全 文 ：第 wv卷 第 {期
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林 业 科 学
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早竹 ΤΒ1同源基因的克隆和表达分析 3
金群英t 林二培u 彭华正t 桑庆亮u 华锡奇t
kt q浙江省林业科学研究院生物技术研究所 杭州 vtssuv ~ u q浙江大学生命科学学院 植物生理生化国家重点实验室 杭州 vtssx{l
摘 要 } 竹笋的形成和生长发育过程涉及侧枝形态发生 o探讨侧枝发育有关基因在竹笋发育过程中的作用 o对于
阐明竹笋发育基因调控机制有重要意义 ∀利用禾本科 ΤΒ1 同源基因在序列上的保守性 o在基因上游的非编码区设
计简并引物 o通过 • ×2°≤• 技术 o从早竹笋中克隆到一个 t u|y ¥³的 ¦⁄‘„序列 o该序列包含 t个编码 vw|个氨基酸
的阅读框 o在氨基酸水平上与玉米 ΤΒ1 相似性达 yw1z h o定名为 ΠπΤΒ1 ∀序列分析比对表明 oΠπΤΒ1 基因的编码产
物含有保守的 ≥°区 !×≤°区和 • 区 o属于基因家族的 t个成员 ∀进化分析进一步表明 o竹子 ΤΒ1 相似基因是玉米
ΤΒ1 基因的同源基因 o且竹子 ΤΒ1 同源基因的分歧时间介于水稻和现有其他 ΤΒ1 同源基因之间 ∀ • ×2°≤• 分析表
明 o该基因在笋 !叶片和花中均有表达 ∀原位杂交分析表明 oΠπΤΒ1 在笋的侧芽中表达较多 ∀研究表明 oΠπΤΒ1 很
可能与禾本科其他植物的 ΤΒ1 同源基因相似 o在竹笋发育过程中 o参与侧枝的形成 ∀另外 oΤΒ1 同源基因也可能在
竹子分类和进化研究上有重要价值 ∀
关键词 } 早竹 ~竹笋发育 ~ ΤΒ1 同源基因
中图分类号 }≥zt{1wy ~ ±|wv1u ~≥z|x 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kusszls{ p sswt p sz
收稿日期 }ussy p sz p uy ∀
基金项目 }国家自然科学基金项目kvsxztxt|l和浙江省自然科学基金项目kvswwtw o ≠vsxvtzl资助 ∀
3 彭华正为通讯作者 ∀
Χλονινγ ανδ Εξπρεσσιον Αναλψζινγ οφ ΤΒ1 Ηοµολογουσ Γενειν Πηψλλοσταχηψσϖιολασχενσ
¬± ±∏±¼¬±ªt ¬± ∞µ³¨¬u °¨ ±ª ‹∏¤½«¨ ±ªt ≥¤±ª±¬±ª¯¬¤±ªu ‹∏¤ ÷¬´¬t
kt1 ΒιοτεχηνολογψΙνστιτυτε o Ζηεϕιανγ Φορεστρψ Αχαδεµψ Ηανγζηου vtssuv ~ u1 Στατε Κεψ Λαβορατορψοφ Πλαντ Πηψσιολογψ ανδ Βιοχηεµιστρψ
Χολλεγε οφ Λιφε Σχιενχεσo Ζηεϕιανγ Υνιϖερσιτψ Ηανγζηου vtssx{l
Αβστραχτ } °µ¨√¬²∏¶¶·∏§¬¨¶µ¨√¨ ¤¯ §¨¶²°¨ ¤±¤·²°¬¦¤±§³«¼¶¬²¯²ª¬¦¤¯ °¨ ¦«¤±¬¶°¤¥²∏·¥¤°¥²²¶«²²·§¨√¨ ²¯³°¨ ±·q…∏·¯¬·¯¨¬¶
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¦¯²±¨ §©µ²° ¥¤°¥²² ¶«²²·²© Πηψλλοσταχηψσ ϖιολασχενσ ¥¼ • ×2°≤• °¨ ·«²§ º¬·« §¨ª¨ ±¨ µ¤·¨§ ³µ¬°¨ µ¶¥¤¶¨§ ²± ·«¨ ¶¨ ∏´¨±¦¨
¦²±¶¨µ√¤·¬²± ²©°²¤¦¨¤¨ ΤΒ1 «²°²¯²ª²∏¶ª¨ ±¨ ¶qŒ·«¤¶¤± ²³¨ ± µ¨¤§¬±ª©µ¤°¨ ±¨¦²§¬±ªvw| ¤°¬±² ¤¦¬§¶º«¬¦« «¤¶yw1z h
