全 文 ：第 51 卷 第 12 期
2 0 1 5 年 12 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 51，No. 12
Dec．，2 0 1 5
doi:10．11707 / j．1001-7488．20151206
收稿日期: 2014 － 12 － 29; 修回日期: 2015 － 05 － 21。
基金项目: 国家高技术研究发展计划“863 计划”项目(2013AA102703) ; 国家自然科学基金项目(31370663)。
* 杨敏生为通讯作者。
转双抗虫基因欧美杨 107 杨中外源基因的表达*
张益文 任亚超 刘娇娇 梁海永 杨敏生
(河北农业大学林学院 河北省林木种质资源与森林保护重点实验室 保定 071000)
摘 要: 【目的】鉴定并分析转双抗虫基因(BtCry1Ac 和 API 基因)欧美杨 107 杨(简称: 转基因 107 杨)中外
源基因的表达情况，并且筛选出对鳞翅目害虫美国白蛾和杨扇舟蛾具有高抗虫性的转基因 107 杨株系。【方法】
以 10 个转基因 107 杨株系 2 年生田间苗为试验材料，未转基因 107 杨为对照( CK)，进行外源基因表达测定，包
括 PCＲ 检测、绝对荧光定量 PCＲ 检测和毒蛋白检测以及鳞翅目害虫抗虫性对比试验。【结果】PCＲ 检测结果表
明，10 个转基因株系均检测到外源基因 BtCry1Ac 和 API，而对照未检测到，证明 BtCry1Ac 和 API 基因已稳定插入
转基因植株基因组中。荧光定量 PCＲ 检测表明，8 月份 PB1，PB2，PB6，PB9 和 PB10 这 5 个株系 BtCry1Ac 基因的
转录丰度较高，为 1. 72 × 108 ～ 7. 91 × 109，PB1 最高; PB3，PB7 和 PB8 次之，为 1. 03 × 107 ～ 2. 35 × 107 ; PB4 和
PB5 与对照一样未检测到 BtCry1Ac 基因的转录表达。ELISA 毒蛋白检测表明，Cry1Ac 毒蛋白的表达量与转录丰
度大小变化趋势一致，PB1 最高，为 665. 11 ng·g － 1，PB4 和 PB5 与对照一样未检测到毒蛋白。室内饲虫试验证
明，转基因 107 杨对美国白蛾幼虫的杀虫效果高于杨扇舟蛾幼虫。8 个表达毒蛋白的转基因株系对 1 ～ 6 龄美国
白蛾幼虫的致死率均为 100%，但致死时间存在一定差异，PB1 和 PB2 对各龄幼虫的致死时间均较短; PB1，PB2，
PB6，PB9 和 PB10 对 1 ～ 4 龄杨扇舟蛾幼虫的致死率均为 100%，其中 PB1 和 PB2 的致死时间较短，PB3，PB7 和
PB8 对 1 ～ 2 龄杨扇舟蛾幼虫的致死率为 100%，对 3 龄和 4 龄的致死率最高为 22. 22%。综合抗虫对比试验结
果，可以将 8 个转基因株系划分为 2 个抗性水平: PB1，PB2，PB6，PB9 和 PB10 为高抗株系，对美国白蛾和杨扇舟
蛾均表现高抗性; PB3，PB7 和 PB8 为中抗株系，对杨扇舟蛾表现出中等抗性，但对美国白蛾表现出高抗性。【结
论】通过对转基因 107 杨进行一系列分子检测及室内抗虫对比试验，证明外源基因已成功导入杨树基因组并稳
定存在，并且有 8 个株系高效表达; 抗虫试验证明转基因 107 杨对美国白蛾和杨扇舟蛾具有明显的抗性，筛选出
的 5 个株系对 2 种害虫都具有高抗性，另外 3 个株系 PB3，PB7 和 PB8 对美国白蛾具有很高的抗性，而对杨扇舟
蛾则表现出中低抗性。
关键词: 双抗虫基因; 欧美杨 107 杨; 外源基因表达; Bt 毒蛋白; 抗虫性
中图分类号: S718. 46; S722. 3 + 6 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2015)12 － 0045 － 08
Exogenous Gene Expression on Transgenic Populus × euramericana
cv． ‘74 /76’Carrying Bivalent Insect-Ｒesistant Genes
Zhang Yiwen Ｒen Yachao Liu Jiaojiao Liang Haiyong Yang Minsheng
(Key Laboratory of Germplasm Ｒesources of Forest Trees and Forests Protection of Hebei
