全 文 ：第 ww卷 第 w期
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林 业 科 学
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松材线虫病早期寄主薄壁细胞的死亡方式 3
厉 艳t ou 叶建仁t
kt1 南京林业大学 南京 utssvz ~u1 青岛出入境检验检疫局 青岛 uyysssl
摘 要 } 研究黑松苗接种松材线虫后 o被侵染早期寄主薄壁细胞死亡的过程和方式 ∀应用荧光显微技术观察到 o
接种后松苗皮层薄壁细胞陆续发生程序性死亡 o表现为核染色质浓缩并在核膜下/半膜状0呈新月形凝集以及核变
形 !降解 !不规则碎裂直至解体等细胞凋亡的典型特征 o这与自然干枯萎蔫的松苗细胞坏死有显著差异 ∀产生细胞
凋亡现象不仅发生在接种点附近 o而且还出现在线虫未到达的远离接种点部位 o细胞凋亡数量和程度随着时间的
推移和线虫在松苗体内不断扩散分布而逐步增加 ∀在松材线虫致使松树萎焉的过程中寄主细胞发生了程序性死
亡 o并提供了寄主松树感染线虫后发生细胞程序性死亡的有关细胞学证据 ∀在植物组织上应用碘化丙锭荧光染色
法研究植物细胞的程序性死亡 o该技术可以作为今后植物细胞程序性死亡研究的重要方法 ∀
关键词 } 松材线虫病 ~细胞程序性死亡 ~碘化丙锭荧光染色
中图分类号 }≥zyv1t 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kuss{lsw p ss|x p sw
收稿日期 }ussy p s{ p st ∀
基金项目 }国家自然科学基金资助项目kvswztv|ul ∀
3 叶建仁为通讯作者 ∀
∆εατη Μαννερ οφ Ηοστ Παρενχηψµατουσ Χελλσιν Ινφεχτινγ Εαρλψ Σταγε οφ Πινε Ωιλτ ∆ισεασε
¬≠¤±tou ≠¨¬¤±µ¨±t
kt q Νανϕινγ Φορεστρψ Υνιϖερσιτψ Νανϕινγ utssvz ~u1 Θινγδαο Ινσπεχτιον ανδ Θυαραντινε Βυρεαυ Θινγδαο uyysssl
Αβστραχτ } …¼¬±²¦∏¯¤·¬±ª³¬±¨ k Πινυστηυνβεργιιl ¶¨ §¨¯¬±ª¶º¬·«³¬±¨ º²²§±¨ °¤·²§¨ k Βυρσαπηελενχηυσξψλοπηιλυσl o·«¨ §¨¤·«
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松材线虫病又名松树枯萎病 o是由松材线虫k Βυρσαπηελενχηυσ ξψλοπηιλυσl引起的一种毁灭性森林病害 o可
危害 vy种松属植物和 {种非松属植物 ∀该病发展速度快 o死亡率高 o被称为/森林癌症0 ∀已有的组织病理
学研究表明 o松树对松材线虫侵染的第一个明显组织病理学反应是其皮层和木质部的轴向和射线薄壁细胞
的死亡 ∀感染松材线虫病的植株最终因木质部管胞空穴化导致水分疏导功能受阻而枯萎死亡 o而管胞栓塞
的产生和空穴化则是由木质部薄壁细胞变性死亡引起的k≥∏ª¤º¤ot|{u ~ ¤°¬¼¤ot|{x ~ƒ∏®∏§¤ ετ αλqot||zl ∀