¬§¨±·¬·¼ º¬·« °¤¬½¨ ΤΒ1 ¤±§·«∏¶¬¶±¤°¨ § ΠπΤΒ1 q≥¨ ∏´¨±¦¨ ¤¯¬ª±°¨ ±·¬±§¬¦¤·¨¶·«¤·°³×…t ¦²±·¤¬±¶≥°o×≤° ¤±§• §²°¤¬±
º«¬¦«¤µ¨ °¤¬±¦«¤µ¤¦·¨µ¬¶·¬¦¶²©×…t «²°²¯²ª¶¬± ×≤° ³µ²·¨¬±©¤°¬¯¼q°«¼¯²ª¨ ±¼ ¤±¤¯¼¶¬¶¬±§¬¦¤·¨¶·«¤··«¨ §¬√¨ µª¨±¦¨ ·¬°¨ ²©
¥¤°¥²² ΤΒ1 «²°²¯²ª¶¤µ¨ ¤¯·¨µ·«¤±µ¬¦¨ ΟσΤΒ1 ¥∏·¨¤µ¯¬¨µ·«¤±²·«¨µ°²¤¦¨¤¨ ΤΒ1 «²°²¯²ª¶qפ®¨ ±·²ª¨·«¨µo·«¨¶¨ ΤΒ12¯¬®¨
¶¨ ∏´¨±¦¨¶¤µ¨ ³µ²¥¤¥¯¼ ·«¨ ΤΒ1 «²°²¯²ª²∏¶ª¨ ±¨ ¶¬± ¥¤°¥²²q „¯·«²∏ª« • ×2°≤• ¬±§¬¦¤·¨¶·«¤·ΠπΤΒ1 ¬¨³µ¨¶¶¬²± ¦¤± ¥¨
§¨·¨¦·¨§¬±¯¨ ¤©o¥¤°¥²²¶«²²·¤±§¼²∏±ª©¯²µ¨·o·«¨ ιν σιτυ «¼¥µ¬§¬½¤·¬²±µ¨√¨ ¤¯¶·«¤··«¨ ª¨ ±¨ ¬¶«¬ª«¯¼ ¬¨³µ¨¶¶¨§¬±¤¬¬¯¯¤µ¼ ¥∏§
²©¥¤°¥²²¶«²²·q׫∏¶o ΠπΤΒ1 °¤¼ «¤√¨ ¶¬°¬¯¤µ©∏±¦·¬²± º¬·«¬·¶¦²∏±·¨µ³¤µ·¬± ªµ¤¶¶¤±§«¤¶·«¨ ³²·¨±·¬¤¯ ·² µ¨ª∏¯¤·¨ ·«¨
³µ²§∏¦·¬²±²©¥¤°¥²²¶«²²·qŒ± ¤§§¬·¬²±o ΤΒ1 «²°²¯²ª²∏¶ª¨ ±¨ ¶°¤¼ ¤¯¶² ¥¨ √¤¯∏¤¥¯¨²±·«¨ ¶·∏§¬¨¶²©¥¤°¥²²·¤¬²±²°¼ ¤±§
√¨²¯∏·¬²±q
Κεψ ωορδσ} Πηψλλοσταχηψσϖιολασχενσ~¥¤°¥²²¶«²²·§¨√¨ ²¯³°¨ ±·~ ΤΒ1 «²°²¯²ª²∏¶ª¨ ±¨ ¶
竹子是禾本科k°²¤¦¨¤¨ l植物中最大的一族 o全世界竹种总计 t uss种以上k方伟 ot||xl ∀竹子与水稻
k Ορψζα σατιϖαl !小麦k Τριτιχυµ αεστιϖυµl等其他禾本科植物有着显著的不同 o如快速生长能力 !较高的木质化程
度 !开花规律的独特性等 o并且常常形成大面积竹林 o成为森林资源的重要组成部分 ∀竹子地下茎k竹鞭l的
生长和繁殖规律是竹子最重要的特色之一 o按照地下茎的分枝类型 o竹子基本上可分为 v种 o即散生竹k单轴
型地下茎l !丛生竹k合轴型地下茎l和混生竹k兼有单轴和合轴型lk耿伯介等 ot||y ~¬ ετ αλqoussyl ∀竹鞭
上的侧芽在不同的发育阶段和环境中 o可长成新鞭 o也可以发育成竹笋 ∀竹笋的快速生长能力使竹子成为世
界上长得最快的植物 ∀因此 o竹笋发育过程的机制研究是竹子生长发育研究的热点 ∀
现有的研究大多从解剖和生理的角度来探讨竹笋发育过程的有关问题 o如张卓文等kt||yl研究了早竹
在不同发育阶段的解剖学特点 o根据笋形成过程中外部形态和内部结构变化 o将其划分为休眠期 !萌动期 !发
育前期 !发育中期 !发育后期及出笋期 ∀胡超宗等kt||yl检测了雷竹鞭侧芽在分化过程中的激素变化 o发现
Š„v !×和 Œ„„的浓度在分化前明显增加 ∀丁兴萃kt||zl研究了毛竹k Πηψλλοσταχηψσ εδυλισl笋体发育过程中不
同部位Œ„„ !Š„v 和 „…„的活性及含量变化 o发现在笋体生长初期Œ„„和 Š„v 的浓度极高 ∀更精确的酶联免
疫检测表明 o较高的生长素和细胞分裂素浓度与雷竹笋芽分化有关 o而较高的生长素浓度也与竹笋的进一步