College of Forestry，Agricultural University of Hebei Baoding 071000)
Abstract: 【Objective】In order to identify and analyze the expression of exogenous genes in transgenic Populus ×
euramericana cv． ‘74 /76’ carrying bivalent insect-resistant genes BtCry1Ac and API ( Abbreviation: Transgenic 107
poplar)，and to select transgenic 107 poplar lines with high resistance to Lepidoptera pests Hlyphantria cunea and Clostera
anachoreta． 【Method】Two-year-old field seedlings of ten transgenic 107 poplar lines were selected as materials and non-
transgenic 107 poplar as control． Detections of exogenous gene expression were conducted，including PCＲ detection，
absolute fluorescence quantitative PCＲ，toxin detection and comparative studies on insect resistance of Lepidoptera pests．
【Ｒesult】PCＲ detection showed that exogenous genes BtCry1Ac and API existed in the ten transgenic lines，but not in the
CK，indicating that BtCry1Ac and API were steadily inserted into transgenic plant genome． The fluorescence quantitative
PCＲ showed transcription abundance of BtCry1Ac in five lines PB1，PB2，PB6，PB9，and PB10 were higher，ranging
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from 1. 72 × 108 to 7. 91 × 109，PB1 was the highest; and followed by PB3，PB7，and PB8，ranging from 1. 03 × 107 to
2. 35 × 107 ; PB4，PB5，and CK detected no transcriptional expression of BtCry1Ac． ELISA toxin detection showed the
content of Cry1Ac toxin expression was in accordance with variation tendency of transcription abundance． PB1 was the
highest，with 665. 11 ng·g － 1，PB4，PB5，and CK detected no toxin． The indoor insect feeding test showed that the
insecticidal effect of transgenic 107 poplar on H． cunea larvae was higher than that of C． anachoreta． Eight transgenic
lines expressed toxin had high resistance to L1 － L6 (L1 － L6 represent 1 to 6 instars)H． cunea larvae with a mortality of