细胞死亡可分为 u种基本类型 }细胞程序性死亡或细胞凋亡k³µ²·µ¤°°¨ § ¦¨¯¯ §¨¤·«o°≤⁄l和细胞坏死
k±¨ ¦µ²¶¬¶l o前者是一种生理性的细胞死亡 o是由个体自身基因控制的细胞主动死亡过程kŽ¨µµετ αλqot|zul ~
而后者是细胞在遭受到强烈有害刺激时出现的一种被动的 !突发性的死亡 ∀ °≤⁄作为生物体内广泛存在的
一种机体自我调整机制 o是生命活动的一个重要组成部分 o近年来受到广泛关注 ∀本研究从寄主植物细胞死
亡方式的角度 o研究分析松材线虫病早期寄主薄壁细胞是否发生程序性死亡 o以揭示松材线虫的致病机制 ∀
对检测外界因子诱导植物 °≤⁄o已有的报道大都采用 ⁄‘„片段分析等生化检测或是电镜观察k林久生
等 ousss ~苏金为等 oussu ~金刚等 oussyl ∀本研究采用碘化丙锭荧光显微技术 o按时间进程和与接种点距离
的不同分段采样分析 o以确定在松材线虫病感染早期寄主薄壁细胞发生的变化及其引起寄主细胞死亡的方
式 ∀
t 材料与方法
111 接种虫株
供试的松材线虫来源于浙江自然感病的马尾松k Πινυσ µασσονιαναl ∀经贝曼分离技术分离松材线虫k方
中达 ot||{l o消毒处理后 o于灰葡萄孢k Βοτρψτισχινερεαl菌落上 ux ε 下培养 y ∗ z §后 o备用 ∀
112 接种材料
t年生黑松k Πινυστηυνβεργιιl实生苗 o平均苗高 tx ¦°o直径k茎中段ls1v ¦°o购自当地苗圃 o于培养室内
适应生长 t个月后待用 ∀
113 接种方法
选取生长基本一致的 t年生黑松幼苗 o采用人工皮接法接种 ∀即用锋利的解剖刀在梢头下约 t1x ¦°处
的茎干一侧向下纵切一呈/ ×0字型的伤口 o长约 s1x ¦°o深达木质部 o撕开韧皮部 o用封口膜在伤口部位围成
一小漏斗 o放入一合适大小的脱脂棉球 o然后用微量进样器注入线虫悬浮液k接种量约为每株 t {ss条l o以
注射无菌水做对照 „组 ∀再用透明胶布固定并封住漏斗上部保湿 o置 ux ∗ vs ε 下生长 o定期浇水 ∀另设对
照 …组 o不做伤口 o而且始终不浇水 o使其缺水而自然干枯 ∀
114 荧光显微技术
t1w1t 石蜡切片制备 分别于接种后 tu !uw !vy !, !usw !uu{ «每隔 tu «定期对处理和对照 „组分段取样 ∀
对照 …组待其萎蔫的形态与接种线虫的松苗外部症状相似时取样 o取样部位与接种材料一致 ∀
以接种部位为参照 o自接种部位最低点向下每隔 s1x ¦°切取 s1x ¦°茎段做分析样品 o纳瓦兴 ¶固定液
kt h铬酸Βts h醋酸Β福尔马林 ts °Β蒸馏水 ws °€ vΒuΒtΒwl中固定 uw «o梯度乙醇脱水 o二甲苯透明 o石蜡
包埋 o切片厚度 z Λ°∀
t1w1u 碘化丙锭荧光染色 染色液配制 }碘化丙锭 k³µ²³¬§¬∏°¬²§¬§¨ o°Œo购自上海华舜生物工程有限公司lx
°ªo• ‘„酶k无 ⁄‘„酶活性ltss °ªo含 s1t h ×µ¬·²±÷ p tss的 °…≥缓冲溶液k购自南京生兴生物技术有限公
司ltss °o将碘化丙锭溶于缓冲液后 o加入 • ‘„酶避光保存 ∀
染色步骤 }将干燥后的石蜡切片按常规脱蜡 o经梯度乙醇逐级降低入蒸馏水中洗 ~°Œ荧光染色液室温下
