw ε otu sss µ#°¬±pt ots °¬±l o取上清液 p us ε 下保存备用 ∀
表 1 供试菌株及来源
Ταβ . 1 ΑΜΦισολατεσ ανδ τηειρ ηοστ πλαντσ
菌株 Œ¶²¯¤·¨ 菌 种 ≥³¨¦¬¨¶ 宿 主 植 物 ‹²¶·³¯¤±·
≤≤
≥≤
≥≤
‘Œ
≥Œ
≥Œ
Œ
‘

≥≤²µ
≤ƒ
Γλοµυσ χονστριχτυµ
Γ qχονστριχτυµ
Γ qχονστριχτυµ
Γ qιντραραδιχεσ
Γ qιντραραδιχεσ
Γ qιντραραδιχεσ
Γ qιντραραδιχεσ
Γ q µονοσπορυµ
Γ qµονοσπορυµ
Γ q χορονατυµ
Γ q φασχιχυλατυµ k׫¤¬·¨µl
刺槐k Ροβινια πσευδοαχαχιαl
沙棘k Ηιπποπηαε ρηαµνοιδεσl
沙枣k Ελαεαγνυσ ανγυστιφολιαl
柠条k Χαραγανα κορσηινικιιl
沙棘k Η q ρηαµνοιδεσl
沙枣k Ε q ανγυστιφολιαl
枣k Ζιζιπηυσϕυϕυβαl
柠条k Χq κορσηινκιιl
枣k Ζ qϕυϕυβαl
沙棘k Η q ρηαµνοιδεσl
刺槐k Ρ q πσευδοαχαχιαl
ul• „°⁄引物筛选及扩增
体系优化 分别对模板浓度 !
§‘×°浓度 !引物浓度和 פ´ 酶
浓度设置不同的浓度梯度进行
优化 o采用 ux ˏ反应体系k灭
菌双蒸水 tt ˏots ≅ 反应缓
冲液k含 ªun lu1x ˏo §‘×°
u1s ˏo随机引物 u1s ˏoפ´
⁄‘„聚合酶 t1x ˏo模板 ⁄‘„
y1s ˏl ∀通过对 vs条随机 ts
聚体引物进行 °≤• 反应 o根据
扩增条带的有无 !条带的数量和可重复性 !特异性及谱带强弱 o选择 x个引物用于 tt个菌株的扩增 ∀
vl°≤• 扩增程序 °≤• 扩增程序为 |w ε 预变性 u1x °¬±o|w ε 变性 vs ¶ovy ε 退火 t °¬±ozu ε 延伸 u
°¬±o反应 wx个循环后 ozu ε 延伸 x °¬±结束反应 ow1s ε 下过夜保存 ∀相同条件下设无模板 ⁄‘„的扩增反
应为对照 ∀扩增产物用含有溴化乙锭的 t1x h琼脂糖k西班牙生产l凝胶在 t ≅ ׅ∞缓冲液中电泳分离k{s ∂ o
t «l o在紫外灯下摄像记录结果 ∀
wl数据处理及聚类分析 根据某一条谱带在样品中的出现和不出现分别赋值为 t和 s o统计各菌株的
扩增条带数 o根据公式 Ι € u ΝιϕΠk Νι n Νϕl计算相关菌株的相似系数 Ι o其中 Νι !Νϕ分别为两样品显示的总带
数 oΝιϕ为两样品共有的显示带数 o距离 ∆ € t p Ιk‘¨¬ot|{z¤l ∀用 ‘¨¬ª«¥²µ2²¬±¬±ª分别对所有菌株和系统间
的相似系数进行聚类 o得到相应的系统进化树k‘¨¬ot|{z¥l ∀相似系数的计算和系统聚类分析均由 ‘·¶¼¶u1su
分析软件完成 ∀
2 结果与分析
u1t • „°⁄扩增结果及聚类分析 x个引物对 „ƒtt个菌株进行 °≤• 扩增 o每个引物扩增条数为 tv ∗ ty
条 o扩增片断的分子量在 s1u ∗ u ®¥之间 o共扩出 zx个 • „°⁄标记 o其中 zs个标记都出现多态性 o表明供试
菌株表现出丰富的遗传多样性 ∀
图 t „ƒ菌株 • „°⁄遗传相似性聚类树状图
ƒ¬ªqt ⁄¨ ±§µ²ªµ¤° ²©¦¯∏¶·¨µ¤°²±ª „ƒ
¬¶²¯¤·¨¶¥¤¶¨§²± • „°⁄¤±¤¯¼¶¬¶
对 tt个菌株遗传多样性进行聚类分析表明 o相同菌种不同菌
株之间在亲缘关系上要近于不同菌种间的亲缘关系 o在遗传距离
为 y1x时把 tt个 „ƒ 菌株分为 w个类群 }第 t个类群为 Γλοµυσ
χονστριχτυµ o包括 ≤≤ !≥≤ 和 ≥≤ ~第 u个类群为 Γλοµυσ χορονατυµ
