全 文 ： 收稿日期 }t||| p tt p ts ∀
基金项目 }河北省自然科学基金 ∀河北省教委基金 !中国科学院院长基金以及联合国环境规划署基金部分资助 ∀
3 中国科学院微生物研究所李常青同志参加研究工作 o河北农业大学林学院王进茂 !张法勇 !李明伟同学参加部分工作 o谨此致谢 ∀
tl oul ovl owl oxl为作者排序 ∀
第 vy卷 第 u期u s s s年 v 月
林 业 科 学
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∂ ²¯1vy o ‘²1u
¤µqou s s s
转双抗虫基因 zwt毛白杨的选择及抗虫性 3
郑均宝tl 梁海永ul 高宝嘉wl 王永芳xl
k河北农业大学林学院 保定 sztsssl
田颖川vl
k中国科学院微生物研究所 北京 tsss{sl
摘 要 } 用部分改造 …·≤µ¼¯ „¦基因与慈菇蛋白酶抑制剂k„°Œl基因构建的双抗虫基因表达载体 o通过农杆
菌介导法转化了 zwt 毛白杨 [ Ποπυλυσ αλβα q≅ k Π. δαϖιδιανα ⁄²§¨ n Π. σι µ ονιι ≤¤µµql ≅ Π. τοµεντοσα
≤¤µµq  ∀本文报道了选择转化植株的条件 ∀在含卡那霉素kŽ°. l的生根培养基中初步选择到转化植株 o°≤ •
检测表明 {s h的植株呈现阳性反应 ∀对初步选择的转基因植株用杨扇舟蛾k Χλοστερα αναχηορετα ƒ¤¥µ¬¦¬∏¶l和
舞毒蛾k Λψµ αντρια δισπαρ ¬±±¤¦∏¶l幼虫进行饲虫试验 ∀其结果按照死亡率划分了高 !中 !低和对照 w类昆虫
死亡率的植株 o并对这 w类的定期死亡率 !生长发育的延迟性后效应等进行了比较研究 o为选择具有显著抗
虫性的植株k无性系l提供依据 ∀分子生物学检测结果 o证明被选择植株k无性系l的基因已转入 o且生长发育
正常 o占参试饲虫试验植株的 v{1t h ∀
关键词 } zwt毛白杨 o双抗虫基因 o转化 o选择
ΣΕΛΕΧΤΙΟΝ ΑΝ∆ ΙΝΣΕΧΤ ΡΕΣΙΣΤΑΝΧΕ ΟΦ ΤΡΑΝΣΓΕΝΙΧ ΗΨΒΡΙ∆ ΠΟΠΛΑΡ 741
ΧΑΡ ΡΨΙΝΓ Τ ΩΟ ΙΝΣΕΧΤ2ΡΕΣΙΣΤΑΝΤ ΓΕΝΕΣ
«¨ ±ª∏±¥¤²tl ¬¤±ª ‹¤¬¼²±ªul Š¤² …¤²­¬¤wl • ¤±ª ≠²±ª©¤±ªxl
( Ηεβει Αγριχυλτυραλ Υνιϖερσιτψ Βαοδινγ sztsss)
׬¤± ≠¬±ª¦«∏¤±vl
(Ινστιτυτε οφ Μιχροβιολογψ, Αχαδε µια σινιχα Βειϕινγtsss{s)
Αβστραχτ : ∞¬³¯¤±·¶²©«¼¥µ¬§³²³¯¤µzwt[ Ποπυλυσ αλβα q≅ k Π. δαϖιδιανα ⁄²§¨ n Π. σιµονιι ≤¤µµql ≅ Π. το2
µεντοσα ≤¤µµq  º µ¨¨ ·µ¤±¶©²µ° §¨º¬·« „ªµ²¥¤¦·¨µ¬∏°·∏° ©¨¤¦¬¨±¶…„wwsw «¤µ¥²µ¬±ª·«¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²± √ ¦¨·²µ³…·¬„
¦²±·¤¬±¬±ª·º²¬±¶¨¦·2µ¨¶¬¶·¤±·ª¨ ±¨ ¶q≤²±§¬·¬²±¶©²µ¶¨¯¨ ¦·¬²±²©³²³¯¤µ·µ¤±¶©²µ° ±¨·¶o ¶¨³¨¦¬¤¯ ¼¯·«¨ ¦µ¬·¬¦¤¯ ¦²±¦¨±2
·µ¤·¬²±¶²© Ž¤±¤°¼¦¬±kŽ°. l º µ¨¨ §¨·¨µ°¬±¨ §q{s h ²©·«¨ ·µ¤±¶©²µ° ±¨·¶¶¨¯¨ ¦·¨§²± µ²²·¬±ª ° §¨¬∏° ¦²±·¤¬±¬±ª