快速生长状态相一致k黄坚钦等 oussul ∀上述研究虽然揭示了竹笋生长过程的一些特点 o但是存在一些问题
值得进一步探讨 o例如生长素对植物的形态发育调节非常重要 o生长素功能的发挥不仅与植物局部生长素浓
度有关 o还与植物生长激素受体的敏感性 !其他激素信号途径和发育相关基因的表达有关k • ²²§º¤µ§ ετ αλqo
ussxl ∀因此 o现有的仅从营养激素水平进行的研究有相当大的局限性 o有必要在此基础上开展竹笋发育基
因调控机制的研究 ∀另外 o由于竹笋并非均匀整体 o检测各种调控信号的空间分布是非常重要的 o而现有一
些取样和检测方法 o即便是单个笋的取样 o也容易把个体内部的内源激素差异相抵消 o难以合理地解释竹笋
的发育过程 o甚至容易得出错误的结论 ∀
竹笋的形成和生长发育过程涉及侧枝形态发生 o探讨侧枝发育有关基因在竹笋发育过程中的作用 o对于
阐明竹笋发育基因调控机制有重要意义 ∀现已发现参与侧枝发生的基因有的主要参与侧芽分生组织启动 o
也有的调控侧芽的长出k • ¤µ§ ετ αλqousswl ∀玉米k Ζεα µαψσl× ²¨¶¬±·¨ ¥µ¤±¦«¨§tk ΤΒ1l基因通常被认为是影响
侧芽的长出 o对于玉米的侧枝形成有重要的调控作用k⁄²¨ ¥¯ ¼¨ ετ αλqot||zl ∀目前 o该同源基因的研究主要
集中在水稻和高粱kΣοργηυµ βιχολορl等禾本科植物中kפ®¨ §¤ ετ αλqoussv ~Ž¨¥µ²° ετ αλqoussyl ∀最近 o对拟
南芥kΑραβιδοπσιστηαλιαναl ΤΧΠ基因家族序列和功能的深入研究发现 oΒΡΧ1有可能是 ΤΒ1基因在双子叶植物
中的同源基因k„ª∏¬¯¤µ2¤µ·¬±¨ ½ ετ αλqousszl ∀竹子是颇具特色的禾本科植物 o其侧枝发生过程较为复杂 o特
别是竹笋的形成和生长过程更是十分独特 o而目前尚无竹子 ΤΒ1同源基因的研究报导 ∀
早竹k Πηψλλοσταχηψσϖιολασχενσl是一个研究竹笋发育分子机制的重要模型 ∀一方面 o早竹出笋早 o出笋量
大 o是优良的笋用竹种 ~另一方面 o有关早竹出笋的生理生化机制已经有较多的研究基础k胡超宗等 ot||y ~
黄坚钦等 oussu ~何奇江等 oussxl ∀因此 o本文从早竹中克隆了 ΤΒ1 的相似基因 o通过序列进化分析 o以及
• ×2°≤• 和原位杂交等检测 o推测 ΠπΤΒ1很可能与禾本科其他植物 ΤΒ1 同源基因的作用相似 ∀另外 oΤΒ1 同
源基因也可能在竹子分类和进化分析上有重要价值 ∀
t 试验材料与方法
111 材料
早竹k Πηψλλοσταχηψσϖιολασχενσl !菲白竹k Πλειοβλαστυσφορτυνειl和乌脚绿竹k Βαµβυσα οδασηιµαεl样品均取自浙
江省林业科学研究院竹类植物园 ∀
112 核酸提取
⁄‘„提取样品来自嫩叶 o采用 ≤ׄ…法 ∀ • ‘„提取样品来自竹笋 o采用 וŒ’k……Œl提取k方法参照说
明书l o提取产物经电泳和吸光度检测完整性和纯度 o用于 • ×2°≤• 分析的 • ‘„样品 „uysΠu{s  u1s ∀
113 组织切片和原位杂交分析
切取竹笋顶端 s1x ¦°左右 ow h多聚甲醛磷酸缓冲液k³‹ z1slw ε 固定过夜 o酒精梯度脱水 o二甲苯脱
色 o石蜡包埋 o旋转切片机k¨¬¦¤ • utvxl切片 ts Λ° o镜检挑选完整切片 o按简化的原位杂交方法操作
k…µ¤¬¶¶¤±·ετ αλqot||{l ∀构建核酸探针的模板为包含 ΠπΤΒ1 编码区k≤⁄≥l的 ³…¯ ∏¨¶¦µ¬³·质粒 o反义和正义
• ‘„探针分别由 ×v和 ×z • ‘„聚合酶转录线性化后的质粒得到 ∀另外挑选的一部分切片用于埃希氏苏木
精染色 o常规组织切片分析 ∀
114 基因克隆和序列分析