和 Γλοµυσ µονοσπορυµ o包括 ≥≤²µ!‘ 和  ~第 v 个类群为
Γλοµυσιντραραδιχεσo包括 ‘Œ!≥Œ!≥Œ和 Œ~第 w个类群为 Γλοµυσ
φασχιχυλατυµk׫¤¬·¨µl o只有 ≤ƒk图 tl ∀从系统进化角度可以看出
第 t个类群和第 u个类群亲缘关系较为接近 o第 v个类群和第 w个
类群亲缘关系较为接近 ~不同宿主林木各菌株间的亲缘关系也存
在着差别 o在遗传距离为 x1s时第 t个类群 Γλοµυσχονστριχτυµ 由于
宿主的不同分为刺槐 ≤≤ !沙棘 ≥≤和沙枣 ≥≤ v个菌株 o第 u个
类群中的 Γλοµυσ µονοσπορυµ o分为柠条 ‘ 和枣  u个菌株 ∀
u1u „ƒ种内及种间遗传相似性分析 不同宿主各菌株间存在
着丰富的种内遗传多样性 o来自枣和沙棘的 u个菌株 ≥≤ 和 ≥≤
相似性为 {s1ss h o来自柠条和枣 ‘ 和  的菌株相似性为 zx1ss h o来自柠条和沙枣 ‘Œ和 ≥Œ菌株相
似性为 yx1ss h k表 ul ∀相似性在 yx1ss h ∗ {s1ss h之间 o多态性达到 us1ss h ∗ vx1ss h o表明在物种演化过
程中 o„ƒ与宿主之间互相选择 o形成了具有特殊结构的共生体 o宿主自身的遗传特性诱导来自于同源的遗
传信息发生了变异 o并选择性的保留了这些变异 ∀这种对特殊宿主选择性的基因变异最终导致了 „ƒ的遗
传分化 o形成了对宿主的不同适应型 ∀
zut 第 t期 唐 明等 }x种林木的 tt个丛枝菌根菌株分子遗传初步研究
表 2 ΑΜΦ11 个菌株 Ρ ΑΠ∆ 谱带相似矩阵
Ταβ . 2 Σιµιλαριτψ µατριξ αµ ονγ Ρ ΑΠ∆ βανδσ οφ 11 ισολατεσ οφ ΑΜΦ
菌株
Œ¶²¯¤·¨ ≤≤ ≥≤ ≥≤ ‘Œ ≥Œ ≥Œ Œ ≤ƒ ≥≤²µ ‘ 
≤≤ t1sss s
≥≤ s1zyy s t1sss s
≥≤ s1zxs s s1{ss s t1sss s
‘Œ s1tzv | s1uvu y s1uzu z t1sss s
≥Œ s1usw t s1uys | s1u|z | s1ztt t t1sss s
≥Œ s1s|s | s1s|z y s1twu | s1yxs s s1zww u t1sss s
Œ s1t|s x s1usx t s1uxs s s1y{w u s1y{u | s1zzz { t1sss s
≤ƒ s1uvu y s1vxs s s1v|s u s1vx| s s1v{t s s1uzs v s1u{x z t1sss s
≥≤²µ s1vyv y s1xvy y s1xuv { s1tss s s1tv| x s1szw u s1sxx y s1uty u t1sss s
‘ s1vuy x s1v|t v s1wux x s1uuu u s1vvv v s1t{y s s1s|z y s1twu | s1vzu t t1sss s
 s1u{x z s1v|t v s1wux x s1tzz { s1us{ v s1s|v s s1s|z y s1uv{ t s1wyx t s1zxs s t1sss s
3 结论与讨论
通过对不同宿主林木的 tt个 „ƒ菌株进行 • „°⁄分析 o在遗传距离为 y1x时可以把它们分为 Γλοµυσ
χονστριχτυµ oΓ qχορονατυµ 和 Γ qµονοσπορυµ oΓ qιντραραδιχεσoΓ qφασχιχυλατυµ w个类群 o在遗传距离为 x1s时由于
宿主的不同分为不同的菌株 ∀不同菌株和不同树种都影响菌种的亲缘关系 o同种菌根真菌虽然有共同的起
源 o但由于受宿主的选择和环境的胁迫 o产生不同的表型和遗传型的分化 ∀
„ƒ菌株种内及种间遗传相似性分析表明 o相同生态条件同种宿主不同菌种间存在着丰富的种间遗传
多样性 o不同种宿主各菌株间也存在着相当丰富的种内遗传多样性 ∀从遗传相似性来看 o不同宿主各菌株间