Ž°. ª¤√¨²∏·³²¶¬·¬√¨µ¨¶∏¯·¶¥¼ °≤ • §¨·¨¦·¬²±q׫¨ ª¨ ±¨ 2·µ¤±¶©²µ° §¨³¯¤±·¶³µ¨ ¬¯°¬±¤µ¬¨¶¶¨¯¨ ¦·¨§ º µ¨¨ ª¬√ ±¨·²
¬±¶¨¦·©¨ §¨¬±ª·¨¶·¶º¬·« Χλοστερα αναχηορετα ƒ¤¥µ¬¦¬∏¶¤±§ Λψµ αντρια δισπαρ¬±±¤¦∏¶q„±§·«¨ ·¨¶·¨§¬±¶¨¦·¶º µ¨¨
§¬√¬§¨§¬±·²©²∏µªµ²∏³¶o«¬ª«o°¬§§¯¨o¯ ²º ¤±§¦²±·µ²¯ ¤¦¦²µ§¬±ª·² °²µ·¤¯¬·¼qŒ±·«¨ ° ¤¨±·¬°¨o·«¨ ¬±¶¨¦·°²µ·¤¯2
¬·¼¬±©¬¬¨ §³¨µ¬²§¤±§·«¨ ©¨©¨¦·¶²©§¨ ¤¯¼¬±ª·«¨ ªµ²º·«¤±§§¨√¨¯²³° ±¨·²©¬±¶¨¦·¶º µ¨¨ ¦²°³¤µ¤·¬√¨¯¼ ¶·∏§¬¨§·²
³µ²√¬§¨ ·«¨ ¥¤¶¬¶©²µ¶¨¯¨ ¦·¬±ª ³¯¤±·¶²µ¦¯²±¨ ¶o º«¬¦«¶¬ª±¬©¬¦¤±·¯¼ µ¨¶¬¶··²¬±¶¨¦·q ׫¨ µ¨¶∏¯·¶²© §¨·¤¬¯¨ §¬±¶¨¦·2
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ª¨ ±²° ¶¨²©¬±¶¨¦·µ¨¶¬¶·¤±·³¯¤±·¶q ×µ¤±¶©²µ° ±¨·¶º¬·« ±²µ°¤¯ ³«¨ ±²·¼³¨ oªµ²º·«µ¤·¨ ¤¶·«¤·²©·«¨ ±²±2·µ¤±¶2
©²µ° §¨¦²±·µ²¯ ¤±§«¬ª«¬±¶¨¦·2µ¨¶¬¶·¤±·º µ¨¨ ¶¨¯¨ ¦·¨§¤±§¤¦¦²∏±·¨§©²µv{ qt h ²©·«¨ ·µ¤±¶©²µ° §¨·¨¶·¨§q
Κεψ ωορδσ: ‹¼¥µ¬§³²³¯¤µzwt o × º²¬±¶¨¦·2µ¨¶¬¶·¤±·ª¨ ±¨ ¶o ×µ¤±¶©²µ° §¨o≥¨¯ ¦¨·¬²±
虫害是造成农 !林业减产的重要原因之一 ∀半个世纪以来 o人们使用化学农药 !微生物杀虫剂等方
法防治害虫 o曾起过很大的作用 o但也出现了不少意想不到的问题 ∀现在分子生物学 o特别是 {s年代
成熟起来的植物基因工程 o为防治害虫提供了一条新的途径k朱新生 ot||zl ∀ ¦≤²°±kt||tl首次报
道了获得一株有杀虫效果的杨树转 …·基因植株 ∀我国也在 t||v年报道了获得一批转 …·≤µ¼¯ „¦基因
的欧洲黑杨 o对舞毒蛾和杨尺蠖毒杀死亡率可达到 {s h ∗ |s h k田颖川 ot||vl ∀ ≤²±©¤¯²±¬¨µ¬  q等
kt||{l o报道了用大豆蛋白酶抑制剂基因转化了欧洲黑杨 o但对试虫的毒杀效果并不好 ∀近年的研究
指出 o昆虫易对 …2·²¬¬±产生耐受性 o并认为防止害虫耐受性发生最有效的方法是联合使用两种或两种
以上不同杀虫机制的抗虫基因 o使转基因植物表达数个具有不同毒性机制的毒素k朱新生 ot||zl ∀田
颖川等对 …·≤µ¼¯ „¦基因部分片断的核苷酸序列进行了改造与慈菇蛋白酶抑制剂k„°Œl基因构建了具
有不同杀虫机制的双抗虫基因 o并成功的转化了 zwt毛白杨[ Ποπυλυσ αλβα q≅ k Π. δαϖιδιανα ⁄²§¨ n
Π.σι µονιι ≤¤µµql ≅ Π. τοµεντοσα ≤¤µµq  o经过抗虫试验及分子生物学检测在国内 !外首次报道选到了
对杨扇舟蛾和舞毒蛾有高抗虫性的转双抗虫基因杨树植株 ∀本文重点报道对转双抗虫基因 zwt毛白
杨的选择条件 o选出一批高抗虫性和中等抗虫性植株k无性系l o其方法也可供其它类似研究的参考 ∀
t 材料和方法
111 材料
t1t1t 菌种和质粒 含双抗虫基因的表达载体 ³…·¬„ o及土壤农杆菌 …„wwswk田颖川 ousssl ∀