100%，but there were differences on lethal time among these lines，the lethal time of PB1 and PB2 on every instars were
shorter ． PB1，PB2，PB6，PB9 and PB10 had a high resistance to L1 － L4 C． anachoreta larvae with a mortality of 100%，
the lethal time of PB1 and PB2 were shorter． The mortality of PB3，PB7，and PB8 on L1 － L2 C． anachoreta larvae was
100%，but the mortality of L3 － L4 C． anachoreta larvae was as high as 22. 22% ． The 8 transgenic lines were divided into
two resistance levels: PB1，PB2，PB6，PB9 and PB10 were high resistant lines，which showed high insect resistance to
H． cunea and C． anachoreta; PB3，PB7，and PB8 were moderate resistant lines，which showed moderate insect resistance
to C． anachoreta，but high resistance to H． cunea． 【Conclusion】 A series of molecular detections and indoor insect
feeding tests were conducted on transgenic 107 poplar in this study． The results indicated that exogenous genes were
steadily inserted into the poplar genome，and the 8 lines were of high-efficiency expression． Insect resistance test showed
that transgenic 107 poplar had high resistance to H． cunea and C． anachoreta． Five lines were selected and showed high
resistance to two pests，the other three lines PB3，PB7，and PB8 showed high resistance to H． cunea，but low or moderate
resistance to C． anachoreta．
Key words: bivalent insect-resistant genes; Populus × euramericana cv． ‘74 /76’; exogenous gene expression; Bt
toxin; insect resistance
杨树是一个种类繁多、分布广泛的重要经济树
种和工业用材树种。由于其人工林林分结构单一，
极易受到虫害的影响。面对虫害带来的巨大损失以
及难以用常规方法培育杨树抗虫新品种，利用基因
工程培育抗虫新品种成为现在研究的热点。目前已
有许多研究将抗虫基因导入杨树中，经抗虫性试验，
筛选出抗虫植株。Tian 等(2000)将部分改造后的
苏云金芽孢杆菌 ( Bacillus thuringiensis，Bt)杀虫蛋
白基因和慈菇蛋白酶抑制剂(API)基因构建于一个
植物表达载体转化 741 杨［Populus alba × ( P．
davidiana + P． simonii) × P． tomentosa］，对筛选的
再生植株进行分子生物学检测及抗虫试验，最后获
得对杨扇舟蛾(Clostera anachoreta)具有高抗虫性的
转基因 741 杨，这是国内外首次报道的转双抗虫基
因的抗虫 741 杨。姜静等(2004)将蜘蛛杀虫肽与
Bt 基因 C 肽序列的融合基因导入小黑杨 ( P． ×
xiaohei)，经 Southern 及抗虫试验检测，筛选出具有
显著抗虫效果的抗性株系。张冰玉等 ( 2005 )将