基因克隆采用 …⁄≥„• ×א • „≤∞¦⁄‘„ „°³¯¬©¬¦¤·¬²± Ž¬·k≤¯ ²±·¨¦«l试剂盒的 vχ• „≤∞方法 o上游基因特异
性引物为·¥t©t }xχŠŠ„Š×≤≤≤„×≤„Š×„„„Š≤vχ ∀°≤• 扩增的片段经 ×2 ¤¨¶¼ k³µ²°¨ ª¤l克隆 o挑选 v个克隆进
行 „…Œvzz 测序 ∀从竹子基因组中克隆 ΤΒ1 同源基因片段 o采用引物为 ·¥t©t 和 ·¥tµt } xχ≤Š≤„×≤≤ŠŠ
××≤××≤×≤≤×׊Š×vχ o扩增程序为 }|w ε w °¬±~|w ε vs ¶ox{ ε ys ¶ozu ε t °¬±kvs循环l ~zu ε x °¬±∀序
uw 林 业 科 学 wv卷
列比对采用 ∂ ¦¨·²µ‘׌¶∏¬·¨|1s的组件 „¯¬ª±÷ 完成kª¤³²³¨ ±¬±ª ³¨ ±¤¯·¼ w oª¤³ ¬¨·¨±¶¬²± ³¨ ±¤¯·¼ s1u ¤±§ °„
³µ²·¨¬± º¨ ¬ª«·°¤·µ¬¬l ∀分子进化树由 ∞Š„v1t的邻接法k‘¨¬ª«¥²µ2²¬±¬±ªl构建 ot sss次重复置信度分析 ∀
115 ΡΤ2ΠΧΡ 检测
利用 …⁄ ≥„• ×א • „≤∞ ¦⁄‘„ „°³¯¬©¬¦¤·¬²± Ž¬·k ≤¯ ²±·¨¦«l进行逆转录 o检测引物为 ·¥t©u } xχ2
„ŠŠ„≤ŠŠ≤×≤≤„Š≤„Š≤≤×≤×2vχ o·¥tµu }xχ2Š×Š≤ŠŠŠ„ Š×„Š××≤ׄ„ׄ≤≤Š×2vχ ∀对照 °³„≤×t的扩增引物为
¤¦·2©t }xχ2××≤„×׊ Š×„׊Š„„Š≤׊≤׊2vχ和 ¤¦·2µt }xχ2Š×„Š≤×ׄ≤„׊Š≤„„ ŠŠ„≤×׊2vχ ∀所有 °≤• 产物
经测序确认 ∀
图 t ΤΒ1 同源基因推定氨基酸序列比对
ƒ¬ªqt „¯¬ª±° ±¨·²©·«¨ ³∏·¤·¬√¨¤°¬±²¤¦¬§¶¨ ∏´¨±¦¨ ²© ΤΒ1 «²°²¯²ª²∏¶ª¨ ±¨ ¶
°³×…1 !’¶×…1 !°×…1和 ⁄§×…1 分别为早竹 !水稻 !玉米和 ∆αντηονιοπσισ διντερι ΤΒ1 同源基因的推定氨基酸序列 ∀黑底白字表示氨
基酸相同 o黑底灰字表示保守 o灰底白字表示相似氨基酸 o虚线表示空缺 ∀保守区如图标识所示 o分为 ≥°区 !×≤°区和 • 区 ∀已报
导的 ∆δΤΒ1 基因的编码区尚不完整 o因此只能比较部分推定氨基酸序列 ∀
≥¨´ ∏¨±¦¨ ¤¯¬ª±° ±¨·²©·«¨ §¨§∏¦¨§¤°¬±² ¤¦¬§¶²© Πηψλλοσταχηψσ ϖιολασχενσ ΠπΤΒ1k⁄±{wuuuul o Ορψζα σατιϖα ΟσΤΒ1 k„≠u{yssul o Ζεα µαψσ
ΖµΤΒ1 k ΤΒ1 o˜|ww|wl ¤±§ ∆αντηονιοπσισ διντερι ∆δΤΒ1k„ƒvuutvwl º¤¶¦²±§∏¦·¨§ º¬·« „¯¬ª±÷ q • ª¨¬²±¶²©¬§¨±·¬·¼ kº«¬·¨ ¯¨ ·¨µº¬·« ¥¯¤¦®
¥¤¦®ªµ²∏±§l o¦²±¶¨µ√¤·¬²± kªµ¤¼ ¯¨ ·¨µº¬·«¥¯¤¦®¥¤¦®ªµ²∏±§l o¶¬°¬¯¤µ¬·¼ kº«¬·¨¯¨ ·¨µº¬·«ªµ¤¼ ¥¤¦®ªµ²∏±§l ¤±§ª¤³k§¤¶«¨ §l ¤µ¨ ¬±§¬¦¤·¨§q׫¨
≥° o×≤° ¤±§ • §²°¤¬± ¤µ¨ ³µ¨§¬¦·¨§¤¦¦²µ§¬±ª·²·«¨ ¦«¤µ¤¦·¨µ¬¶·¬¦¶²©°×…t1’±¯¼ ³¤µ·¬¤¯ ³∏·¤·¬√¨ ¤°¬±²¤¦¬§¶¶¨ ∏´¨±¦¨ ¬¶¦²±¶¬§¨µ¨§©²µ ∆δΤΒ1
¶¬±¦¨ ¬·¶¦²§¬±ª¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ¬¶∏±¦²°³¯ ·¨¨§q
u 结果与分析
211 ΠπΤΒ1是 ΤΒ1同源基因