t1t1u 植物材料和测试昆虫 zwt毛白杨取自河北农业大学林业生物技术研究室无菌试管植株 ∀测
试昆虫为人工饲养的杨扇舟蛾k Χλοστερα αναχηορετα ƒ¤¥µ¬¦¬∏¶l和舞毒蛾k Λψµ αντρια δισπαρ ¬±±¤¦∏¶l ∀
112 方法
t1u1t 双抗虫基因的构建 含部分改造的 …·≤µ¼¯ „¦基因k…·基因l及慈菇蛋白酶抑制剂基因 „
k„°Œ ) „l的植物表达载体的构建k田颖川 ousssl ∀在转化植物之前将含有该载体的土壤农杆菌
…„wwsw o在 u{ ε 摇床培养过夜后即可用于转化 ∀
t1u1u 双抗虫基因对杨树的转化及外植体诱导器官分化抗卡那霉素kŽ°. l临界浓度试验 以试管内
杨叶片为外植体 o按附后文献k田颖川 ot||vl的方法进行转化 ∀诱导不定芽分化的培养基为  ≥ n y p
…„ t qs °ªrn ‘„„ s qt °ªr~诱导芽增殖培养基为  ≥ n y p …„ s qv °ªrn Œ…„ s qt °ªr~诱导嫩
茎生根的培养基为 tru  ≥ n Œ… „s qv °ªrk或 ‘„„ s qt °ªrl ∀抗 Ž°. 临界浓度试验是在上述相应
培养基中附加 Ž°.浓度分别为 s !x !ts !us !vs !ws !xs !tss °ªr等 ∀诱导嫩茎生根抗 Ž°.临界浓度试
验 oŽ°.的浓度分别为 s !ts !us !vs !ws !xs °ªr∀
t1u1v 转基因植株的饲虫试验 饲虫材料为苗圃试验地上的转基因和未转基因k≤Žl的 zwt毛白杨
各系号苗木的叶片 o进行室内饲养 ∀饲养瓶为高 y¦°直径 tu¦°的罐头瓶 o用塑料薄膜扎紧瓶口 o细针
扎孔通气 ∀选取孵化 t ∗ u §的一龄杨扇舟蛾和舞毒蛾开始饲养 o每天更换新鲜叶片 o直到结茧为止 ∀
隔日观察一次 o记载昆虫死亡数 o死 !活虫发育的龄级 o定期称取虫重等 ∀在 t||{年和 t|||年进行了
两年饲虫试验 o参试植株 ut个系号 ∀由于 ≤Ž植株昆虫死亡率都在 x h以下 o因此只计算昆虫死亡率 o
免去校正死亡率的计算 ∀计算饲虫过程中蜕皮指数和毒力k毒效l的公式如下 }
毒力k毒效l € 对照蜕皮指数处理蜕皮指 数 p t
数值愈高说明毒力愈大 ∀
蜕皮指数 € t龄 ≅头数 n , , n末龄 ≅头数总头数
t1u1w 转基因植株苗期生长与形态观察 选择抗虫性强 !中等 !无显著抗虫性的转基因系号 o以及未
转基因k≤Žl等的嫩枝扦插小苗高 us¦°左右 o按随机区组设计 o栽植在苗圃试验地上 o共设 w个小区 o
每个系号共栽 ws株 ∀苗木生长了 tus天 o高生长停止后 o逐株测定苗高 ∀各系号选出最大值的 x株 o
求其平均值k mΞ)和标准差( Σ) ,进行 τ检验 ∀同时观察生长正常的一年生和两年生苗木的干形 !分枝
wt 林 业 科 学 vy卷
角 !叶片形态等 ∀
t1u1x 转化再生植株的分子生物检测 杨树 ⁄‘„的提取 °≤ • 检测及 ⁄‘„ ≥²∏·«¨µ±杂交分析参照
附后参考文献k„∏¶∏¥¨¯ot||xl等进行 ∀将 usΛª杨树叶总 ⁄‘„ o用 ‹¬±§ ¶酶切过夜后用于 ≥²·«¨µ±¥¯²·
杂交分析 o探针分别为vu°标记的 …·基因kt q{Ž¥l和 „ ‹°Œ基因ks qyŽ¥l片段 ∀
杨树叶蛋白的提取及免疫测定 蛋白质的提取按照附后参考文献中 ° µ¨¯¤® ƒ等kt||tl所述的方
法进行 ∀在 ∞Œ≥„分析中 o首先用 tΒuxss稀释的 …·蛋白鸡抗 w ε 包被过夜 o然后加已知浓度的标准
抗原或植物蛋白溶液 vz ε 反应 v «o再加入 tΒtsss稀释的 …·蛋白鼠抗 vz ε 反应 u «o最后加入羊抗鼠
酶标二抗 vz ε 反应 u «o每步均用 °…≥× 洗板 v次 ∀最后加入底物避光反应半小时 o用 …¬²• ¤§xxs型酶
标仪测定结果 ∀
u 结果与分析