BtCry3A 基因与水稻(Oryza sativa)巯基蛋白酶抑制
剂基因 转化 到 银 腺 杂 种 杨 ( Populus alba × P．
glandulosa)中，获得的转基因植株经室内抗虫试验
测定初步表明，有 2 个转基因株系对光肩星天牛
(Anoplophora glabripennis)幼虫具有毒杀作用，4 个
株系对光肩星天牛幼虫有不同程度的抑制作用，但
其余的转基因株系对幼虫的毒杀作用不明显。范海
娟等(2006)利用转蜘蛛杀虫肽与 Bt 毒蛋白 C 肽融
合蛋白基因小黑杨对杨扇舟蛾进行抗性试验，结果
表明转基因小黑杨能够明显延长杨扇舟蛾幼虫的发
育历期，降低化蛹率及蛹质量。甄志先等(2007)对
转抗虫基因(BtCry3A)741 杨对鞘翅目(Coleoptera)
昆虫的抗虫性进行了研究，结果表明转基因株系对
桑天牛(Apriona germari)幼虫的致死率很低，但对幼
虫的发育具有明显的抑制作用。康薇 (2013)通过
室外人工接虫，研究表达 Cry1A 杀虫蛋白的中嘉 8
号杨树(Populus deltoides‘I-63 × I-69’)对杨扇舟蛾
的田间抗性和对非靶标生物的影响，结果表明转基
因杨树对杨扇舟蛾幼虫具有明显的抗性，而对非靶
标生物无明显的毒害作用。多种研究表明转抗虫基
因杨树对鳞翅目(Lepidoptera)或鞘翅目害虫的抗虫
性得到一定提高。
本研究将 BtCry1Ac 基因与慈菇蛋白酶抑制剂
基因(API)构建的双抗虫基因表达载体，通过根癌
农杆菌( Agrobacterium tumefaciens)介导法转化欧美
杨优良品种 107 杨 ( Populus × euramericana cv．
‘74 /76’)，获得一批转基因株系，对其进行 PCＲ 鉴
定，并在 DNA 水平、转录水平和翻译水平上进行分
子检测，确定外源基因是否已整合至植物基因组中，
并对转基因株系进行饲虫试验，筛选出高抗株系。
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第 12 期 张益文等: 转双抗虫基因欧美杨 107 杨中外源基因的表达
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 植物材料 参试植物材料为转双抗虫基因
的欧美杨 107 杨无性系 PB 系列，是将部分改造的
Bt 基因 Cry1Ac 基因与慈姑蛋白酶抑制剂 API 基因
构建成双抗虫基因表达载体，通过农杆菌介导法转
化 107 杨叶片，共获得 10 个转基因株系，未转基因
107 杨为对照，均为 2 年生大田苗。
1. 1. 2 测试昆虫 测试昆虫为鳞翅目的美国白蛾
(Hlyphantria cunea)幼虫和杨扇舟蛾幼虫。
美国白蛾又名美国灯蛾、秋幕毛虫、秋幕蛾，属
鳞翅目，灯蛾科(Arctiidae)。它食性杂，繁殖量大，
适应性强，传播途径广，是危害严重的世界性检疫害
虫。共 7 个龄期，进入 4 龄以后取食量增大。
杨扇舟蛾属鳞翅目，舟蛾科(Notodontidae)，别
名杨树天社蛾。共 5 个龄期，3 龄前集中缀叶成苞，
在内咀食叶肉，3 龄后分散取食全叶，发生严重时可
将叶片吃光。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 转基因植株的 PCＲ 检测 2013 年 5 月，采
取大田中各转基因株系和对照的叶片，采用 CTAB
法提取叶片的 DNA。并选用 Cry1Ac 和 API 基因的
特异性引物进行 PCＲ 检测。以含目的基因的质粒
为阳性对照，未转基因 107 杨为阴性对照。
Cry1Ac 基因的引物为 F1 /Ｒ1，片段大小为 546
bp。 F1: 5-ATGGATAACAATCCGAACATCA-3;
Ｒ1: 5-C CACCTTTGTCCAAACACTGAA-3。
API 基因的引物为 F2 /Ｒ2，片段大小为 500 bp。
F2: 5-GCTGAATTCGACCATGGCGGCCTCCAACG
CT-3; Ｒ2: 5-CGATGCCCAGCAAGGTTTTT-3。
1. 2. 2 转基因植株的绝对荧光定量 PCＲ 检测
2013 年 8 月，采集各转基因株系和对照大田苗叶片
(3 次重复，每次称量 0. 1 g 叶片组织)，采用康为世
纪超纯 ＲNA 提取试剂盒提取总 ＲNA，采用北京艾