根据水稻和玉米的 ΤΒ1 同源基因的保守性 o在 xχ˜×• k˜±·µ¤±¶¯¤·¨§ • ª¨¬²±l区设计特异性引物 o利用
vχ• „≤∞从早竹笋芽的 ¦⁄‘„样品中克隆到一个 t u|y ¥³基因片段 ∀该序列包含 t个编码 vw|个氨基酸的阅
读框 o在氨基酸水平上与玉米 ΤΒ1 相似性达 yw1z h o定名为 ΠπΤΒ1 ∀经 …„≥× 搜索 o发现 ΠπΤΒ1 与来自
∆αντηονιοπσισ διντερι的 ΤΒ1同源基因k ∆δΤΒ1l一致性最高 ∀推定氨基酸序列的比对表明k图 tl o°³×…t和
⁄§×…t的一致性达 zt1z h o和玉米为 yw1z h o和水稻则只有 yu1y h ∀ °³×…t含有保守的 ≥°区 !×≤°区和 •
区 o属于 ΤΧΠ基因家族的一个成员k图 tl ∀利用 ΠπΤΒ1 基因两端的特异性引物 o进一步从早竹基因组上克
隆到该基因 o证实该基因同已知的 ΤΒ1同源基因一样没有内含子 ∀上述基因序列组成和结构的相似性说明
ΠπΤΒ1很可能是 ΤΒ1的同源基因 ∀
vw 第 {期 金群英等 }早竹 ΤΒ1 同源基因的克隆和表达分析
为进一步分析竹子 ΤΒ1相似基因与已知 ΤΒ1同源基因的相互关系 o根据 ΠπΤΒ1序列特点 o从乌脚绿竹 !
菲白竹和苦竹k Πλειοβλαστυσ αµαρυσl的基因组中克隆到 ΤΒ1 相似基因片段 zwz ¥³o分别命名为 ∆εΤΒ1 !ΠφΤΒ1
和 ΠαΤΒ1 ∀ ⁄‘„序列比对表明 oΠπΤΒ1 与 ∆εΤΒ1 !ΠφΤΒ1 和 ΠαΤΒ1 的一致性分别为 |z1t h !|{1w h和 ||1u h
k图 ul ∀在此基础上 o利用 ∞Š„v1t进行了 ׅt同源物蛋白分子进化的重构 o计算机模拟分析表明该进化
树总体上具有较高的置信度k图 vl ∀从图中可以发现 o拟南芥推定的 ׅt同源物 …• „≤t与其他禾本科 ׅt
同源物的遗传距离较远 o水稻 ׅt同源物较早从禾本科植物中分离出来 o而竹子 ׅt同源物的分歧时间则
介于水稻和现有其他 ׅt同源物之间 ∀由于进化分析是证明同源基因的最有力证据k׫¨¬¶¶¨±oussxl o因
此 o上述结果进一步表明 ΠπΤΒ1 !∆εΤΒ1 !ΠφΤΒ1 和 ΠαΤΒ1 是 ΤΒ1 同源基因 ∀另外 o该拓扑结构暗示 o在竹亚
科内部 o混生竹种k菲白竹和苦竹l与散生竹种k早竹l的分歧时间较近 o与丛生竹种k乌脚绿竹l的分歧时间较
远 o这一结论与现有的关于丛生竹较为原始的竹种系统分类观点一致 ∀
图 u w个竹子 ΤΒ1 基因相似序列比对
ƒ¬ªqu „¯¬ª±° ±¨·²©·«¨ ©²∏µ¥¤°¥²² ΤΒ12¯¬®¨ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨¶
ΠπΤΒ1 !ΠαΤΒ1 !ΠφΤΒ1和 ∆εΤΒ1 分别表示早竹 !苦竹 !菲白竹和乌脚绿竹 ΤΒ1 同源基因部分序列 ∀点号表示相同序列 o不同的碱基
用字母标出 ∀ ≥¨´ ∏¨±¦¨ ¤¯¬ª±°¨ ±·²©·«¨ ³¤µ·¬¤¯ ª¨ ±¨ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨¶²© Πηψλλοσταχηψσ ϖιολασχενσ ΠπΤΒ1 o Πλειοβλαστυσ αµαρυσ ΠαΤΒ1 k⁄±|tszywl o
Πλειοβλαστυσφορτυνει ΠφΤΒ1k⁄±{wuuuxl ¤±§ Βαµβυσα οδασηιµαε ∆εΤΒ1 k⁄±{wuuuwl º¤¶¦²±§∏¦·¨§ º¬·« „¯¬ª±÷ q • ª¨¬²±¶²©¬§¨±·¬·¼ k§²·l ¤±§
§¬©©¨µ¨±¦¨ k¦²µµ¨¶³²±§¬±ª¥¤¶¨l ¤µ¨ ¬±§¬¦¤·¨§q
212 ΠπΤΒ1基因的表达
通过 • ×2°≤• 分析和原位杂交分析 o可以进一步揭示 ΠπΤΒ1 基因的表达特点 o这对于揭示 ΠπΤΒ1 基因