211 不同器官抗 Κµ .临界浓度的确定及转化基因植株的初步选择
u1t1t 不同器官抗 Ž°.临界浓度的确定 由于所用菌种带有抗 Ž°.基因k‘°×ŒŒo新霉素磷酸转移酶
标志基因l o如基因已转入杨树并得到表达 o该植株在含有一定浓度 Ž°. 培养基上 o能正常生长 ∀根据
试验 o外植体的不同器官对 Ž°.的耐受能力不同 o为此必须在试管内进行叶片诱导不定芽发生 !嫩茎的
增殖 !嫩茎的生根等抗 Ž°.临界浓度试验 ∀
试验结果说明 }叶片培养了 wu §o嫩茎培养了 wy §o培养基 Ž°.从 s到 xs °ªr呈梯度增加 o引起
的变化为叶片变黄进一步坏死 o以及不定芽发生或芽的增殖由多到少 o到完全不发生等 ~嫩茎在含有浓
度为 us °ªrŽ°.培养基中 o上部叶绿 o下部叶黄 o直到整株变黄 o稍有绿色 o芽的增殖也是由多到少 ∀
确定诱导叶片不定芽发生的抗 Ž°.临界浓度为 vs °ªro在此培养基中培养 o叶片变黄 o但尚未坏死 o
没有不定芽发生 ∀而诱导嫩茎芽增殖的临界浓度为 xs °ªro在这种培养基中 o嫩茎整株变黄 o稍有绿
色 ∀试验结果还说明 Ž°.对诱导嫩茎生根具有更大的抑制作用 o浓度为 ts °ªr即可达到完全抑制生
根的效果 ∀而转基因植株即使 Ž°.浓度达到 xs °ªro仍能正常生根 ∀
u1t1u 转化基因植株的初步选择 以试管内无菌叶片为外植体 o按照田颖川等kt||vl的方法进行基
因转化 ∀叶片经过浸菌和共培养后 o放置于附加 vs °ªrŽ°.和 uss °ªr的羧苄青霉素的诱导不定
芽分化的  ≥培养基中k见 t1u1ul o大约培养 us ∗ vs §o叶片开始大部分坏死 o呈水渍状但在切口部位
及叶柄剪口处出现米粒状愈伤组织 o经进一步培养 o诱导出不定芽 o约 ws ∗ xs §形成丛状芽丛 ∀培养过
程中并不是所有叶片均能产生不定芽 o有些虽形成了绿色愈伤组织 o但未能继续分化形成不定芽 ∀能
够诱导产生不定芽的叶片仅占培养叶片总数的 u1x h左右 ∀
抗 Ž°.临界浓度的试验说明 o嫩茎不定根的分化对 Ž°.更加敏感 o因此对培养的抗 Ž°.不定芽先
不进行增殖培养 o而是在生根培养基中选择抗 Ž°.的生根植株 ∀将抗 Ž°. 的不定芽培养为 t1x ∗ u1s
°高的嫩茎 o转到含 vs °ªrŽ°.和 tss °ªr的羧苄青霉素的生根培养基中 o约有 xs h左右的植株
能生根 o其余不能生根的植株认为是没有转化基因的 ∀在试管中进一步繁殖这些初步选择的转基因植
株 o形成无性系 o加以编号 o并栽植在苗圃中的试验地上 ∀对初步选择的转基因植株 o随机抽取 ts个系
号进行 °≤ • 检测 o{s h呈现阳性反应 ∀
212 具抗虫性转基因植株的饲虫试验选择
由于对舞毒蛾已有报道k田颖川 ot||vl o而且所得抗虫杨树对杨扇舟蛾的抗性较低 o所以本文重点
介绍杨扇舟蛾的饲虫试验 ∀
u1u1t 杨扇舟蛾的死亡率和定期死亡率 饲虫试验从孵化 t ∗ u §的幼虫开始 o昆虫经过 x个龄级的
发育到作茧结束 o历时 uv ∗ ux §∀统计各系号植株的杨扇舟蛾死亡率 o即试验全过程死亡的虫数占饲
虫总数的百分率 o绘入图 t中 ∀图 t表明 }ktl未转基因的对照昆虫死亡率极低 o两次均为 v1w h ∀kul
昆虫死亡率低 o为 us h以下 o占参试系号的 yt1| h ∀如图 t中的 f uw !f us和 f tx ∀kvl昆虫死亡率中
等 o为 ws h ∗ zs h o如图中的 f t为 yx h ? z1y h of |为 xv1v h ? x1{ h of ts为 wy1w h ? tt1x h of
xt 第 u期 郑均宝等 }转双抗虫基因 zwt毛白杨的选择及抗虫性
tu和 f tz为 ys1s h ? ts1s h o占参试植株的 uv1{ h ∀饲养舞毒蛾 of t植株昆虫死亡率为 yy1v h ?