德莱公司的 TUＲEscript 1st Strand cDNA Synthesis
Kit 进行 cDNA 第 1 链的反转录(步骤参照说明书)。
根据 Cry1Ac 基因的全序列信息设计绝对荧光定量
PCＲ 引物( F3: 5-GAATTTTTGGTCCCTCTCAAT-3;
Ｒ3: 5-AGGATCTGCTTCCCACTCTCT-3)，退火温度
为 55 ℃，采用 2 × Sybr Green qPCＲ Mix 进行绝对
荧光定量 PCＲ(体系参照说明书)。
1. 2. 3 转基因植株的 Bt 毒蛋白检测 2013 年 8
月，采集 10 个转基因株系和对照大田苗自上而下的
第 3 片叶片(每个株系 3 次重复)，选用 Agdia 公司
的 Bt-Cry1Ac ELISA 试剂盒进行 Bt 毒蛋白检测(方
法参照说明书)。
1. 2. 4 转基因植株的抗虫性检测 参试昆虫为鳞
翅目的美国白蛾幼虫和杨扇舟蛾幼虫。为防止有寄
生蜂致死现象，参试昆虫均为在室外采集 (美国白
蛾成虫于 2013 年 6 月底在河北农业大学苗圃捕捉，
杨扇舟蛾于 2013 年 5 月底在保定市南二环路边采
集到 5 龄幼虫)。收集的 2 种幼虫均在室内饲养，经
化蛹、羽化、交配、产卵等阶段后，用卵孵化出的下一
代幼虫用于饲虫试验。由于试验内容为不同龄期的
抗虫性比较，未用于转基因株系饲喂的幼虫，继续用
非转基因的 107 杨叶片饲养至不同龄期。
采集有毒蛋白表达的 8 个转基因株系及对照叶
片，分别用 1 ～ 6 龄美国白蛾幼虫进行饲虫试验。试
验设置 3 个重复，1 ～ 3 龄每个重复为 30 头，4 龄以
后每个重复 15 头左右。1 龄幼虫为从卵孵化出且
未饲喂过叶片的幼虫，3 ～ 6 龄幼虫为上一龄刚刚脱
皮完成的幼虫。每天根据取食情况更换叶片，观察
并记录死亡情况。
选取相同部位的 8 个转基因株系及对照叶片，
分别用 1 ～ 4 龄杨扇舟蛾幼虫进行饲虫试验。1 ～ 2
龄幼虫每次重复设置 30 头，设 3 个重复; 3 ～ 4 龄幼
虫每次设置 5 头幼虫，设 4 个重复。每天根据取食
情况更换叶片，观察各试验中幼虫的发育情况，记录
幼虫的死亡情况。
试验结束后，计算幼虫的逐日死亡率、累积死亡
率、平均死亡率等。逐日死亡率 =每天死亡个数 /初
期饲养总数 × 100% ; 累积死亡率 = 饲养末期的死
亡总数 /初期饲养总数 × 100% ; 平均死亡率 =各个
重复的累积死亡率之和 /重复次数 × 100%。
1. 2. 5 数据处理 整理分子生物学检测及抗虫性
试验数据，用 Excel 和 DPS 进行统计检验及图表
分析。
2 结果与分析
2. 1 转基因植株的 PCＲ 检测
对 Cry1Ac 基因进行 PCＲ 检测，琼脂糖电泳分
析见图 1，10 个转基因株系与阳性质粒 pBtiA 均扩
增出大小为 546 bp 的条带，未转基因 107 杨未检
测到。
对 API 基因进行 PCＲ 检测，电泳分析如图 2，10
个转基因株系与阳性对照均扩增出大小约 500 bp
的条带，而未转基因 107 杨未检测到。
2. 2 转基因植株的荧光定量 PCＲ 检测
Cry1Ac 基因的绝对荧光定量 PCＲ 分析结果见
74
林 业 科 学 51 卷
图 1 转基因株系的 Cry1Ac 基因检测
Fig． 1 PCＲ detection of Cry1Ac of transgenic plants
M: DL2000 DNA marker; CK + : 质粒 pBtiA; CK － : 未转基因植
株; 1 － 10: PB 系列的 10 个系号。下同。
M: DL2000 DNA marker; CK + : pBtiA plasmid; CK － :
Untransformed plant; 1 － 10: The PB lines． The same below．
图 2 转基因株系的 API 基因检测
Fig． 2 PCＲ detection of API of transgenic plants
M:(自上而下 From up to down) 2 000，1 000，750，500，250，100 bp．
表 1，不同转基因株系 Cry1Ac 的转录丰度存在差异。
PB1，PB2，PB6，PB9 和 PB10 的转录丰度较高，为
1. 72 × 108 ～ 7. 91 × 109，PB3，PB7 和 PB8 次之，PB4
和 PB5 没有检测到转录表达。
表 1 荧光定量 PCＲ 检测 Cry1Ac 基因的转录丰度①