在竹笋中的功能有重要意义 ∀竹子不同器官 • ×2°≤• 分析表明 oΠπΤΒ1 不仅在笋中表达 o在叶片和花器官中
也有表达k图 w∞l ∀显微切片显示 o竹笋在一个非常小的空间中包含了许多复杂的分枝结构k图 w„ o…o≤ o⁄l ∀
原位杂交分析表明 oΠπΤΒ1在侧芽的顶端有较强的表达 o而在笋体的其他部位信号较弱k图 w ƒ oŠ o‹l ∀由此
推测 oΠπΤΒ1 基因与竹子的侧芽发育有关 ∀上述基因表达分析 o特别是竹笋的原位杂交分析揭示 o虽然
ΠπΤΒ1基因在竹子的各组织器官中均有表达 o但是在组织器官内部的表达分布显然是不均匀的 ∀由此 o也进
一步说明 o在竹笋发育过程中 o检测各种调控信号的空间分布是非常重要的 o可以避免混合取样导致内部差
异的抵消 o有利于真正阐明各种调控信号的调控规律 ∀
ww 林 业 科 学 wv卷
图 v 部分 ׅt同源物的分子进化树分析
ƒ¬ªqv ׫¨ ³«¼¯²ª¨ ±¼ µ¨¦²±¶·µ∏¦·¬²± ²©·«¨ ³∏·¤·¬√¨ ׅt2¯¬®¨ «²°²¯²ª¶
该进化树主要根据 ≥°区 !×≤°区 !• 区的氨基酸序列构建 o采用邻接法 ot sss次重复置信度分析 ∀图中以物种名称指代同源基因 o
中文名空白处或星号标注表示其中文种名不清 o进化树分支上的数字表示置信度百分数 o标尺表示采用邻接法计算的进化距离 ∀
乌脚绿竹 !早竹 !菲白竹和苦竹为本文所克隆 ΤΒ1 相似基因 o其余物种序列参考文献k∏®¨ ±¶ ετ αλqousstl ∀׫¨ ³«¼¯²ª¨ ±¼ º¤¶
µ¨¦²±¶·µ∏¦·¨§∏¶¬±ª≥° o×≤° ¤±§ • §²°¤¬± ¥¼ ‘¨¬ª«¥²µ2²¬±¬±ª ° ·¨«²§ º¬·« ⁄¤¼«²©© ¤·µ¬¬ ²§¨¯ ¤±§t sss ¥²²·¶·µ¤³µ¨³¯¬¦¤·¨¶oº«¨µ¨ ±∏°¥¨µ
¥¨¶¬§¨ ±²§¨¶¶·¤±§¶©²µ¥²²·¶·µ¤³√¤¯∏¨ ¤±§·«¨ ¥¨ ²¯º ¶¦¤¯¨¶·¤±§¶©²µ √¨²¯∏·¬²±¤µ¼ §¬¶·¤±¦¨ q׫¨ «²°²¯²ª²∏¶ª¨ ±¨ ¶¤µ¨ ¬±§¬¦¤·¨§¥¼ ¶³¨¦¬¨¶±¤° ¶¨o
º«¨µ¨ Πηψλλοσταχηψσϖιολασχενσo Πλειοβλαστυσ αµαρυσo Πλειοβλαστυσφορτυνει ¤±§ Βαµβυσα οδασηιµαε µ¨³µ¨¶¨±··«¨ ª¨ ±¨ ¶¦¯²±¨ §¬±·«¬¶³¤³¨µ¤±§·«¨
²·«¨µ¶¦²°¨ ©µ²° µ¨©¨µ¨±¦¨ k∏®¨ ±¶ ετ αλqousstl q
v 讨论
311 ΤΒ1基因的序列特点和进化
ΤΒ1基因属于高等植物所特有的 ΤΧΠ基因家族 ∀根据基因序列的结构特征 oΤΧΠ基因除了以玉米的
ΤΒ1基因为代表 o还包括金鱼草的 ΧΨΧ基因以及水稻的 ΠΧΦ1和 ΠΧΦ2基因k≤∏¥¤¶ ετ αλqot|||l ∀ ΤΧΠ基因
编码的产物均有一个结构相似的 ×≤°保守区 o该保守区包含不典型的螺旋 p环 p螺旋结构k¥‹‹l o可能与
⁄‘„的结合以及蛋白质的相互作用有关 ∀另外 oׅt同源物在上述保守区下游还有一个保守的 • 结构域
k•2§²°¤¬±l o可能形成一个亲水性 Α螺旋 ∀目前已有研究的 ΤΧΠ基因均与分生组织发育有关 o如 ΧΨΧ控制
花分生组织的生长 oΤΒ1影响腋芽分生组织的生长 o而 ΠΧΦ1 和 ΠΧΦ2 则是调控分生组织细胞分裂的有关基
因 ∀由此 o可以推测 ΤΧΠ基因编码产物的上述结构特点与植物分生组织调控紧密相关 ∀
虽然在墨西哥类蜀黍k Ζεα µαψ󶶳q παµιγλυµισl进化为玉米的过程当中 oΤΒ1 基因发挥了实质性的作用
k⁄²¨ ¥¯ ¼¨ ετ αλqot||x ~t||zl o但是分子进化的分析表明 o这一进化过程并没有对 ΤΒ1 的编码区形成正向选