s1w h ∀kwl昆虫死亡率高 o达 {x h以上 o如图中的 f v为 {|1y h ? x1u h of tt为 {{1w h ? x1| h of u|
为 {w1y h ? y1s h o占供试植株的 tw1v h ∀饲养舞毒蛾 of v植株死亡率可达 |t1{ h ? tt1z h of tt为
|s1x h ? s1z h ∀昆虫定期死亡率 o指在昆虫饲养的过程中 o一定时间内k每 u §内l o死亡昆虫数占死亡
昆虫和活虫之和的百分率 ∀计算各系号植株的昆虫定期死亡率 o作图 u ∀图 u说明 }ktl≤Ž的昆虫死亡
率低 o其定期死亡率也低 o昆虫死亡发生在饲养初期 ∀kul昆虫死亡率低的植株 o如 f us o第 v §和第 x §
定期死亡率分别为 y1z h和 z1t h o与 ≤Ž相似 ∀或出现昆虫偶尔死亡情况 o如植株 f tx o在第 | §定期
死亡率为 x h ∀kvl昆虫死亡率中等的植株 o定期死亡率较低 o其延续时间长 ∀kwl昆虫死亡率高的植
株 o定期昆虫死亡率较高 o而且主要是集中在饲养初期 ∀
图 t 昆虫死亡率
ƒ¬ªqt  ²µ·¤¯¬·¼ ³¨µ¦¨±·¤ª¨ ²© ¤¯µ√¤¨
u1u1u 饲养过程中杨扇舟蛾的发育状态 饲养过程中 o除死亡的昆虫外 o还存活一定数量的昆虫 ∀转
基因植株体内所含有的毒蛋白或蛋白酶抑制物质对它们的发育有什么影响 ‚为此研究了对这些活虫
的发育龄期 !化蛹期长短以及虫体重量的影响 o其结果列入表 v和表 w中 ∀表 v表明 o转基因植株与对
照相比 o死亡率中等和死亡率高的植株 o其叶片饲虫的结果 o会推迟存活昆虫的发育龄期 o从 ´龄进入
µ龄期 o昆虫中等死亡率推迟 u ∗ y §o高死亡率推迟 v ∗ { §~µ龄进入 ¶龄为 u ∗ w §和 u ∗ y §~¶龄进
入 ·龄均为 u ∗ y §~·龄进入 ∏龄为 u ∗ { §和 w ∗ y §of tt植株甚至使存活昆虫不能达到 ∏龄 !不生
长 !不蜕皮 o延续 t|日死亡 ∀见表 t ∀
表 1 饲虫过程中杨扇舟蛾的发育状态 ≠
Ταβ .1 ∆εϖελοπινγ στατυσ οφ Χλοστερα αναχηορετα (ΧΑ) ∆υρινγ φεεδινγ
植株类型
×¼³¨ ²© ³¯¤±·
植株系号
‘²q²© ³¯¤±·
昆虫发育龄期所需天数k§l
⁄¤¼¶©²µ·«¨ §¨ √¨¯²³° ±¨·²© ≤ „ ¬± ¤¯µ√¤¨ ¶·¤ª¨
´ ψ µ µ ψ ¶ ¶ ψ · · ψ ∏ ∏ ψ
∏龄幼虫占饲虫数的比率
° µ¨¦¨±·¤ª¨ ²© ¤¯µ√¤¨ x·«¬±¶·¤µ
k h l
≤Ž
昆虫死亡率低
²º °²µ¤¯¬·¼
昆虫死亡率中等
¬§§¯¨ °²µ·¤¯¬·¼
昆虫死亡率高
‹¬ª« °²µ·¤¯¬·¼
≤Žt v y u u u tss
≤Žu x u u w u tss
f tx x v v u u |x qs
f us x v v w u |v qv
f | | u u u w wz qs
f t z w w y u ws qs
f v tt u u w w z qs
f tt | u w s
f u| { v u w x ts qs
≠ ≤Ž为未转基因植株 of t , , f u|为转基因植株 q≤Ž}‘²±2·µ¤±¶ª¨ ±¬¦³²³¯¤µ~f t , , f u| }°¯ ¤±·²©·µ¤±¶ª¨ ±¬¦³²³¯¤µq
表 u表明 o昆虫死亡率高的植株 o喂养 tu §o每只虫体平均重只有对照的 wt h ∗ w| h o昆虫死亡率
中等的 o如 f |植株为 {t1{ h ∀
yt 林 业 科 学 vy卷
表 2 饲养杨扇舟蛾 12 δ的活虫重