Tab． 1 Transcription abundance of Cry1Ac
detected by FQ-PCＲ
株系
Lines
转录丰度
Transcription abundance
PB1 7. 91 × 109 ± 6. 09 × 108 a
PB2 1. 72 × 108 ± 1. 08 × 107 c
PB3 2. 35 × 107 ± 3. 42 × 106 c
PB4 0 d
PB5 0 d
PB6 2. 04 × 108 ± 3. 86 × 107 c
PB7 1. 03 × 107 ± 1. 20 × 106 c
PB8 2. 31 × 107 ± 2. 36 × 106 c
PB9 8. 12 × 108 ± 8. 15 × 107 b
PB10 7. 92 × 108 ± 3. 73 × 107 b
CK 0 d
①在同一列相同的字母表示在 0. 05 水平没有显著差异(费舍尔
的 LSD 多重比较)。下同。Within each column，means with the same
letter are not significantly different (P = 0. 05) (ANOVA FISHEＲ’s LSD
test) ． The same below．
2. 3 转基因植株的 Bt 毒蛋白检测
Cry1Ac 毒蛋白检测结果见表 2，8 月份，PB1，
PB2，PB6，PB9 和 PB10 5 个株系的毒蛋白含量显著
高于其他株系，为 110. 56 ～ 665. 11 ng·g － 1，其中
PB1 最高; PB3，PB7 和 PB8 3 个株系的毒蛋白含量
较低，为 16. 38 ～ 53. 85 ng·g － 1; PB4，PB5 和 CK 均
未检测到毒蛋白。
表 2 8 月份各转基因株系的 Cry1Ac 毒蛋白含量
Tab． 2 Cry1Ac toxic protein content of various
transgenic lines in August
株系
Lines
毒蛋白含量
Toxic protein content / ( ng·g － 1 )
PB1 665. 11 ± 20． 38 a
PB2 472. 45 ± 17． 2 b
PB3 53. 85 ± 5． 07 e
PB6 261. 20 ± 22． 22 c
PB7 16. 38 ± 1． 03 f
PB8 17. 81 ± 3． 08 f
PB9 110. 56 ± 3． 08 d
PB10 112. 11 ± 3． 48 d
CK 0 f
2. 4 转基因植株的抗虫性检测
2. 4. 1 转基因株系对美国白蛾的致死效应对比
用 8 个有毒蛋白表达的转基因株系和对照的叶片对
美国白蛾的 1 ～ 6 龄幼虫进行室内饲喂试验，不同株
系对不同龄期幼虫的累积致死率见图 3 和图 4，饲
喂一定天数后各转基因株系对各龄期幼虫的致死率
均可达到 100%，随着龄期的增长，幼虫的死亡时间
逐渐后延。1 龄幼虫在取食的第 2 天，转基因株系
的幼虫致死率明显高于对照，最高致死率为 100%，
取食第 3 天时，8 个转基因株系的致死率均达到
100% ; 2 龄幼虫和 3 龄幼虫在取食的第 2 天和第 3
天死亡率较高，到第 4 天时取食 8 个株系的死亡率
均达到 100% ; 4 龄幼虫在取食的第 5 天死亡数量
最多，到第 7 天时取食 8 个株系的幼虫全部死亡; 5
龄幼虫在第 6 天和第 7 天的死亡数量最多，到第 9
天时取食 8 个株系的幼虫死亡率均为 100% ; 6 龄
幼虫则集中死亡于第 7 ～ 9 天，部分株系的致死率于
第 9 天达到 100%，其余株系则在第 11 ～ 13 天达到
100%。对照 107 杨叶片饲喂的各龄美国白蛾幼虫
死亡率均低于 5%。
8 个转基因株系对美国白蛾幼虫抗虫性上差异
不明显，对各龄幼虫的致死率均能达到 100%，但致
死时间存在一定差异，PB1 和 PB2 对各龄幼虫的致
死时间均较短，其余株系对高龄幼虫的致死相对
缓慢。
2. 4. 2 转基因株系对杨扇舟蛾幼虫的致死效应分
析 用 8 个有毒蛋白表达的转基因株系和对照的叶
片对杨扇舟蛾 1 ～ 4 龄幼虫进行室内饲喂试验，不同
株系对不同龄期幼虫的累积致死率见图 5，饲喂一
定天数后部分株系对部分龄期幼虫的致死率可达
100%，随着龄期的增长，幼虫的死亡时间逐渐后延。
1 龄幼虫在取食的第 2 天，取食转基因株系的幼虫