择 o而是与启动子的序列进化有关系k • ¤±ª ετ αλqot|||l o即关于玉米分枝形态的进化选择主要影响了 ΤΒ1
基因的表达 ∀因此 oΤΒ1 编码区的中性进化方式使得它适合作为玉米及其近缘种的系统进化分子标记
k∏®¨ ±¶ ετ αλqousstl ∀有趣的是 o水稻 ΤΒ1同源基因不仅在编码序列上与玉米 ΤΒ1 基因非常相似 o它们在
xw 第 {期 金群英等 }早竹 ΤΒ1 同源基因的克隆和表达分析
图 w ΠπΤΒ1 的基因表达分析
ƒ¬ªqw ׫¨ ª¨ ±¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ¤±¤¯¼¶¬¶²© Πηψλλοσταχηψσϖιολασχενσ ΠπΤΒ1
„ q竹笋 ~…q左半边为剥去笋壳后竹笋整体 o右半边为内部切面 o标尺为 u ¦° ~≤ q竹笋顶部切片 o位置如图 …中箭头所示 ~ ⁄q笋中
侧芽的局部放大 ~∞qΠπΤΒ1 基因在不同组织样品中的 • ×2°≤• 分析 oΠπΑΧΤ1 为 „≤׌‘对照 ~ƒ oŠ q ΠπΤΒ1 基因在竹笋中表达的原位
杂交分析 o主要表达位置如箭头所示 ~ ‹ q原位杂交正义探针的对照 ∀ ≤ o⁄o ƒ oŠ o‹ 的标尺均为 tss Λ° ∀„ q …¤°¥²²¶«²²·~ …q ׫¨
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׫¨ °¬¦µ²¶¨¦·¬²± ²© ¤¯·¨µ¤¯ ¥∏§²©¥¤°¥²²¶«²²·~∞q׫¨ • ×2°≤• ¤±¤¯¼¶¬¶²© ΠπΤΒ1 ¬¨³µ¨¶¶¬²± ¤°²±ª§¬©©¨µ¨±··¬¶¶∏¨¶¤±§²µª¤±¶º¬·« ΠπΑΧΤ1 ¤¶
¤³²¶¬·¬√¨ ¦²±·µ²¯ ~ƒ oŠ q ׫¨ ιν σιτυ «¼¥µ¬§¬½¤·¬²± ²© ΠπΤΒ1 ¬¨³µ¨¶¶¬²± ¬± ¥¤°¥²² ¶«²²·º«¬¦«¬¶°¤¬±¯¼ ¬±§¬¦¤·¨§¥¼ ¤µµ²º¶~ ‹ q ׫¨ ±¨ ª¤·¬√¨
¦²±·µ²¯ ²© ΠπΤΒ1 ιν σιτυ «¼¥µ¬§¬½¤·¬²± º¬·«¶¨±¶¨ ³µ²¥¨ qŒ± ≤ o⁄oƒ oŠ o‹ }¥¤µ € tss Λ° q
基因组上的与其他基因的位置关系也是对应的 o即存在所谓的局部共线性 kפ®¨ §¤ ετ αλqoussvl ∀近年来 o
竹子分子水平上的研究表明 o竹子的基因组复杂度与水稻相似 o特别是丛生竹 o其基因组大小相当于多倍体
的水稻kŠ¬¨ ¬¯¶ ετ αλqot||zl ∀樊龙江等kussyl利用 { 个全长 °• ‘„ 基因序列比较了麻竹k ∆ενδροχαλαµυσ
λατιφλορυσl !绿竹和毛竹等竹类植物与水稻 !玉米 !大麦和小麦等禾本科作物之间的差异 o发现竹类植物与水稻
有着更相似的基因序列特征kŠ≤ 含量分布和密码子使用频率l ∀由此 o可以推测竹子 ΤΒ1 同源基因很可能
与玉米 ΤΒ1同源基因有着相似的序列进化特征 ∀
竹子的分类问题是竹子研究中的一个突出问题 o这是由于竹类植物开花周期长 o多数竹子较少开花 o偶
有开花的也多不育 o而花和果实等生殖器官却是竹亚科分属及属以上分类等级的主要依据k耿伯介 ot|{ul ∀
因此 o在生殖性状不明的情况下 o竹子分类常以营养性状为主 o但营养体的特性容易受该竹种所处生长环境
的影响 o从而导致错误鉴定 ∀随着竹子分子生物学研究的开展 o分子进化方法与经典分类学研究方法的结
合 o有助于解决一些竹子分类的争论k李淑娴等 oussul ∀而利用同源基因的进化关系来推断各属的分类进化
关系是其中一个较为有效的途径 o但是由于对竹子遗传学背景研究较少 o选择合适的同源基因较为困难 ∀对
于 ΤΒ1同源基因 o虽然其在竹子中是否存在自然选择尚有待克隆更多的基因序列进行分析和比较 o但是本