Ταβ .2 Ωειγητσ οφ αλιϖελαρϖαε αφτερ 12 δαψσ οφ φεεδινγ
植株系号
‘²q²© ³¯¤±·¶ ≤Ž f | f tt f v f u|
虫体平均重
 ¤¨± º ¬¨ª«·²©¤¯¬√¨ ¤¯µ√¤¨ kªl s quzuw ? s qsx s quuu{ ? s qtt s qtt|s ? s qst s qttu{ ? s qsw s qttvs ? s qsw
相对重量
• ¨¯¤·¬√¨ º ¬¨ª«·k h l tss {t q{ wv qz wt qw w{ q{
u1u1v 转基因杨树叶片对杨扇舟蛾的毒力 根据杨扇舟蛾蜕皮指数计算毒力k毒效l o也能反映用转
基因杨树叶片饲养后 o对尚存活昆虫生长发育的延迟的后效应 o毒力数愈高说明毒力愈大k田颖川 o
t||vl ∀测定了 w类昆虫死亡率植株的毒力 o列入表 v中 ∀
表 3 转基因杨树叶片的毒力测定
Ταβ .3 Τοξιχιτψ ασσαψ οφ δεταχηεδ λεαϖεσφροµ τηε παρτ οφ γενε2τρανσφορµεδ ποπλαρ
昆虫死亡率种类
×¼³¨ ²©¬±¶¨¦·°²µ·¤¯¬·¼k h l 植株系号 °¯ ¤±·‘²q
试虫数量
‘∏°¥¨µ²©¬±¶¨¦·¶
蜕皮指数
∞¬∏µ¬¤·¬²±¬±§¨ ¬
毒力
ײ¬¬¦¬·¼
≤Ž ≤Žt vs tx qs s≤Žu vs tx qs s
死亡率低
²º °²µ¤¯¬·¼
f tx vs tw qt ? s q{s s qsz ? s qsy
f us vs tv qs ? t qzs s qtv ? s qtt
f uw vs tu qx ? t qzv s qtz ? s qtz
死亡率中等
¬§§¯¨ °²µ·¤¯¬·¼
f | vs z qu ? s q|{ u qts ? s qvv
f t vs y qv ? t qzs t qxs ? s q{v
死亡率高
‹¬ª« °²µ·¤¯¬·¼
f v xs t qz ? s qxy z qux ? w qys
f tt {s t q{ ? s quy z q{s ? t qzs
f u| {s u qt ? s q|v y qws ? u qvs
表 v表明昆虫死亡率中等的植株 o其毒力在 t1x ∗ u1x之间 o昆虫死亡率高者 o毒力达 y ∗ {之间 ∀
昆虫死亡率低者 o其毒力很低 o在 s1sx ∗ s1us之间 ∀
从以上饲虫试验结果 o根据昆虫死亡率和昆虫定期死亡率及致使杨扇舟蛾的发育龄期延迟以及昆
虫体重降低 o毒力数字大等指标 o可选择昆虫死亡率高及昆虫死亡率中等的两类植株 o它们是具有显著
抗虫性转基因的 zwt毛白杨 ∀
u1u1w 转基因植株苗期高生长与形态观察 将苗木高生长测定和数据的数理统计处理结果列入表 w
中 ∀表 w表明 o对照生长好的植株平均高生长为 t{s1s ¦° ∀昆虫死亡率高和中等的两类 of v稍低于
≤Žof t稍同于对照 ∀从 t 和 u 年生苗木的叶形 !干形 !分枝角等观察与 ≤Ž相比没有显著差异 ∀
表 4 一年生苗木高生长的比较
Ταβ .4 Χοµ παρισον ον ονε ψεαρ οφ χυττινγσ
项目
Œ·¨° ≤Ž
昆虫死亡率低
²º °²µ·¤¯¬·¼ ²©¬±¶¨¦·
昆虫死亡率中等
¬§§¯¨
昆虫死亡率高
‹¬ª« °²µ·¤¯¬·¼ ²©¬±¶¨¦·
f |{u f ≤ f t f v f tt f u|
Ηk¦°l t{s qs t|v qs 3 txy qs 3 3 usu qs 3 tyt qs 3 tyv qs t|s qs
3 ¿τ¿ τs .sx , 3 3 ¿τ¿ τs .st .