避光染色 vs °¬±∀染色后 ¨¬¦¤vst p t{x1tsw p sss荧光显微镜镜检 o yss ±°激发光下观察 o≤¤±²± °²º¨ µ¶«²·
xxs照相 ∀
u 结果与分析
211 松材线虫病早期寄主薄壁细胞死亡方式
°Œ荧光染色观察结果表明 ot年生黑松苗接种线虫后 o其皮层薄壁细胞出现了明显的细胞凋亡特征 }首
先是细胞核内的染色质出现不规则凝集 o进而凝集加剧 o细胞核开始变形k图版 ´ p tl o浓缩的染色质集中分
布在核周围 o中间出现无 ⁄‘„的区域k图版 ´ p ul o导致致密的 !分离的 !边界清晰的半月形的染色质颗粒集
中于核膜边缘k图版 ´ p vl ~染色质浓缩过程伴随有核膜及细胞膜的内陷 o形成瘤状突起突出到核外形成凋
亡小体k图版 ´ p w !xl o最后核膜消失 o核碎裂成大小不等的圆形小体 o并被细胞膜所包绕k图版 ´ p yl o最终
细胞内充满凋亡小体 o而细胞核周只剩下少量 ⁄‘„残余k图版 ´ p z !{l ∀整个过程中细胞膜完整性不断丧
失 o通透性不断增加 o细胞核染色逐渐加深或变亮黄 o而细胞壁完整 o胞浆内含线粒体等细胞器形态较完整 o
稳定性较高 ∀对照 „组皮层薄壁细胞形态健康正常 o表现为细胞核圆形或椭圆形 o呈现均匀明亮的红色荧
光 o线粒体等细胞器形态清晰完整k图版 ´ p |l ∀对照 …组皮层薄壁细胞则大面积普遍表现为坏死的形态特
征 o细胞核核形较完整 o但被 °Œ染色后发出强烈的亮黄色荧光 o表明膜完整性已丧失 o细胞质溶解释放 o细胞
器损坏或消失 o且无凋亡小体形成k图版 ´ p tsl ∀
212 松材线虫病早期寄主薄壁细胞凋亡的变化规律
通过对寄主组织随接种时间的推移分段取样观察发现 }松树感染松材线虫后 o体内薄壁细胞凋亡现象不
是偶然出现的 o也不是在某一茎段出现的 ∀它不仅发生在接种点附近 o而且在线虫还没有移动到的远离接种
y| 林 业 科 学 ww卷
点的部位 o其组织细胞也出现了明显的细胞凋亡特征 ∀尤其是皮层薄壁细胞发生程序性死亡的数量和程度
是随着时间的推移和线虫在松苗体内不断扩散分布而逐步增加的 ∀
相同接种时间 o细胞凋亡的数量和程度与距离接种点的远近有关 o离接种点越近 o发生凋亡的细胞数量
越多 ∀当接种 tu «时 o松苗接种点附近ks1x ∗ t ¦°l少量皮层薄壁细胞已经明显表现出早期凋亡的特征 o而
远离接种点部位kx1x ∗ y ¦°l的细胞还未出现可见的凋亡现象 ~接种 w{ «后 o当 x1x ∗ y ¦°部位的部分皮层
薄壁细胞的细胞核已有可见的染色质固缩和新月形凝集于核膜一边时 os1x ∗ t ¦°部位的皮层薄壁细胞已经
有较多细胞进入了凋亡的晚期 ∀之后 o发生程序性死亡的细胞陆续增多 o松苗组织褐变纵向由远及近变深 o
横向由内及外变深 ∀但是随着接种时间的推进 o细胞凋亡程度的不断加重 o与接种点距离远近的差别就日渐
缩小 ∀到接种 tus «的时候 o整株松苗茎部的皮层薄壁细胞都已表现凋亡晚期的特征 ∀
同样 o与接种点距离相同部位的细胞其发生凋亡的数量和程度与接种时间的长短有关 ∀本研究从接种
tu «后开始取样 o发现在 s1x ∗ t ¦°处个别散在的皮层薄壁细胞此时已经表现出细胞凋亡的特征 o表明松材
线虫侵染最初引起的寄主细胞程序性死亡的发生时间是 tu «或更早些 o而这些发生程序性死亡的薄壁细胞