文通过不同竹种 ΤΒ1同源基因的克隆和初步的序列分析k图 ul o揭示 ΤΒ1 基因有可能作为竹子分类进化的
分子标记 ∀
312 ΤΒ1基因的表达和功能
玉米 τβ1突变体的基因功能研究表明 oΤΒ1 基因抑制玉米侧芽的长出k⁄²¨ ¥¯ ¼¨ ετ αλqot||zl ∀突变体表
型分析和原位杂交分析显示 oΤΒ1基因在叶腋分生组织和穗原基的雄蕊部分表达 o抑制侧芽的生长和雄花序
的产生 o促进顶端优势和雌花序的形成 o由此表明 oΤΒ1 基因的功能与其基因表达特点是紧密相关的
k‹∏¥¥¤µ§ ετ αλqoussul ∀水稻 ΟσΤΒ1的转基因研究表明 oΟσΤΒ1的过量表达能抑制水稻侧芽的生长 o但不影
响侧芽的形成 o利用 Š˜≥报告基因检测发现 ΟσΤΒ1在水稻整个侧芽 !茎顶分生组织基部 !木髓部维管组织和
叶片结合处等部位表达 kפ®¨ §¤ ετ αλqoussvl ∀高粱k Σοργηυµ βιχολορl ΣβΤΒ1 基因也具有上述类似的表达规
律和功能 o进一步的研究还表明该基因受光敏色素 …调节kŽ¨¥µ²° ετ αλqoussyl ∀早竹 ΠπΤΒ1基因的原位杂
交分析表明 oΠπΤΒ1也集中在竹笋的侧芽 !茎顶分生组织基部等处表达 o由此可以推测 ΠπΤΒ1 也可能与竹子
yw 林 业 科 学 wv卷
侧芽的长出有关 ∀在竹子的发育过程中 ,不仅是竹笋的形成和生长过程 ,还有新竹鞭的形成都涉及不同位置
侧芽的长出 o因此 o进一步探索该基因的功能对于理解竹笋发育规律和竹子生长规律有着重要的价值 o对于
将来进一步利用基因工程技术开展竹笋丰产调控也有着重要意义 ∀
另外值得一提的是 o最近拟南芥上也开展了 ΤΒ1相似基因的功能研究 o这一研究结果暗示 ΤΒ1 同源基
因在双子叶植物之中也是存在的k„ª∏¬¯¤µ2¤µ·¬±¨ ½ ετ αλqousszl ∀因此 o借助于模式植物拟南芥初步验证竹
子 ΤΒ1基因的功能是下一步值得探索的重要思路 ∀
参 考 文 献
丁兴萃 qt||z1毛竹笋体生长发育过程中内源激素的动态分析 q竹子研究汇刊 oty kul }xv p yu
樊龙江 o郭兴益 o马乃训 qussy1 竹类植物与水稻等其它禾本科作物的系统进化关系及基因序列组成的比较 q林业科学研究 ot|kul }tyx p ty|
方 伟 qt||x1竹子分类学 q北京 }中国林业出版社
耿伯介 qt|{u1世界竹亚科各属的考订 q竹子研究汇刊 otktl }t p t|
耿伯介 o王正平 o叶光汉 o等 qt||y1 中国植物志 }第九卷第一分册 q北京 }科学出版社
何奇江 o汪奎宏 o华锡奇 o等 qussx1 雷竹开花期内源激素 !氨基酸和营养成分含量变化 q林业科学 owtkul }ty| p tzv
胡超宗 o金爱武 o张卓文 qt||y1 竹鞭侧芽分化过程中内源激素的变化 q浙江林学院学报 otvktl }t p w
黄坚钦 o刘 力 o章滨森 o等 qussu1 雷竹地下鞭侧芽内源激素的动态变化研究 q林业科学 ov{kvl }v{ p wt
李淑娴 o尹佟明 o邹惠渝 o等 qussu1 用水稻微卫星引物进行竹子分子系统学研究初探 q林业科学 ov{kvl }wu p w{
张卓文 o胡超宗 o金爱武 qt||y1 雷竹鞭侧芽发育为笋的形态结构观察 q竹子研究汇刊 otxkul }ys p yy
„ª∏¬¯¤µ2¤µ·¬±¨ ½ „ o°²½¤2≤¤µµ¬²± ≤ o≤∏¥¤¶° qussz1 Αραβιδοπσισ …• „‘≤‹∞⁄t ¤¦·¶¤¶¤±¬±·¨ªµ¤·²µ²©¥µ¤±¦«¬±ª¶¬ª±¤¯¶º¬·«¬± ¤¬¬¯¯¤µ¼ ¥∏§¶q°¯¤±·≤¨¯¯ot|
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k责任编辑 徐 红l
zw 第 {期 金群英等 }早竹 ΤΒ1 同源基因的克隆和表达分析