213 转基因抗虫杨树植株的分子生物学检测
选择昆虫死亡率高和中等的 v个系号植株叶片 o即 f tt !f u| !和 f t进行 ⁄‘„的 ≥²∏·«¨µ± ¥¯²·分
析 ∀将杨树 ⁄‘„用 ‹¬±§¶完全酶解后 o每一样品分两部分按 t1u1z中所述进行电泳分离和转膜然后
分别与 …·基因及 „ ‹°Œ基因探针进行杂交 ∀杂交膜的放射自显影结果分别如图 v所示 o从图 u结果显
示 v个抗虫植株 f t !f tt !f u|都可与 …·基因探针杂交形成大于 twŽ¥k图 v ) „ 泳道 °l单一杂交带 o
而非转基因对照则无杂交带出现 ∀由于 ‹¬±§¶只在 …·基因的上游有识别位点所以杂交带的数目可以
zt 第 u期 郑均宝等 }转双抗虫基因 zwt毛白杨的选择及抗虫性
反映该基因在杨树基因组中插入的拷贝数 ∀因此可以认为在这 v株植株中各有一个拷贝的插入 ∀在
用 „ ‹°Œ ) „基因为探针的杂交中k见图 v ) …l同样非转基因对照无杂交带 o而 v个抗虫植株的 ⁄‘„
在 t1yŽ¥左右有明显的杂交带出现 o证明 „ ‹°Œ ) „ 基因在这 v株植物的基因组中都有整合 o由于在
„ ‹°Œ基因的上下游都有 ‹¬±§¶位点的存在所以杂交带的大小都是一致的 o这也说明该基因在这 v个
转基因植物中是完整的 o没有出现缺失和重组现象 ∀以上结果表明这 v个抗虫植株是整合有双抗虫基
因的转基因植株 ∀
图 u 饲虫过程中昆虫定期死亡率
ƒ¬ªqu  ²µ·¤¯¬·¼ ³¨µ¦¨±·¤ª¨ ²© ¤¯µ√¤¨ ¬± ©¬¬¨ §³¨µ¬¨§§∏µ¬±ª©¨ §¨¬±ª
ktl对照 ≤²±·µ²¯ okul死亡率低 ²º °²µ·¤¯¬·¼ okvl中等死亡率 ¬§§¯¨ °²µ·¤¯¬·¼ okwl高死亡率 ‹¬ª« °²µ·¤¯¬·¼ q
抗虫蛋白在转基因植株中是否有合成应是说明这些植株抗虫原因的直接证据 ∀为此用抗 …·杀虫
蛋白 ‘端 y{Ž⁄的抗血清对转基因杨树叶片蛋白提取物进行了免疫测定 o测定结果初步证明在这 v株
抗虫杨树中有 …·杀虫蛋白的合成 ∀用 …·抗血清进行的 ∞Œ≥„ 检测结果 o这 v株转基因植株 f t !f
tt !f u|中 …·蛋白的表达量分别为 s1sttx h os1stys h和 s1stux h ∀
v 结论与讨论
分别对 zwt毛白杨无菌组培植株诱导器官再生的叶片 !嫩茎等进行抗 Ž°.临界浓度试验 ∀以嫩茎
诱导不定根发生对 Ž°.最为敏感 o临界浓度在 ts °ªr以下 ∀在含 Ž°. 生根培养基中初步选择转化
了的植株 o即生根的植株 ∀ °≤ • 检测结果其中 {s h以上的植株呈现阳性反应 o进行饲虫试验有 v{1t h
{t 林 业 科 学 vy卷
图 v 再生杨树植株 ⁄‘„的 ≥²∏·«¨µ±印渍分析
ƒ¬ªqv ≥²∏·«¨µ± ¥¯²·¤±¤¯¼¶¬¶²© ª¨ ±²°¬¦⁄‘„¶©µ²° ¬±¶¨¦·2µ¨¶¬¶·¤±·³²³¯¤µ³¯¤±·¶
表现了明显的抗虫性 ∀用农杆菌介导法转化基因时 o如果其标志基因为抗 Ž°.基因 o对不同树种 !不同
器官以致继代多次逐渐幼化了的组培材料等均要再次进行抗 Ž°.临界浓度试验 o这是基因转化能否成
功的关键因素之一 ∀
饲虫试验的结果 o根据昆虫死亡率 o可将参试植株分为 w类 }ktl 未转基因植株k≤Žl o昆虫死亡率
x h以下 ~kul昆虫死亡率低 ous h以下 ~kvl昆虫死亡率中等 ovs h ∗ zs h ~kwl昆虫死亡率高 ozt h以上 ∀
比较了上述 w类植株叶片毒死昆虫的昆虫定期死亡率 ∀ktl和kul两类 o昆虫定期死亡率低且发生在饲