遗传相似性高于相同宿主不同菌种之间的遗传相似性 o说明菌种 !宿主林木都和 „ƒ遗传相似性具有相关
性 o在 „ƒ的遗传分化上菌种的作用要高于宿主林木对其的影响 ∀因此 o在菌根技术应用中依据适地 !适
树 !适菌的原则 o从菌株与树木最佳组合 !菌株与生态条件最相适应筛选菌株 o建立该区域林木和菌根真菌共
生体系的优化措施至关重要 ∀
参 考 文 献
李晓林 o冯 固 qusst q丛枝菌根生理生态 q北京 }华文出版社
≤«¨ ± ≠¬±ª¯²±ªoŠ²±ª ¬±ª´¬±o…¨ µ±¬¨ ⁄¨ ¯¯ qt||| q˜¶¨ ²© °²¯ ¦¨∏¯¤µ¥¬²¯²ª¬¦¤¯ ·¨¦«±¬´∏¨¶·²¶·∏§¼ °¼¦²µµ«¬½¤}¤§√¤±¦¨ ¤±§³¨µ¶³¨¦·¬√¨ q≥²¬¯ ¤±§∞±√¬µ²±° ±¨·¤¯
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¤±§µ¨ ¤¯·¨§ °¼¦²µµ«¬½¤¯ ©∏±ª¬q ‘¨º °«¼·²¯ otvv }tsv p ttt
‘¨¬ qt|{z¤q∞¶·¬°¤·¬²± ²©¤√ µ¨¤ª¨ «¨·¨µ²½¼ª²¶¬·¼ ¤±§ª¨ ±¨ ·¬¦§¬¶·¤±¦¨ ©µ²° ¤¶°¤¯¯ ±∏°¥¨µ²©¬±§¬√¬ª∏¤¯¶q Š¨ ±¨ ·¬¦¶o{| }x{v p x|s
‘¨¬ qt|{z¥q ²¯ ¦¨∏¯¤µ √¨²¯∏·¬²±¤µ¼ ª¨ ±¨ ª¨ ±¨ ·¬¦¶q ‘¨º ≠²µ®}≤²¯∏°¥¬¤ ˜±¬√¨ µ¶¬·¼ °µ¨¶¶
°«¬¯¯¬³¶  o ‹¤¼°¤± ⁄≥ qt|zs qŒ°³µ²√¨ §³µ²¦¨§∏µ¨¶©²µ¦¯ ¤¨µ¯¬±ª¤±§¶·¬±¬±ª³¤µ¤¶¬·¬¦¤±§∂ „ƒ ©²µµ¤³¬§¤¶¶¨¶¶° ±¨·²©¬±©¨¦·¬²±q×µ¤±¶…µ¼¦²¯ ≥²¦oxx }
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• §¨¨¦®¨µ⁄o ²µ·²±…o…µ∏±¶× ⁄qusss q²¯ ¦¨∏¯¤µ³«¼¬²ª¨ ±¼ ²©·«¨ ¤µ¥∏¶¦∏¯¤µ°¼¦²µµ«¬½¤¯ ©∏±ª¬Γλοµυσσινυοσυµ ¤±§ Σχλεροχψστισχορεµιοιδεσq¼¦²¯²ª¼ o|u
kul }u{u p u{x
≥¤±§¨µ¶Œ • o „¯· oŠµ²³³¨ Žo ετ αλqt||x qŒ§¨±·¬©¬¦¤·¬²± ²©µ¬¥²¶²°¤¯ ⁄‘„ ³²¯¼°²µ³«¬¶°¶¤°²±ª¤±§º¬·«¬±¶³²µ¨¶²©·«¨ Š¯ ²°¤¯ ¶¨}¤³³¯¬¦¤·¬²±·²¶·∏§¬¨¶²±
·«¨ ª¨ ±¨ ·¬¦§¬√ µ¨¶¬·¼ ²©¤µ¥∏¶¦∏¯¤µ°¼¦²µµ«¬½¤¯ ©∏±ª¤¯ ¦²°°∏±¬·¬¨¶q ‘¨º °«¼·²¯ otvs }wt| p wuz
≥¬°²±o¤¯²±§¨  o…µ∏±¶× ⁄qt||u q ≥³¨¦¬©¬¦¤°³¯¬©¬¦¤·¬²± ²© t{≥ ©∏±ª¤¯ µ¬¥²¶²°¤¯ ª¨ ±¨ ¶©µ²° √¨ ¶¯¦∏¯¤µp¤µ¥∏¶¦∏¯¤µ ±¨§²°¼¦²µµ«¬µ¤¯ ©∏±ª¬¦²¯²±¬½¬±ªµ²²·¶q
„³³¯¬¨§¤±§∞±√¬µ²±° ±¨·¤¯ ¬¦µ²¥¬²¯²ª¼ ox{ }t{z p t|w
• ¼¶¶° o…²±©¤±·¨ ° qt||v q „°³¯¬©¬¦¤·¬²± ²©ª¨ ±²°¬¦⁄‘„ ²©¤µ¥∏¶¦∏¯¤µ°¼¦²µµ«¬½¤¯k„l ©∏±ª¬¥¼ °≤• ∏¶¬±ª¶«²µ·¤µ¥¬·µ¤µ¼ ³µ¬° µ¨¶q ¼¦²¯²ª¬¦¤¯ • ¶¨¨¤µ¦«o
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k责任编辑 朱乾坤l
{ut 林 业 科 学 wu卷