细胞壁完整 o显然没有受到线虫的直接机械损坏 ∀之后 o随着时间推进 o表现出凋亡特征的细胞愈来愈多 o但
即使是同一部位相邻的几个细胞 o其表现凋亡的程度也不一定相同 o往往是既有凋亡早期细胞又有凋亡晚期
细胞 o或者是凋亡晚期细胞与死亡细胞并存 o而此时大多数树脂道泌脂细胞都未出现明显病变 ∀接种 tus «
时 o树脂道泌脂细胞和射线细胞相继破坏死亡 o随后 o形成层和髓部细胞也陆续表现出明显的病变死亡 o线虫
开始大面积扩散 o直至 uu{ «时 o松苗茎部所有的轴向和射线薄壁细胞都已死亡 o细胞器消失 o形成层和髓部
的细胞也普遍死亡 o皮层中多数细胞破裂严重 o出现大面积空洞 ∀
v 讨论
形态学观察是鉴定细胞凋亡的基本方法 o人们常用光学显微镜和电子显微镜来检测凋亡 ∀电镜观察是
证明 °≤⁄最可靠的方法 o可观察细胞的超微结构 o可以同时反应细胞的完整性 !细胞质中细胞器的改变 !细
胞核及染色质的改变 !/凋亡小体0的形成等 ∀但其观察视野小 o而植物发生 °≤⁄的细胞数比率小 o持续时间
短 o有时序性 o研究难度相对要大 ∀本研究是对松材线虫侵染引起寄主细胞死亡方式的首次分析 o需要大量
取样观察 o在没有明确时间与部位的前提下 o选择光学显微镜观察较为适宜 ∀本研究中尝试了 °Œ荧光染色
法来检测植物细胞凋亡 o°Œ染色液可与细胞核 ⁄‘„染色 o在  yss ±°激发光下显示出 °≤⁄中细胞核的变
化 ∀试验表明 °Œ单染法可以用于检测植物细胞程序性死亡 ∀
虽然凋亡与坏死有本质的区别 o且通常把凋亡与坏死看成是细胞相互排斥的选择 o即细胞要么凋亡要么
坏死 o但是 o在一定条件下又有一定的联系 ∀大量试验表明 }凋亡与坏死可相继发生 o许多因素如氧自由基 o
既可以引起凋亡也可以引起坏死 o在一定条件下凋亡模式的死亡可以转化为坏死模式的死亡k程尉新等 o
t||{l ∀松材线虫作为一种生物因子可能对寄主植物产生了某中程度的胁迫 ∀当植物受到胁迫时 o会因为胁
迫程度的不同而表现为坏死或程序性死亡 o⁄‘„被随机降解还是被有规律的降解成 ⁄‘„梯是 u种死亡方式
的重要区别k¬·¯ µ¨ετ αλqot||xl ∀越来越多的证据表明活性氧和抗氧化酶参与了细胞的程序性死亡过程
k¤¥¶ot|||l ∀在参与细胞程序性死亡的活性氧和抗氧化酶中 o通常认为 ‹u ’u 和 ≤„× 是最重要的 o使 ‹u ’u
增加或者抑制 ≤„×的表达都能引起细胞的程序性死亡k¦≤¤¥¨ ετ αλqot||zl o氧化应激介导 °≤⁄的可能机制
是活性氧 !自由基直接通过影响基因转录 o改变细胞的表型特征 o或作用于细胞膜 o诱发膜脂过氧化 o从而影
响细胞的信号传递 o激发有关的基因调控 o导致细胞凋亡k李忌等 ot||zl ∀
陈玉惠kussul研究发现 o黑松幼苗接种松材线虫后 o早期ktu «l膜脂过氧化产物 ⁄„k丙二醛l含量增加
较缓慢 o后期kzu «l累积大幅加速 ∀ ⁄„是膜脂质过氧化的主要产物之一 o其含量的增加可以表示细胞膜脂
质过氧化程度的加重 o同时伴随着细胞质膜相对透性的增加 ∀线虫侵染也可导致黑松幼苗内超氧化物歧化
酶k≥’⁄l和过氧化氢酶k≤„×l活性的变化 o接种早期 ≥’⁄在 tu «活性有所增加 otu «后开始小幅度下降 o至
zu «时则大幅下降 ~≤„×则是 tu «时活性降低 ozu «后大幅度下降 ∀≥’⁄和 ≤„×是植物机体内清除活性氧 !