虫初期 o其特点两类近似 okul类可判断为基因未转入 o或转入后基因未表达 ∀第kvl类 o昆虫定期死亡
率较低 o但延续时间长 o是否可解释为基因产物表达水平低 o在昆虫体内抗虫蛋白积累到一定水平才能
使昆虫致死 ∀可见第kvl类也是被选择的植株 ∀而第kwl类 o定期昆虫死亡率较高 o而且集中在饲养初
期 o说明基因表达产物水平高 o因而较迅速地毒死了昆虫 ∀总之 o要选择第kwl类和第kvl类植株 ∀
根据试虫蜕皮指数计算毒力 o说明叶片毒性对尚存活昆虫生长发育的延迟性后效应 o数值愈高说
明毒力愈大 ∀本研究除根据蜕皮指数计算了毒力外 o还研究了用上述 w类植株叶片饲养过的尚存活昆
虫各发育龄期推迟的程度 ∀未转基因的对照和昆虫死亡率低的两类尚存活昆虫进入各发育龄期所需
的时间相近 ~而昆虫死亡率高和中等的两类尚存活昆虫进入各发育龄期均推迟 o有的昆虫甚至不能达
到 ∂ 龄期就死亡了 ∀可见这些尚存活的昆虫也受到毒害 o影响了正常的生长发育 ∀但是它们是否能正
常地结茧 !羽化 !产卵 !孵化幼虫以致下一代对转基因杨树的反应等 o均有待进一步研究 ∀
此外 o第kwl类和第kvl类喂养 tu §后 o尚存活昆虫平均虫体重的显著减轻 o也说明了对昆虫生长发
育的延迟性后效应 ∀
参 考 文 献
田颖川 o韩一凡等 q抗虫转基因欧洲黑杨的培育 ∀生物工程学报 ot||v o|kwl }u|t ∗ u|z
田颖川 o虞红梅 o郑均宝等 q≥·∏§¬¨¶²©·µ¤±¶ª¨ ±¬¦‹¼¥µ¬§³²³¯¤µzwt ·µ¤±¶©²µ° §¨ º¬·«·º²¬±¶¨¦·¶µ¨¶¬¶·¤±·ª¨ ±¨ ¶q植物学报 ousss owukvl }uyv
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朱新生 o朱玉贤 q抗虫植物基因工程研究进展 q植物学报 ot||z ov|kvl }u{u ∗ u{{
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|t 第 u期 郑均宝等 }转双抗虫基因 zwt毛白杨的选择及抗虫性
郑均宝等 }转双抗虫基因 zwt毛白杨的选择及抗虫性 图版 Œ
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• ¶¨¬¶·¤±·Š ±¨¨ ¶ °¯ ¤·¨ Œ
t 叶片产生不定芽 ~u 抗 Ž°.临界浓度试验k从左到右 Ž°.浓度 s ox oxs °ªrl ~v 在含有 Ž°.的培养基中转基因植株生了根k右l o
未转基因的未生根k左l ~w 在苗圃试验地上的转基因植株 ~x在瓶内饲养 t§的杨扇舟蛾的叶片 ~y在瓶内饲养 wu §的存活下来的舞
毒蛾幼虫k从左到右为 f v of tt of u| of tx以及对照l
t ≤ ∏¯¶·¨µ¶²©¤§√ ±¨·¬·¬²∏¶¶«²²·¶qu × ¶¨·²±·«¨ ¦µ¬·¬¦¤¯ ¦²±¦¨±·µ¤·¬²± ²©Ž°. qk©µ²° ¯¨ ©··²µ¬ª«·s ox o¤±§xs °ªrl qv • ²²·¬±ª²©·«¨ ·µ¤±¶2
ª¨ ±¬·¬¦¶«²²·¶¦∏¯·∏µ¨§²±·«¨ ° §¨¬∏° ¦²±·¤¬±¬±ª Ž°. kµ¬ª«·l o∏±·µ¤±¶ª¨ ±¬·¬¦¶«²²·¶º¬·«²∏·µ²²·¬±ªk¯ ©¨·l qw ×µ¤±¶ª¨ ±¬·¬¦³¯¤±·¶ªµ²º±¬±
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