死亡率高于对照，最高死亡率为 96. 67%，取食的第
84
第 12 期 张益文等: 转双抗虫基因欧美杨 107 杨中外源基因的表达
图 3 各转基因株系对不同龄期美国白蛾幼虫的累积致死率
Fig． 3 The cumulative mortality of every transgenic lines on H． cunea larvae in different instars
4 天时 8 个转基因株系的致死率达到 100% ; 2 龄幼
虫在取食的第 2 天死亡率明显低于 1 龄幼虫，到第
4 天时死亡率达到 60%以上，到第 12 天时 8 个株系
对幼虫的致死率达到 100% ; 3 龄幼虫在取食的前 4
天均未死亡，到第 8 天时部分株系的致死率达 60%
以上，PB3，PB7 和 PB8 的致死率较低，到第 16 天
时，部分株系的致死率达到 100%，而对 2 龄幼虫致
死率均为 100%的 PB3，PB7 和 PB8 这 3 个株系对 3
龄幼虫的致死率分别为 15%，5%和 15% ; 4 龄幼虫
在取食的第 6 天的死亡数量最多，到第 8 天时取食
部分株系的幼虫全部死亡，PB3，PB7 和 PB8 的致死
率较低，最高仅为 22. 22%。对照 107 杨叶片饲喂
的各龄杨扇舟蛾幼虫死亡率均低于 1. 11%。
8 个转基因株系对杨扇舟蛾幼虫抗虫性上存在
显著差异，各株系对 1 龄和 2 龄幼虫的致死率均达
到 100%，但致死时间存在一定差异，PB3，PB7 和
PB8 的致死时间相对缓慢;而只有部分株系对 3 龄
和 4 龄幼虫的致死率达到 100%，PB3，PB7 和 PB8
对高龄幼虫的致死率较低。
3 结论
本研究对转双抗虫基因欧美杨 107 杨 10 个株
系和对照进行外源基因表达检测和抗虫试验，鉴定
并筛选出对鳞翅目美国白蛾和杨扇舟蛾幼虫具有高
抗性的转基因株系。 PCＲ 检测表明外源基因
BtCry1Ac 和 API 均已稳定地插入杨树基因组中。绝
对荧光定量 PCＲ 检测表明，8 月份 PB1，PB2，PB6，
PB9 和 PB10 的转录丰度较高，PB3，PB7 和 PB8 次
之，PB4，PB5 与对照一样未检测到转录表达。
ELISA 毒蛋白检测表明，毒蛋白的表达量与转录丰
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林 业 科 学 51 卷
图 4 美国白蛾 2 龄和 4 龄幼虫取食 1 天后的叶片
Fig． 4 One-day-eating leaves by L2 and L4 H． cunea
CK-2: 2 龄幼虫取食 CK 叶片 1 天后的情况; PB1-2: 2 龄幼虫取
食 PB1 叶片 1 天后的情况; CK-4: 4 龄幼虫取食 CK 叶片 1 天后
的情况; PB1-4: 4 龄幼虫取食 PB1 叶片 1 天后的情况。
CK-2: One-day-eating leaf of CK by L2 H． cunea larvae; PB1-2:
One-day-eating leaf of PB1 by L2 H． cunea larvae; CK-4: One-day-
eating leaf of CK by L4 H． cunea larvae; PB1-4: One-day-eating leaf
of PB1 by L4 H． cunea larvae．
度大小一致。PB1，PB2，PB6，PB9 和 PB10 5 个株系
的毒蛋白含量较高; PB3，PB7 和 PB8 3 个株系的毒
蛋白含量较低; PB4，PB5 与对照一样未检测到毒蛋
白表达。室内饲虫试验表明转基因株系对美国白蛾
幼虫的杀虫效果高于杨扇舟蛾幼虫。8 个转基因株
系对 1 ～ 6 龄美国白蛾幼虫的致死率均为 100% ;
PB1，PB2，PB6，PB9 和 PB10 对 1 ～ 4 龄杨扇舟蛾幼
虫的致死率均为 100%，PB3，PB7 和 PB8 对 1 ～ 2 龄
杨扇舟蛾幼虫的致死率为 100%，对 3 龄和 4 龄的
致死率最高为 22. 22%。综合抗虫对比试验结果，
可以将 8 个转基因株系划分为 2 个抗性水平: PB1，
PB2，PB6，PB9 和 PB10 为高抗株系，对美国白蛾和
杨扇舟蛾均表现高抗; PB3，PB7 和 PB8 为中抗株
系，对杨扇舟蛾表现出中抗，但对美国白蛾表现出
高抗。
4 讨论
本研究利用转基因欧美杨 107 杨叶片对美国白