自由基的抗氧化酶 o其活性大幅下降意味着清除能力减弱 o造成活性氧 !自由基的累积 ∀在镉诱导的茶树细
胞程序性死亡中 o随诱导时间的延长 o茶树幼苗体内 ≥’⁄!≤„×和 ⁄„也发生了类似的活性变化趋势 o镉胁
迫下 o幼苗膜脂过氧化可能是诱发 °≤⁄的主要原因 ∀生物体受到胁迫时 o会因为胁迫程度的不同而表现为
z| 第 w期 厉 艳等 }松材线虫病早期寄主薄壁细胞的死亡方式
坏死或 °≤⁄o低浓度活性氧 !自由基诱导细胞凋亡 o高浓度则导致细胞坏死k苏金为等 oussul ∀在松材线虫侵
染引起寄主细胞 °≤⁄中 o活性氧和抗氧化酶是否参与了早期薄壁细胞的程序性死亡过程 o发展期细胞的命
运如何 o是否转化为细胞坏死 o值得进一步探讨 ∀
植物界关于细胞程序性死亡的研究处于起步阶段 o目前研究大都限于确定 °≤⁄现象的存在 o至于它如
何受控于细胞基因 o在什么生理状态下启动 o还知之甚少 ∀尽管如此 o本研究首次在细胞形态学基础上对松
材线虫侵染感病寄主后早期细胞死亡的方式进行了检测 o并结合细胞死亡的过程做了较系统的对比和分析 o
发现寄主细胞病变的数量和程度变化与线虫的侵染扩散之间有一定的规律可循 o为松材线虫病侵染感病寄
主早期可诱发植物 °≤⁄过程提供了细胞学证据 ∀这些结果对进一步确定寄主细胞死亡的病因和阐明松材
线虫病致病机理具有十分重要的意义 ∀
参 考 文 献
陈玉惠 qussu q松材线虫与寄主植物互作中的生理生化研究 q南京林业大学博士学位论文 q
程尉新 o金丽娟 qt||{ q细胞凋亡与坏死的鉴别及研究方法 q细胞生物学杂志 ouskul }x{ p x| q
方中达 qt||{ q植病研究法 q北京 }中国农业出版社 qvs{ q
李 忌 o郑荣梁 qt||z q活性氧诱导细胞凋亡 q细胞生物学杂志 ot| }ttx p tt| q
林久生 o王根轩 qusss q≤’u 倍增对渗透胁迫下小麦叶片抗氧化酶类及细胞程序性死亡的影响 q植物生理学报 ouykxl }wxv p wxz q
金 刚 o叶建仁 qussy q植物细胞程序性死亡k°≤⁄l分析测试方法的进展 q山西农业大学学报 ouykul }ttv p tt{ q
苏金为 o王湘平 qussu q镉诱导的茶树苗膜脂过氧化和细胞程序性死亡 q植物生理与分子生物学学报 ou{kwl }u|u p u|{ q
ƒ∏®∏§¤Žo‹²ª¨·¶∏× o≥∏½∏®¬Žqt||z q°«¼¶¬²¯²ª¬¦¤¯ ³µ²¦¨¶¶²©·«¨ ¶¼°³·²° §¨ √¨ ²¯³°¨ ±·¤±§µ¨¶¬¶·¤±¦¨ ° ¦¨«¤±¬¶°¬± ³¬±¨ º¬¯·§¬¶¨¤¶¨ qƒ²µ≥²¦ot||z ou }tzt
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≥∏ª¤º¤× qt|{u q ’¦¦∏µµ¨±¦¨ ¬©·µ¤∏°¤·¬¦µ¨¶¬± ¦¤±¤¯¶¤±§¦¼·²¯²ª¬¦¤¯ ¦«¤±ª¨ ²©³¤µ¨±¦«¼°¤ ¦¨¯¯¶¬±·«¨ ¶·¨° ²©¤³¤±¨ ¶¨ ¥¯¤¦® ³¬±¨ ¶∏©©¨µ¬±ª©µ²° ³¬±¨ º²²§
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k责任编辑 朱乾坤l
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