蛾和杨扇舟蛾进行饲虫试验结果表明，转双价基因
的 107 杨对 2 种害虫都具有较明显的抗性，筛选出
的 5 个高抗株系对 2 种害虫都具有高抗性，另外 3
个株系 PB3，PB7 和 PB8 对美国白蛾具有很高的抗
性，而对杨扇舟蛾则表现出中低抗性。有研究表明
转基因植株对 2 种害虫的抗虫性不同 (李立等，
2009; 王颖等，2007)。转基因三倍体毛白杨对杨
扇舟蛾幼虫的校正死亡率为 100%的 3 个株系对舞
毒蛾 ( Lymantria dispar ) 幼 虫 的 致 死 率 分 别 为
79. 1%，91. 6% 和 87. 5%，而对舞毒蛾幼虫校正死
亡率为 100% 的株系对杨扇舟蛾幼虫的致死率为
89. 8% (李立等，2009)。
本研究中转基因 107 杨与转入 BtCry1Ac 和 API
基因的 741 杨相比，部分转基因 107 杨对美国白蛾
1 龄和 4 龄幼虫的死亡率达到 100%的致死时间较
转基因 741 杨 pB29 短(王桂英等，2012); 转基因
107 杨对杨扇舟蛾 1 龄幼虫的致死率均达到 100%，
而转基因 741 杨最高为 91. 2% (田颖川等，2000)，
对 3、4 龄高龄幼虫的致死率，转基因 107 杨部分株
系达到 100%，而转基因 741 杨最高仅为 65. 3%
(Yang et al．，2003)。由此可见，在抗虫性方面，转
基因 107 杨较转基因 741 杨高。在转基因杨树方
面，因为没有单转 API 基因的欧美杨 107 杨来作对
照，所以本试验无法与其作比较。但 Guo 等(2003)
研究发现，转 BtCry1Ac 基因和 API 基因的双价植株
比转单一的 BtCry1Ac 基因的植株在抗虫性方面具
有明显的提高。
许多研究表明，外源基因整合到植物的基因组
后，其表达和稳定性与转基因的失活或沉默有关
( Stam et al．，1997; Kilby et al．，1992; Wu et al．，
2002)。转基因失活的机制有很多种，如 DNA 甲基
化、共抑制等 ( Wang et al．，2008; Meyer et al．，
1994)。转基因沉默是指外源基因存在于生物体
内，并未丢失或损伤，但该基因不表达或表达量极低
的现象。本研究中 PB4 和 PB5 在毒蛋白检测中未
检测到表达量，在荧光定量 PCＲ 检测中也未检测到
BtCry1Ac 基因的转录，这可能是由于 BtCry1Ac 基因
的表达量较低或该基因在转化后发生失活或者转录
后水平的基因沉默。中抗株系的 PB3，PB7 和 PB8
在毒蛋白和荧光定量 PCＲ 检测过程中，均检测到表
达量，但表达量不高，这也可能与 BtCry1Ac 基因在
转化过程中插入在基因组 DNA 的位置有关。因此，
抗性不同的真正原因还需进一步研究。
目前转基因作物商品化的种类比较多，而转基
因林木种类较少，特别是对转基因成年树木外源基
因表达研究较少。由于林木生长周期长，遗传组成
复杂，杂合度高且树体高大，外源基因的表达是否受
到影响，以及在时间和空间上的表达差异，需要进行
连续监测才可以获得。牛小云等 ( 2011 ) 对转
05
第 12 期 张益文等: 转双抗虫基因欧美杨 107 杨中外源基因的表达
图 5 各转基因株系对不同龄期杨扇舟蛾幼虫的累积致死率
Fig． 5 The cumulative mortality of every transgenic lines on C． anachoreta larvae in different instars
BtCry3A 抗虫基因 741 杨毒蛋白进行了时空表达研
究，结果表明木质部中毒蛋白含量在时间上呈现了
一定的规律性，而叶部和根中毒蛋白表达规律不明
显; 在空间上叶部和根部毒蛋白表达量呈现较强的
规律性，叶部毒蛋白表达表现为从树冠上部到下部
依次递减的趋势。胡建军等 (2007)连续多年对转
Bt 基因欧洲黑杨(Populus nigra)进行抗虫性调查，
结果发现 7 年生的转 Bt 基因杨树抗虫效果明显，Bt
基因能够稳定表达，未发现害虫产生耐受性。外源
基因在时间和空间上的表达差异将是今后转基因林
木研究的重点。
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(责任编辑 徐 红)
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